閆雪波，王炯

摘要：目的 ?觀察Raf激酶抑制蛋白（RKIP）在不同類型肺癌中表達的變化及探討其臨床價值。方法 ?選取鱗癌21例、腺癌23例及小細胞肺癌10例設(shè)為實驗組，肺良性病變10例設(shè)為對照組，采用免疫組化的方法檢測RKIP的表達，觀察在不同類型肺癌中表達的差異及與臨床分期的關(guān)系。結(jié)果 ?與對照組比較，實驗組中RKIP的表達水平均降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。實驗組中RKIP的表達最低的是小細胞癌，其次為鱗癌，再次腺癌。對腺癌進一步研究發(fā)現(xiàn)，與Ⅰ及Ⅱ期比較，RKIP在Ⅲ及Ⅳ期的表達更低;與Ⅰ期比較，RKIP在Ⅱ期中表達稍有減低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與Ⅲ期比較，RKIP在Ⅳ期中表達稍有減低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。磷酸化ERK1/2（p-ERK1/2）的表達趨勢與RKIP相反，與Ⅰ和Ⅱ期比較，在Ⅲ和Ⅳ期中表達明顯升高。相關(guān)性分析顯示，RKIP與p-ERK1/2的表達呈負相關(guān)（r=-0.893，P<0.05）。結(jié)論 ?RKIP表達水平的缺失可能促進了ERK1/2的磷酸化，從而促進了肺癌的發(fā)生及發(fā)展，因此檢測RKIP的表達水平可能對診斷肺癌及分期預(yù)后有重要的臨床價值。

關(guān)鍵詞：RKIP;ERK1/2;肺癌;腺癌;癌癥分期

中圖分類號：R734.2 ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? 文獻標識碼：A ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? DOI：10.3969/j.issn.1006-1959.2019.22.018

文章編號：1006-1959（2019）22-0055-04

Changes of RKIP Expression in Different Types of Lung Cancer and Its Clinical Significance

YAN Xue-bo，WANG Jiong

（Department of Respiratory and Critical Care Medicine，the First Affiliated Hospital of Anhui Medical University，

Hefei 230022，Anhui，China）

Abstract：Objective ?To observe the changes of expression of Raf kinase inhibitory protein （RKIP） in different types of lung cancer and to explore its clinical value. Methods ?21 cases of squamous cell carcinoma， 23 cases of adenocarcinoma and 10 cases of small cell lung cancer were selected as experimental group. 10 cases of benign lung lesions were used as control group. The expression of RKIP was detected by immunohistochemistry and observed in different types of lung cancer. Differences and relationships with clinical staging. Results ?Compared with the control group， the expression level of RKIP in the experimental group decreased，the difference was statistically significant （P<0.05）. The lowest expression of RKIP in the experimental group was small cell carcinoma， followed by squamous cell carcinoma and re-adenocarcinoma. Further studies on adenocarcinoma found that RKIP was lower in stage III and IV than stage I and stage II. Compared with stage I， RKIP was slightly decreased in stage II， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. Compared with stage III， RKIP expression was slightly decreased in stage IV， but the difference was not statistically significant （P>0.05）. The expression trend of phosphorylated ERK1/2 （p-ERK1/2） was opposite to that of RKIP， and the expression was significantly increased in stages III and IV compared with stage I and II. Correlation analysis showed that RKIP was negatively correlated with p-ERK1/2 expression （r=-0.893， P<0.05）. Conclusion ?The loss of RKIP expression may promote the phosphorylation of ERK1/2， which promotes the occurrence and development of lung cancer. Therefore， the detection of RKIP expression may have important clinical value in the diagnosis of lung cancer and staged prognosis.

Key words：RKIP;ERK1/2;Lung cancer;Adenocarcinoma;Cancer staging

肺癌（lung cancer）為世界范圍內(nèi)各類腫瘤死亡率之首，全球每年大約有160萬例新增肺癌患者及140萬例肺癌死亡患者，而且大部分發(fā)生在發(fā)展中國家[1]，已經(jīng)成為我國高發(fā)病率及高死亡率的惡性腫瘤之一，嚴重影響我國人民的健康，給社會、經(jīng)濟和家庭帶來了沉重的負擔[1]。肺癌分為非小細胞肺癌及小細胞肺癌，約80%的患者是非小細胞肺癌，且50%～70%的患者診斷時已經(jīng)是晚期。因此，肺癌的早期診斷、臨床分期的早期評估在診斷和治療過程中尤為重要。Raf激酶抑制蛋白（RKIP）是一種小分子保守蛋白，能夠抑制Raf/有絲分裂原激活蛋白激酶激酶（MEK）/細胞外信號調(diào)節(jié)激酶（ERK）信號通路，抑制Raf和MEK結(jié)合，從而抑制Raf介導(dǎo)的MEK磷酸化，對ERK信號通路起到負調(diào)控的作用[2]。RKIP在人體組織中廣泛表達，既往研究發(fā)現(xiàn)，RKIP可能對癌細胞的轉(zhuǎn)移起抑制作用。本研究探討了在不同類型肺癌組織中RKIP及ERK1/2磷酸化的表達變化，以及這種變化與臨床分期的關(guān)系，以期能夠為肺癌的發(fā)生發(fā)展以及對未來肺癌的治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。

