房 曉 王 健 張向明 鮑 一 王軍凱

前列腺癌是男性生殖系統(tǒng)最常見的惡性腫瘤，據(jù)報(bào)道其發(fā)病率僅次于肺癌，居男性癌癥病死率的第2位，近年來前列腺癌的發(fā)病率呈逐年增高趨勢。早中期前列腺癌患者預(yù)后較好，5年生存率可達(dá)到95%以上，中晚期前列腺、轉(zhuǎn)移性前列腺癌患者的臨床預(yù)后最差，5年生存率不超過30%[1]，故前列腺癌的早期診斷格外重要。需要尋找新型有效的診斷前列腺癌和判斷其預(yù)后的生物學(xué)標(biāo)志物，可預(yù)防無癥狀前列腺癌的過度治療，以及確保惡性進(jìn)行性腫瘤在早期檢測階段能得到及時(shí)治療。

NIN1結(jié)合蛋白1(NOB1)由NOB1基因編碼，是26S蛋白酶體一個(gè)亞基,在蛋白降解途徑中發(fā)揮關(guān)鍵作用。NOB1蛋白包括1個(gè)PIN區(qū)域和1個(gè)碳端鋅帶域，具有轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子的作用。多數(shù)研究報(bào)道，NOB1在腎癌、結(jié)直腸癌、非小細(xì)胞肺癌、骨肉瘤、口腔鱗狀細(xì)胞癌等腫瘤組織中高表達(dá)[2-7]；NOB1可能參與多種腫瘤的發(fā)生，也可能是致癌因素[8-10]。本研究團(tuán)隊(duì)的前期研究[11]中，通過Western印跡法和免疫組織化學(xué)技術(shù)證實(shí)NOB1在前列腺癌組織中高表達(dá)；預(yù)后分析、繪制生存曲線等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析結(jié)果顯示,高表達(dá)NOB1的前列腺癌患者預(yù)后較差，表明NOB1在前列腺癌的發(fā)生和發(fā)展過程中起作用，可能是潛在的癌基因。目前，NOB1對(duì)前列腺癌生物學(xué)特性的影響及其作用機(jī)制尚未明確。本研究通過構(gòu)建NOB1敲低的前列腺癌細(xì)胞系，觀察前列腺癌細(xì)胞的增殖、周期和侵襲能力，初步探討NOB1對(duì)前列腺癌細(xì)胞生物學(xué)特性的作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料 前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145、22RV1和LNCaP均購自中科院上海細(xì)胞庫，細(xì)胞培養(yǎng)液RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Corning公司，F(xiàn)BS購自美國Invitrogen公司，1%青霉素、1%鏈霉素試劑購自上海博光生物公司，蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑購自美國ApexBio公司。實(shí)時(shí)定量PCR所用反轉(zhuǎn)錄酶、SYBR酶購自日本TaKaRa公司，引物由上海生工生物工程公司合成。NOB1、β-actin、人Src原癌基因(c-Src)、c-Src磷酸化(p-c-Src)抗體購自美國Abcam公司。MTT購自美國Sigma公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng) 將常見的前列腺癌細(xì)胞22RV1、PC-3、LNCaP和DU145培養(yǎng)于含10% FBS、1%青霉素、1%鏈霉素的RPMI-1640培養(yǎng)液中，在37 ℃、體積分?jǐn)?shù)為0.05 CO2孵育箱中培養(yǎng)，每2 d更換1次培養(yǎng)基，取對(duì)數(shù)生長期細(xì)胞用于實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染和篩選 轉(zhuǎn)染慢病毒由上海漢恒生物公司提供，包括對(duì)照組病毒(Lv-shCtr1)和NOB1干擾病毒(Lv-shNOB1)。將細(xì)胞接種于6孔板內(nèi)，待其貼壁后，換液為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，根據(jù)感染復(fù)數(shù)計(jì)算的量,分別加入適量空白對(duì)照慢病毒(Lv-shCtrl,陰性對(duì)照組)和NOB1干擾慢病毒(Lv-shNOB1，敲低組)，混勻后置入37 ℃恒溫孵箱培養(yǎng)48 h。

1.2.3 實(shí)時(shí)定量PCR檢測 采用TRIzol法提取細(xì)胞總RNA，PC-3、DU145、22RV1、LNCaP 4種細(xì)胞取等量RNA按反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)DNA。反應(yīng)條件：預(yù)變性95 ℃ 60 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 30 s、72 ℃ 30 s并采集熒光信號(hào)，進(jìn)行40個(gè)循環(huán)。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。所用引物序列：NOB1正向引物5’-GAC ATA GGA GCC GGC GCA A-3’，反向引物5’-CGT ATT CCG GTA AGG GCT CC-3’。同法檢測PC-3和DU145細(xì)胞空白對(duì)照組(不轉(zhuǎn)染病毒)、陰性對(duì)照組、敲低組中NOB1的表達(dá)量。

