孫 穎 顧 瑋 鄭 雄 胡梅潔 高 天

上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院消化內(nèi)科1(200020)上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院消化內(nèi)科2 上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬仁濟(jì)醫(yī)院老年病科3

背景：多種腫瘤組織中存在長(zhǎng)鏈非編碼RNA(lncRNAs)表達(dá)失調(diào)。前期研究顯示lncRNA-BBOX1-2在胃癌中的表達(dá)明顯升高，而成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(FGFR1)為其可能的靶基因。目的：探討lncRNA-BBOX1-2和FGFR1在胃癌中的表達(dá)和意義。方法：采用real-time PCR檢測(cè)45例胃癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織中的lncRNA-BBOX1-2和FGFR1表達(dá)，分析兩者表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系。以ROC曲線分析lncRNA-BBOX1-2和FGFR1判斷胃癌發(fā)生和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的效能。以siRNA-BBOX1-2轉(zhuǎn)染人胃癌細(xì)胞株SGC-7901，real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)FGFR1表達(dá)。結(jié)果：胃癌組織中的lncRNA-BBOX1-2和FGFR1表達(dá)顯著高于癌旁正常組織(P<0.05)；lncRNA-BBOX1-2表達(dá)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，F(xiàn)GFR1表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期呈顯著正相關(guān)(P<0.05)，兩者在胃癌組織中的表達(dá)則呈弱相關(guān)關(guān)系(r=0.344, P<0.05)。以RNA干擾技術(shù)敲除lncRNA-BBOX1-2表達(dá)后，SGC-7901細(xì)胞FGFR1 mRNA和蛋白表達(dá)顯著下調(diào)(P<0.05)。ROC曲線分析顯示，lncRNA-BBOX1-2和FGFR1對(duì)于判斷胃癌發(fā)生(AUC分別為0.916和0.862)和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移(AUC分別為0.720和0.774)有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。結(jié)論：LncRNA-BBOX1-2和FGFR1在胃癌組織中表達(dá)上調(diào)。LncRNA-BBOX1-2可能通過正向調(diào)節(jié)FGFR1表達(dá)參與調(diào)控胃癌的發(fā)生、發(fā)展。

胃癌是常見的消化道惡性腫瘤，全球年新發(fā)病例數(shù)約為120萬(wàn)，其中40%為中國(guó)病例；在我國(guó)惡性腫瘤發(fā)病率和死亡率中，胃癌分居第二位和第三位[1]。我國(guó)胃癌病例中早期胃癌僅占20%，大多數(shù)患者發(fā)現(xiàn)時(shí)腫瘤已屬進(jìn)展期，總體5年生存率不足50%[2]。胃癌發(fā)生、發(fā)展的病理生理學(xué)機(jī)制迄今尚不明確，阻礙了其診治手段的進(jìn)展，因此，相關(guān)分子機(jī)制的揭示具有重要臨床意義。既往對(duì)胃癌發(fā)生機(jī)制的研究主要集中于蛋白質(zhì)編碼基因，且相關(guān)研究成果已應(yīng)用于臨床。近年來，高通量轉(zhuǎn)錄組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用為胃癌分子機(jī)制的研究提供了新的手段。

總基因組中98%為非編碼RNA(non-coding RNAs, ncRNAs)，其中一類長(zhǎng)度在200～100 000 nt之間的RNA分子稱為長(zhǎng)鏈ncRNAs(long ncRNAs, lncRNAs)[3-5]。LncRNAs最初被認(rèn)為是虛假的轉(zhuǎn)錄噪聲，但后續(xù)越來越多的研究發(fā)現(xiàn)多種腫瘤組織中存在lncRNAs表達(dá)失調(diào)，提示其可能參與了腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程。筆者所在團(tuán)隊(duì)在前期研究[6]中應(yīng)用基因芯片技術(shù)完成了胃癌lncRNAs表達(dá)譜的檢測(cè)，并發(fā)現(xiàn)lncRNA-BBOX1-2在胃癌中的表達(dá)明顯升高，靶基因預(yù)測(cè)表明其可能靶基因?yàn)槌衫w維細(xì)胞生長(zhǎng)因子受體1(fibroblast growth factor receptor 1, FGFR1)，后者為FGFRs家族成員，是一類跨膜蛋白，屬于受體酪氨酸激酶家族。本研究擬進(jìn)一步分析lncRNA-BBOX1-2和FGFR1在胃癌中的表達(dá)及其與胃癌診斷、腫瘤分期和預(yù)后之間的相關(guān)性，探討兩者在胃癌中的作用和意義。