1資料和方法

1.1一般資料 ?本研究所用標本均來自2017年1月～2019年8月安徽醫(yī)科大學(xué)第一附屬醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科（干部，西一，西二病區(qū)）住院患者，均為初次診斷，未接受治療，標本為氣管鏡下活檢，或CT引導(dǎo)下肺穿取肺癌組織。研究對象根據(jù)病例診斷分為對照組和實驗組。對照組為良性病變10例;實驗組即肺癌組總計54例，包括鱗癌21例、腺癌23例及小細胞肺癌10例，所有病例均由病理學(xué)確診。

1.2方法 ?免疫組化的方法檢測RKIP和p-ERK1/2的表達：5 μm石蠟組織切片二甲苯脫蠟2次，每次10 min;梯度乙醇水化，具體如下：100%乙醇2次，每次5 min;90%乙醇2次，每次5 min;80%乙醇2次，每次5 min;70%乙醇水化2次，每次5 min。PBS浸泡2次，每次5 min;蒸餾水浸泡2次，每次5 min;0.3%H2O2去離子水孵育10～30 min，滅活內(nèi)源性過氧化物酶活性;蒸餾水沖洗，PBS浸泡5 min。0.01 mol/L枸櫞酸鈉緩沖溶液（pH 6.0）浸泡，微波750 w抗原修復(fù)2次，每次5 min，自然冷卻。血清封閉，室溫30 min;加入一抗孵育，4℃過夜，復(fù)溫2 h。PBS沖洗5次，每次3 min;加辣根過氧化物酶標記標記的二抗孵育，室溫1 h。PBS沖洗5次，每次3 min;氧化二氨基聯(lián)苯胺顯色5～10 min;自來水充分沖洗;10%蘇木精復(fù)染 ? ?2 min，鹽酸酒精分化;自來水沖洗10～15 min;梯度乙醇脫水、二甲苯透明、封片。抗體及相關(guān)試劑為即用型，購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。

1.3結(jié)果判斷 ?肺癌患者臨床特征按照年齡、性別、腫塊大小、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和分期進行分析整理;低表達和高表達的定義如下：染色強度（陰性：0，弱：1，中等：2，強：3）乘以陽性腫瘤細胞百分比（<5%：0，6%～25%：1，26%～50%：2，50%～75%：3，>75%：4）。評分值<3被認為是低表達，4～12被認為是高表達。即免疫組化染色表達評分值=染色深度（陰性：0，弱：1，中等：2，強：3）×陽性腫瘤細胞的百分比×100%。

1.4統(tǒng)計學(xué)處理 ?采用SPSS 13.0軟件進行分析，計量資料以（x±s）表示，多組之間比較采用ANOVA檢驗，組間比較采用t檢驗。計數(shù)資料使用[n（%）]表示，采用？字2檢驗。RKIP與p-ERK1/2相關(guān)性采用Pearson相關(guān)性分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1肺癌患者臨床特征與RKIP的表達 ?納入分析的肺癌患者臨床特征包括年齡（≥60歲、<60歲），性別（男、女），腫塊大?。ā? cm、>3 cm），淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移（有、無），分期（Ⅰ～Ⅱ期、Ⅲ～Ⅳ期）。結(jié)果顯示，RKIP的表達高低，不受年齡、性別影響（P<0.05）;腫塊大小對RKIP的影響大于年齡和性別，腫塊越大，RKIP的表達值越低，但差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移對RKIP的表達有影響，淋巴結(jié)有轉(zhuǎn)移時RKIP的表達低于淋巴結(jié)無轉(zhuǎn)移時，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05）。肺癌的分期對RKIP的表達有影響，RKIP的表達在Ⅰ～Ⅱ期高于Ⅲ～Ⅳ期，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），即RKIP的表達在Ⅲ～Ⅳ期，有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移時顯著降低，見表1。