1.2.4 Western印跡雜交 于放射免疫沉淀測定裂解液(RIPA裂解液)中加入蛋白酶抑制劑和磷酸酶抑制劑，置于冰上裂解細(xì)胞30 min，4 ℃、12 000×g離心10 min。采用二辛可寧酸(BCA)法測定蛋白質(zhì)濃度，取等量總蛋白與5×十二烷基硫酸鈉(SDS)上樣緩沖液混合，100 ℃變性10 min。SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜至硝酸纖維素膜上，以5%脫脂奶粉室溫下封閉2 h，磷酸鹽吐溫緩沖液(PBST)洗膜3次,在4 ℃搖床上孵育一抗過夜。PBST洗膜3次，將相應(yīng)二抗于室溫孵育2 h，應(yīng)用Odessey紅外熒光掃描成像系統(tǒng)檢測蛋白質(zhì)熒光強(qiáng)度。

1.2.5 MTT法檢測敲低NOB1后前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145的增殖活性 采用MTT法檢測敲低NOB1對(duì)前列腺癌PC-3和DU145細(xì)胞生成的影響。取對(duì)數(shù)生長期的細(xì)胞，經(jīng)胰蛋白酶消化后于含血清的完全培養(yǎng)基中終止消化，以1 500×g離心3 min，去上清液，制成細(xì)胞懸液。細(xì)胞計(jì)數(shù)后，在96孔板中分為空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組、敲低組3組，分別培養(yǎng)5 d，每天設(shè)置5個(gè)復(fù)孔。每天采用MTT法檢測細(xì)胞活性：加入MTT母液，反應(yīng)2 h后，加入MTT B液終止反應(yīng)，應(yīng)用酶標(biāo)儀檢測波長為595 nm 處的吸光度(A595)值。

1.2.6 流式細(xì)胞儀檢測敲低NOB1后前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145的細(xì)胞周期 將3組細(xì)胞用不含EDTA的胰酶消化后收集，冰冷PBS清洗2次，預(yù)冷70%乙醇固定，于4 ℃過夜；離心去除乙醇，PBS清洗3次，碘化丙啶(PI)染色，應(yīng)用流式細(xì)胞儀檢測各組細(xì)胞DNA含量，并計(jì)算細(xì)胞周期。

1.2.7 Transwell實(shí)驗(yàn)檢測敲低NOB1后前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145細(xì)胞的侵襲能力 取上述3組細(xì)胞，使用無血清培養(yǎng)基在預(yù)先鋪有基質(zhì)膠的Transwell小室的上室中培養(yǎng)，下室中加入含10% FBS的RPMI-1640培養(yǎng)液，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，0.5%結(jié)晶紫染色，于倒置顯微鏡下隨機(jī)選取6個(gè)視野攝片、計(jì)數(shù)，計(jì)算每個(gè)視野中的細(xì)胞平均數(shù)。

2 結(jié) 果

2.1 4種常見的前列腺癌細(xì)胞中NOB1的表達(dá)量比較 惡性程度較高的前列腺癌細(xì)胞22RV1、PC-3、DU145的NOB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.157、1.576±0.150、2.404±0.513，均顯著高于惡性程度較低的前列腺癌細(xì)胞LNCaP的0.559±0.081 (P值均<0.05)。Western印跡法檢測前列腺癌細(xì)胞22RV1、PC-3、LNCaP、DU145的NOB1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、3.39±1.05、0.33±0.07、1.89±0.34，22RV1、PC-3、DU145細(xì)胞的NOB1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量均顯著低于LNCaP細(xì)胞(P值均<0.05)。見圖1。

1 22RV1細(xì)胞 2 PC-3細(xì)胞 3 LNCaP細(xì)胞 4 DU145細(xì)胞

2.2 慢病毒轉(zhuǎn)染PC-3和DU145并驗(yàn)證敲低效率 為進(jìn)一步研究NOB1基因在前列腺癌細(xì)胞中的生物學(xué)功能，本實(shí)驗(yàn)選擇NOB1表達(dá)量較高的前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU145構(gòu)建NOB1基因的shRNA的干擾載體。PC-3細(xì)胞的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和敲低組的NOB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.178、0.864±0.065、0.489±0.074，敲低組顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P值均<0.05)；DU145細(xì)胞的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和敲低組NOB1 mRNA相對(duì)表達(dá)量分別為1.000±0.248、1.036±0.155、0.101±0.016，敲低組顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P值均<0.05)，表明構(gòu)建慢病毒介導(dǎo)NOB1穩(wěn)定敲低前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU145。PC-3細(xì)胞的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和敲低組NOB1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00，1.12±0.45、0.34±0.07；DU145細(xì)胞的空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和敲低組NOB1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量分別為1.00±0.00、0.96±0.13、0.13±0.04，兩種細(xì)胞敲低組的NOB1蛋白質(zhì)相對(duì)表達(dá)量均顯著低于空白對(duì)照組和陰性對(duì)照組(P值均<0.05)，見圖2。上述實(shí)驗(yàn)表明成功建立了穩(wěn)定敲低NOB1的前列腺癌細(xì)胞株。