材料與方法

一、組織標(biāo)本來源

收集2017年4月—2018年2月在上海交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬瑞金醫(yī)院盧灣分院接受手術(shù)治療的45例胃癌患者的胃癌組織和相應(yīng)癌旁正常組織(距癌組織邊緣>5 cm)石蠟標(biāo)本，癌組織和非癌組織均經(jīng)病理檢查證實(shí)。其中男性33例，女性12例，年齡27～81歲，中位年齡63.5歲。所有患者術(shù)前未接受任何放療、化療和內(nèi)分泌治療，術(shù)后臨床病理資料完整，排除嚴(yán)重肝腎疾病、內(nèi)分泌代謝性疾病和結(jié)締組織病病例。研究方案經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)審核批準(zhǔn)，并取得患者及其家屬知情同意。

二、細(xì)胞株、主要試劑和儀器

人胃癌細(xì)胞株SGC-7901(中國(guó)科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心)。TRIzol RNA分離試劑、SuperScriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶、LipofectamineTM2000轉(zhuǎn)染試劑(InvitrogenTM, Thermo Fisher Scientific)；Real-time PCR 試劑盒(廣州復(fù)能基因有限公司)；引物設(shè)計(jì)、合成(上海英駿生物技術(shù)有限公司)；FGFR1抗體(Sigma-Aldrich)；GAPDH抗體(上海印序生物科技有限公司)；羊抗兔二抗、羊抗鼠二抗(Jackson ImmunoResearch)；ECL發(fā)光液(Milli-poreSigmaTM, Thermo Fisher Scientific)。GeneAmpTMPCR System 9700、ViiATM7 Real-Time PCR System(Applied BiosystemsTM, Thermo Fisher Scientific)；倒置顯微鏡IX53(Olympus公司)。

三、方法

1. Real-time PCR：TRIzol試劑抽提組織樣品總RNA，紫外分光光度法檢測(cè)總RNA濃度和純度，以SuperScriptTMⅢ反轉(zhuǎn)錄酶反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，以之為模板行real-time PCR擴(kuò)增。LncRNA-BBOX1-2引物序列：F 5’-AAT ACC AAA GAG GGC CGC-3’, R 5’-AGT TCC CCC AGC AAC CTC-3’；FGFR1引物序列：F 5’-TAC TCC CCC AGC TTT CCC-3’, R 5’-AGA CGG AAT CCT CCC CTG-3’；內(nèi)參GAPDH引物序列：F 5’-AAG GTC ATC CCA GAG CTG AA-3’, R 5’-CTG CTT CAC CAC CTT CTT GA-3’。以2-△△CT法計(jì)算目的基因mRNA相對(duì)表達(dá)量。

2. SiRNA脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染和FGFR1表達(dá)檢測(cè)：通過公用在線網(wǎng)站設(shè)計(jì)靶向lncRNA-BBOX1-2的siRNA(正義鏈GAU GGA AAU GCA GAA AUC ACC，反義鏈UGA UUU CUG CAU UUC CAU CUG，由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成)并轉(zhuǎn)染SGC-7901細(xì)胞，以轉(zhuǎn)染無(wú)關(guān)序列陰性對(duì)照siRNA的SGC-7901細(xì)胞作為對(duì)照組。將轉(zhuǎn)染混合物加入24孔細(xì)胞培養(yǎng)板(100 μL/孔)，37 ℃、5% CO2條件下孵育。轉(zhuǎn)染48 h后收集細(xì)胞，以real-time PCR檢測(cè)siRNA沉默效率，real-time PCR和蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)FGFR1 mRNA和蛋白表達(dá)。每組實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

四、統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

結(jié) 果

一、LncRNA-BBOX1-2、FGFR1在胃癌組織和癌旁正常組織中的表達(dá)

Real-time PCR檢測(cè)顯示，lncRNA-BBOX1-2和FGFR1在胃癌組織中的相對(duì)表達(dá)量明顯高于相應(yīng)癌旁正常組織，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(lncRNA-BBOX1-2∶3.291±0.274對(duì)1.125±0.075,P<0.05; FGFR1∶ 3.428±0.446對(duì)1.048±0.124,P<0.05)(圖1)。

二、LncRNA-BBOX1-2和FGFR1區(qū)分胃癌組織與癌旁正常組織的診斷效能分析

ROC曲線分析顯示，lncRNA-BBOX1-2區(qū)分胃癌組織與癌旁正常組織的ROC曲線下面積(AUC)為 0.916(95% CI: 0.859～0.972)(圖2A)，F(xiàn)GFR1為0.862(95% CI: 0.784～0.939)(圖2B)；進(jìn)一步分析兩者區(qū)分TNM Ⅰ-Ⅱ期胃癌組織與癌旁正常組織的效能，lncRNA-BBOX1-2和FGFR1的AUC分別為0.887(95% CI: 0.805～0.969)(圖2C)和0.819(95% CI: 0.716～0.923)(圖2D)(表1)。由此認(rèn)為lncRNA-BBOX1-2和FGFR1對(duì)于判斷胃癌發(fā)生具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。