2.2 RKIP在不同類型肺癌中的表達變化 ?實驗組RKIP表達較對照組低，其中RKIP在小細胞癌基本無表達，因此，直方圖未顯示RKIP在小細胞癌中的表達。RKIP的表達在腺癌，鱗癌呈下降趨勢，但鱗癌與腺癌RKIP表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），見圖1。

2.3 RKIP在肺腺癌不同分期中的表達變化 ?從Ⅰ～Ⅳ期RKIP的表達逐漸減低，但RKIP在Ⅰ期和Ⅱ期中的表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;在Ⅲ期和Ⅳ期中的表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與Ⅰ和Ⅱ期比較，RKIP在Ⅲ期和Ⅳ期中表達降低，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖2。

2.4磷酸化ERK在肺腺癌不同分期中的表達變化 ?從Ⅰ～Ⅳ期，p-ERK1/2的表達逐漸升高，但p-ERK在Ⅰ期和Ⅱ期中的表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;在Ⅲ和Ⅳ中的表達比較，差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）;與Ⅰ和Ⅱ期比較，RKIP在Ⅲ期和Ⅳ期中表達升高，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P<0.05），見圖3。

2.5肺腺癌中RKIP和p-ERK1/2表達的相關(guān)性分析 ?Pearson相關(guān)性分析結(jié)果進一步顯示在肺腺癌中RKIP與p-ERK1/2的表達呈負相關(guān)（r=-0.893，P<0.05），即RKIP表達值越大，p-ERK1/2表達值越小，RKIP表達值約小，p-ERK1/2表達值越大，見圖4。

3討論

肺癌已經(jīng)成為世界最常見的惡性腫瘤之一，是導(dǎo)致我國惡性腫瘤死亡的重要疾病原因。肺癌包括非小細胞癌和小細胞癌;非小細胞型肺癌又包括鱗狀細胞癌（鱗癌）、腺癌、大細胞癌。與小細胞癌相比，非小細胞癌擴散轉(zhuǎn)移相對較晚。但多數(shù)肺癌患者發(fā)現(xiàn)時已處于中晚期，5年生存率很低。肺癌的預(yù)后極差，生存時間短，與腫瘤細胞侵襲性和長距離轉(zhuǎn)移密切相關(guān)[3]。本研究中，與對照組中的強表達比較，肺癌組織中RKIP的表達均明顯減低，而且在小細胞癌中最為顯著。臨床分期越晚，RKIP表達水平越低。70.00%的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移患者的RKIP表達水平非常低，而41.18%的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移陰性患者的RKIP表達水平非常低，表明肺癌的轉(zhuǎn)移與RKIP表達水平呈負相關(guān)的關(guān)系。通過檢測肺癌組織中的RKIP的表達水平可以預(yù)測腫瘤的轉(zhuǎn)移和分期，表達越低，遠處轉(zhuǎn)移的可能性越大，分期越晚，預(yù)后可能也越差。

RKIP在肺癌中的具體發(fā)揮作用的機制目前尚不完全明確。Raf激酶能夠激活ERK信號通路激活轉(zhuǎn)錄活性，從而促進細胞的增殖、分化和轉(zhuǎn)移。RKIP是ras有絲分裂原激活蛋白激酶和ERK信號通路的負調(diào)節(jié)因子[4]。既往研究已經(jīng)證實，RKIP表達水平在所有非癌性前列腺組織中均可檢測到，但是在所有轉(zhuǎn)移性前列腺癌中都明顯降低或不可檢測的水平[5]。本研究結(jié)果顯示，p-ERK1/2與RKIP的表達完全相反，臨床分期越晚，p-ERK1/2表達越高。而且進一步的相關(guān)性分析顯示二者呈負相關(guān)，說明了在肺癌中，RKIP的表達降低，ERK信號通路的負調(diào)節(jié)降低，促進了ERK信號通路的激活，導(dǎo)致了肺癌細胞的增殖和轉(zhuǎn)移，與Wang A等[5]研究結(jié)論一致。同樣，在惡性黑色素瘤、結(jié)直腸癌、乳腺癌、甲狀腺癌和肝臟也有類似的結(jié)果。

綜上所述，RKIP表達水平的缺失可能促進了肺癌的發(fā)生及發(fā)展，檢測RKIP的表達水平可能對診斷肺癌及分期預(yù)后有重要的臨床價值。未來需要對RKIP的作用機制進行深入的研究，期望能對肺癌的診斷和治療奠定一定的理論基礎(chǔ)。

參考文獻：

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收稿日期：2019-9-3;修回日期：2019-9-15

編輯/肖婷婷