A PC-3細(xì)胞 B DU145細(xì)胞 1 空白對(duì)照組 2 陰性對(duì)照組 3 敲低組

2.3 敲低NOB1后前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145細(xì)胞增殖活性變化 實(shí)驗(yàn)第3、4、5天，PC-3、DU145細(xì)胞敲低組A595值均顯著低于各自陰性對(duì)照組同時(shí)間(P值均<0.05)，細(xì)胞增殖率被抑制70%以上。見表1。

組別時(shí)間PC-3DU145空白對(duì)照第1天0.133±0.0210.111±0.010第2天0.258±0.0170.171±0.021第3天0.641±0.0490.266±0.014第4天0.961±0.0740.849±0.004第5天1.216±0.1110.968±0.018陰性對(duì)照第1天0.141±0.0140.114±0.011第2天0.261±0.0070.171±0.013第3天0.721±0.048①0.274±0.014①第4天0.915±0.088①0.832±0.434①第5天1.117±0.094①1.105±0.061①敲低第1天0.118±0.0150.108±0.007第2天0.202±0.0300.140±0.001第3天0.444±0.0410.183±0.018第4天0.658±0.0600.549±0.016第5天0.784±0.0680.662±0.047

與同細(xì)胞敲低組同時(shí)間比較：①P<0.01

2.4 敲低NOB1后前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145細(xì)胞周期變化 PC-3和DU145細(xì)胞陰性對(duì)照組的G0/G1期細(xì)胞百分比均顯著低于敲低組(P值均<0.05)，S期細(xì)胞百分比均顯著高于敲低組(P值均<0.05)。見表2。

組別細(xì)胞周期PC-3DU145空白對(duì)照G0/G161.05±1.1747.11±1.90S21.66±1.0735.31±1.69G2/M18.81±0.3219.14±2.22陰性對(duì)照G0/G161.30±0.99①43.87±1.23①S20.68±1.09①36.12±1.33①G2/M18.87±0.6021.25±3.15敲低G0/G166.26±1.7951.14±1.49S17.50±0.6132.77±1.07G2/M17.86±1.4218.05±0.67

與同細(xì)胞敲低組同細(xì)胞周期比較：①P<0.05

2.5 敲低NOB1后前列腺癌細(xì)胞PC-3和DU145的侵襲能力變化 PC-3細(xì)胞空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和敲低組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(634±41)、(630±48)、(113±17)個(gè)/高倍視野，DU145細(xì)胞空白對(duì)照組、陰性對(duì)照組和敲低組遷移細(xì)胞數(shù)分別為(350±23)、(351±12)、(85±10)個(gè)/高倍視野，兩種細(xì)胞敲低組的遷移細(xì)胞數(shù)均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組(P值均<0.01)。見圖3。

A PC-3細(xì)胞空白對(duì)照組 B PC-3細(xì)胞陰性對(duì)照組 C PC-3細(xì)胞敲低組 D DU145細(xì)胞空白對(duì)照組 E DU145細(xì)胞陰性對(duì)照組 F DU145細(xì)胞敲低組

2.6 敲低NOB1可以抑制c-Src磷酸化 為進(jìn)一步研究NOB1 的功能，本實(shí)驗(yàn)在前列腺癌細(xì)胞株P(guān)C-3和DU145中敲低NOB1，發(fā)現(xiàn)前列腺癌細(xì)胞在感染了NOB1 干擾慢病毒后，細(xì)胞形態(tài)變得狹長，呈梭狀或紡錘狀。隨后采用Western印跡法檢測NOB1下游可能的信號(hào)通路變化情況，PC-3 細(xì)胞陰性對(duì)照組和敲低組c-Src(tyr416位點(diǎn))的磷酸化半定量結(jié)果分別為1.000±0.000、0.347±0.07，DU145細(xì)胞陰性對(duì)照組和敲低組c-Src(tyr416位點(diǎn))的磷酸化半定量結(jié)果分別為1、0.439±0.073，兩種細(xì)胞敲低組c-Src(tyr416位點(diǎn))的磷酸化半定量均顯著低于各自陰性對(duì)照組(P值均< 0.01)。見圖4。