三、LncRNA-BBOX1-2和FGFR1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

分析顯示，胃癌組織中的lncRNA-BBOX1-2、FGFR1表達(dá)與患者性別、年齡無(wú)明顯相關(guān)性(P>0.05)；lncRNA-BBOX1-2表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度無(wú)關(guān)(P>0.05)，但與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和 TNM 分期呈顯著正相關(guān)(P<0.05)；FGFR1表達(dá)與腫瘤分化程度、浸潤(rùn)深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期均呈顯著正相關(guān)(P<0.05)(表2)。

四、LncRNA-BBOX1-2和FGFR1對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)效能分析

進(jìn)一步以ROC曲線評(píng)價(jià)lncRNA-BBOX1-2和FGFR1對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的預(yù)測(cè)價(jià)值，結(jié)果顯示兩者AUC分別為0.720(95% CI: 0.565～0.875)和0.774(95% CI: 0.631～0.917)(圖3A、3B)。LncRNA-BBOX1-2最佳診斷界值為3.023，相應(yīng)敏感性為65.0%(95% CI: 40.8～84.6)，特異性為68.0%(95% CI: 46.5～85.1)；FGFR1最佳診斷界值為2.838，相應(yīng)敏感性為70.0%(95% CI: 45.7～88.1)，特異性為76.0%(95% CI: 54.9 ～90.7)。由此認(rèn)為lncRNA-BBOX1-2和FGFR1對(duì)于預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移具有一定臨床應(yīng)用價(jià)值。

圖1 胃癌組織與癌旁正常組織lncRNA-BBOX1-2、FGFR1表達(dá)比較

表1 LncRNA-BBOX1-2、FGFR1區(qū)分胃癌組織與癌旁正常組織的診斷效能

表2LncRNA-BBOX1-2和FGFR1表達(dá)與胃癌臨床病理特征的關(guān)系

五、LncRNA-BBOX1-2與FGFR1在胃癌組織中的關(guān)系

Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示，lncRNA-BBOX1-2與FGFR1在胃癌組織中的表達(dá)呈弱相關(guān)關(guān)系(r=0.344,P=0.021)(圖4)。轉(zhuǎn)染siRNA-BBOX1-2的SGC-7901細(xì)胞，lncRNA-BBOX1-2表達(dá)沉默效率為82.3%,其FGFR1 mRNA和蛋白相對(duì)表達(dá)量均較轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照siRNA的SGC-7901細(xì)胞明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(0.190±0.014對(duì)0.946±0.039,P<0.05; 0.24±0.01對(duì)0.78±0.03,P<0.05)(圖5)，提示lncRNA-BBOX1-2對(duì)FGFR1表達(dá)具有正向調(diào)節(jié)作用。

討 論

LncRNAs是一類轉(zhuǎn)錄本長(zhǎng)度大于200 nt但無(wú)開放閱讀框、缺乏蛋白編碼功能的RNA分子。近年大量研究表明，lncRNAs具有強(qiáng)大的基因調(diào)控功能，與多種實(shí)體腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后密切相關(guān)。部分lncRNAs如MEG3對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起抑制作用[7-8]，另一部分如HOTAIR則對(duì)腫瘤發(fā)生、發(fā)展起促進(jìn)作用[9-11]。胃癌組織中，MEG3表達(dá)較癌旁正常組織顯著降低，其低表達(dá)與胃癌浸潤(rùn)深度、TNM分期和預(yù)后不良呈正相關(guān)[7]；HOTAIR表達(dá)則較癌旁正常組織顯著上調(diào)，并與胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期呈正相關(guān)[9-10]。抑癌或促癌機(jī)制可能涉及激活抑癌基因p53[7-8]、促進(jìn)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化[10]以及表觀基因組學(xué)調(diào)控等[11]。LncRNA-H19、CCAT1、AC096655.1-002等亦在胃癌發(fā)生、發(fā)展中起重要調(diào)控作用[12-14]。

A、B：區(qū)分胃癌組織與癌旁正常組織；C、D：區(qū)分TNM Ⅰ-Ⅱ期胃癌組織與癌旁正常組織

圖3 LncRNA-BBOX1-2和FGFR1預(yù)測(cè)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移ROC曲線分析