A PC-3細(xì)胞 B DU145細(xì)胞 1 陰性對(duì)照組 2 敲低組

3 討 論

由于前列腺癌發(fā)病隱匿，早期難以發(fā)現(xiàn)，故臨床上以中晚期患者為多，我國中晚期前列腺癌患者占總發(fā)病人群的60%[12]。前列腺癌的轉(zhuǎn)移常見，尤其是骨轉(zhuǎn)移，超過90%的前列腺癌轉(zhuǎn)移患者會(huì)發(fā)生骨轉(zhuǎn)移[13]。腫瘤細(xì)胞的轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致前列腺癌術(shù)后復(fù)發(fā)的主要原因。因此，對(duì)前列腺癌轉(zhuǎn)移分子機(jī)制的研究，為進(jìn)一步開發(fā)有效的治療手段提供重要依據(jù)，對(duì)提高患者生存率具有重要的臨床意義。

本研究團(tuán)隊(duì)在前期工作中比較了前列腺癌與癌旁組織中NOB1的表達(dá)水平，并分析患者預(yù)后；結(jié)果顯示，NOB1在前列腺癌組織中高表達(dá)，且與前列腺癌的惡性程度相關(guān)[11]，提示NOB1可能參與調(diào)控前列腺癌細(xì)胞的惡性增殖和侵襲性轉(zhuǎn)移。本研究構(gòu)建了靶向敲低NOB1基因的shRNA慢病毒，檢測NOB1敲低后的前列腺癌細(xì)胞功能表型的改變。MTT實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)第3、4、5天PC-3、DU145細(xì)胞敲低組A595值均顯著低于陰性對(duì)照組同時(shí)間，細(xì)胞增殖率被抑制70%以上，提示NOB1基因被沉默后，前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145的增殖能力降低；流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期結(jié)果顯示，PC-3、DU145細(xì)胞陰性對(duì)照組的G0/G1期細(xì)胞百分比均顯著低于敲低組，S期細(xì)胞百分比均顯著高于敲低組，提示NOB1被敲低后，前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145細(xì)胞周期停滯于G0/G1期；Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，PC-3、DU145細(xì)胞敲低組的遷移細(xì)胞數(shù)均顯著低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，提示敲低NOB1后可使前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145的侵襲能力降低；Western印跡法檢測結(jié)果顯示，PC-3、DU145細(xì)胞敲低組c-Src(tyr416位點(diǎn))的磷酸化半定量均顯著低于陰性對(duì)照組，提示敲低NOB1后可使前列腺癌細(xì)胞PC-3、DU145中c-Src的tyr416位點(diǎn)磷酸化水平顯著降低。上述實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，NOB1被敲低后，前列腺癌細(xì)胞的增殖和侵襲能力均被抑制，這種細(xì)胞表型的變化可能與c-Src(tyr416位點(diǎn))磷酸化被抑制有關(guān)。

c-Src是非受體酪氨酸激酶家族的重要成員[14]，是細(xì)胞運(yùn)動(dòng)能力調(diào)控中的一個(gè)關(guān)鍵性酪氨酸蛋白激酶，其通過肌動(dòng)蛋白應(yīng)力纖維的拆卸、絲足體的組裝和黏著斑的動(dòng)態(tài)平衡調(diào)控細(xì)胞的運(yùn)動(dòng)能力[15]。c-Src活性通過蛋白相互作用和磷酸化進(jìn)行調(diào)控，c-Src上有2個(gè)重要的磷酸化位點(diǎn)Y416和Y530，前者的磷酸化通過c-Src 的構(gòu)象改變激活其激酶活性，后者的磷酸化可通過c-Src 內(nèi)部折疊來抑制其激酶活性的發(fā)揮[16]。活化的c-Src通過磷酸化下游底物如雄激素受體、磷脂酰肌醇3-激酶信號(hào)通路發(fā)揮提高前列腺癌細(xì)胞增殖能力的作用；通過磷酸化激活Ezrin、Contractin、Paxilin和Rho鳥苷三磷酸酶等促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力；通過磷酸化激活絲裂原活化蛋白激酶、信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄激活因子3等發(fā)揮促血管生成作用[17-18]。c-Src是腫瘤細(xì)胞獲得轉(zhuǎn)移潛能的核心分子[19-20]。本研究發(fā)現(xiàn)，敲低NOB1可以明顯抑制c-Src的tyr146位點(diǎn)磷酸化，該位點(diǎn)是激活c-Src激酶活性所必需的，可以推測NOB1很可能是通過促進(jìn)c-Src磷酸化促進(jìn)前列腺癌的轉(zhuǎn)移。

綜上所述，NOB1在前列腺癌細(xì)胞中的高表達(dá)可能通過上調(diào)c-Src激酶活性促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的遷移和侵襲能力，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤發(fā)生遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。但其具體的作用機(jī)制和信號(hào)通路仍有待進(jìn)一步研究闡明。