圖4胃癌組織中l(wèi)ncRNA-BBOX1-2與FGFR1表達(dá)的相關(guān)性

圖5敲除lncRNA-BBOX1-2顯著抑制SGC-7901細(xì)胞FGFR1表達(dá)(蛋白質(zhì)印跡法)

筆者所在團(tuán)隊(duì)的前期研究[6]應(yīng)用微陣列技術(shù)在6對(duì)胃癌及其毗鄰正常組織中鑒定出1 297個(gè)差異表達(dá)lncRNAs，并通過real-time PCR在另一組共10例胃癌病例中對(duì)4個(gè)差異表達(dá)lncRNAs(表達(dá)上調(diào)的UCA1、lncRNA-BBOX1-2和下調(diào)的CR594506、BC015134)進(jìn)行驗(yàn)證。LncRNA-BBOX1-2位于11號(hào)染色體，編碼-非編碼基因共表達(dá)網(wǎng)絡(luò)(coding-non-coding gene co-expression network, CNC)將其表達(dá)與腫瘤驅(qū)動(dòng)基因FGFR1相關(guān)聯(lián)。目前已發(fā)現(xiàn)的FGFRs超家族共有5個(gè)成員，家族成員參與介導(dǎo)多個(gè)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，包括JAK/STAT、PI3K、MAPK等[15-18]。其配體堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(basic fibroblast growth factor, bFGF)在體內(nèi)分布廣泛，與特異性的FGFR結(jié)合后能使受體二聚化、激活，進(jìn)而激活多種信號(hào)通路，促進(jìn)細(xì)胞增殖、分化以及組織增生和血管形成，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展和轉(zhuǎn)移過程中起重要作用。既往研究發(fā)現(xiàn)FGFR1在多種腫瘤組織中存在過表達(dá)，包括肺鱗癌、口腔鱗癌、乳腺癌、胃癌等[19-22]。

本研究結(jié)果顯示，lncRNA-BBOX1-2和FGFR1在胃癌組織中的表達(dá)顯著高于癌旁正常組織，提示兩者可能參與了胃癌的發(fā)生、發(fā)展過程。ROC曲線分析顯示，兩者判斷胃癌發(fā)生的AUC分別為0.916和0.862，表明診斷效能較好；兩者最佳診斷界值分別為1.388和1.309，相應(yīng)敏感性和特異性均在80%以上，有較好的臨床應(yīng)用價(jià)值。在區(qū)分臨床分期較早的TNM Ⅰ-Ⅱ期胃癌組織與癌旁正常組織時(shí)，兩者仍有較高的準(zhǔn)確性(AUC分別為0.887和0.819)。進(jìn)一步分析lncRNA-BBOX1-2和FGFR1在胃癌組織中的表達(dá)與胃癌臨床病理特征的相關(guān)性，結(jié)果顯示兩者均與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM 分期呈顯著正相關(guān)，存在淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期較晚的患者，lncRNA-BBOX1-2和FGFR1表達(dá)水平較高，提示兩者高表達(dá)與腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移有潛在關(guān)聯(lián)。ROC曲線分析同樣表明，lncRNA-BBOX1-2和FGFR1對(duì)胃癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的評(píng)估有一定應(yīng)用價(jià)值(AUC分別為0.720和0.774)。此外,Pearson相關(guān)系數(shù)分析顯示，lncRNA-BBOX1-2與FGFR1在胃癌組織中的表達(dá)呈弱相關(guān)關(guān)系；以siRNA敲除人胃癌細(xì)胞株SGC-7901中的lncRNA-BBOX1-2后，F(xiàn)GFR1 mRNA和蛋白表達(dá)均顯著下調(diào)。結(jié)合前期研究CNC網(wǎng)絡(luò)預(yù)測(cè)結(jié)果，推測(cè)lncRNA-BBOX1-2可能通過直接或間接途徑正向調(diào)節(jié)FGFR1表達(dá)，進(jìn)而通過介導(dǎo)可能的信號(hào)通路調(diào)控腫瘤發(fā)生、發(fā)展。

綜上所述，lncRNA-BBOX1-2可能作為一個(gè)促癌因子，通過正向調(diào)節(jié)FGFR1表達(dá)參與調(diào)控胃癌的發(fā)生、發(fā)展，但其具體通過何種信號(hào)通路參與調(diào)控胃癌發(fā)生尚不明確，有待后續(xù)深入研究。相關(guān)研究成果可能使lncRNA-BBOX1-2和FGFR1在胃癌臨床診斷、靶向治療以及預(yù)后判斷等方面發(fā)揮積極作用。