邸 桐 趙智婕 包金風(fēng)

內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，呼和浩特，010110，中國

焦慮癥（anxiety）是最常見的精神疾病之一，主要表現(xiàn)為過度擔(dān)心、過度興奮和恐懼等。焦慮障礙的存在是導(dǎo)致其他焦慮、情緒障礙和藥物濫用的危險因素。共病發(fā)展使原發(fā)性和繼發(fā)性疾病的治療更加困難，導(dǎo)致緩解率低、預(yù)后不良和自殺風(fēng)險等。研究表明，大約三分之一的兒童在成年之前會經(jīng)歷焦慮癥［1］。大量的臨床和流行病學(xué)研究表明，焦慮與早期的不良環(huán)境有關(guān)，如母愛缺失等［2］?！岸脊W(xué)說”即健康與疾病的發(fā)育起源（developmental origins of health and disease，DOHAD）學(xué)說認(rèn)為在動物胚胎期和早期發(fā)育的關(guān)鍵窗［3］，不良的環(huán)境可引起機體組織器官結(jié)構(gòu)和功能的適應(yīng)性改變，從而增加其神經(jīng)、內(nèi)分泌、心血管等系統(tǒng)多種疾病的易感性。早期不良環(huán)境包括嚴(yán)重的大氣污染［4］、兒童期遭受虐待、母親飲酒［5］，尤其是母愛缺失［6］，可能引起神經(jīng)系統(tǒng)疾病易感性增加，對個體身心發(fā)育產(chǎn)生嚴(yán)重?fù)p害。青少年期是一個特別重要的生命時期，研究此時應(yīng)激暴露對神經(jīng)系統(tǒng)疾病和認(rèn)知功能［7］的影響十分重要。

葉酸（folic acid，F(xiàn)A）是一種在人體內(nèi)不能自主合成，必須依靠外源性供給的水溶性B 族維生素。其在DNA、RNA 的合成和DNA 甲基化等過程中起重要的作用。孕期給予葉酸可預(yù)防新生兒神經(jīng)管畸形等。近年來，研究表明葉酸缺乏可能也與多動癥和孤獨癥等疾病的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)。Tsuchimine S 等［8］的研究發(fā)現(xiàn)患有抑郁癥的青少年和兒童體內(nèi)葉酸明顯低于對照組，但葉酸是否能夠改善早期不良環(huán)境引起的成年小鼠行為和認(rèn)知功能目前未見報道。母嬰分離模型，被認(rèn)為是對子代行為及神經(jīng)發(fā)育影響研究的最有效模型之一［9］，經(jīng)母嬰分離的小鼠，會引起后代生理和神經(jīng)遞質(zhì)功能的紊亂，其成年后會出現(xiàn)認(rèn)知障礙和焦慮抑郁行為等［10］。因此本實驗采用母嬰分離經(jīng)典應(yīng)激模型，模擬人類的環(huán)境-心理應(yīng)激，研究給予葉酸對早期不良環(huán)境作用下小鼠行為學(xué)和認(rèn)知功能的影響，為葉酸的臨床應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 實驗方法

1.1 母嬰分離模型

昆明小鼠，購于內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)，許可證號：SCXK（蒙）2015-0001，6～8 周雌雄交配，新生鼠出生當(dāng)天記作0 d。整個實驗用到新生鼠的數(shù)目為41 只，同一時間新生的小鼠4 窩，其中每一窩將分成三個部分，對照組（不分離），模型組（母嬰分離+生理鹽水），葉酸組（母嬰分離+葉酸）如Fig.1。母嬰分離操作步驟為用酒精擦拭過的鑷子將26 只幼崽輕柔夾出，每日小鼠分離至另一充滿墊料籠子4 h，分離28 d。待小鼠長至14 d，分離同時每日腹腔注射葉酸28 d，劑量為5 mg·kg-1，體積為0.1 mL 每10 g，此為葉酸組，數(shù)目為13 只；母嬰分離組數(shù)目也為13 只，同上進行分離操作每日4 h，持續(xù)28 d待小鼠長至14 d，分離同時每日腹腔注射生理鹽水（normal saline，NS）0.1 mL 每10 g，注射28 d；正常組則為不進行分離操作。每周記錄體重。待各組小鼠成年后約第10 周進行小鼠行為學(xué)檢測。

1.2 行為學(xué)實驗

1.2.1 曠場實驗（open-field test，OFT）

曠場為一個50 cm×50 cm×50 cm 的不透明黑色玻璃敞箱。小鼠提前適應(yīng)曠場15 min。24 h 后小鼠置于曠場的一個角，攝像機記錄和評估5 min 的活動，觀察小鼠進入中心區(qū)域次數(shù)及時間、直立次數(shù)。每一只鼠實驗結(jié)束后，需將曠場箱內(nèi)鼠的排泄物清理干凈，并用75%酒精及衛(wèi)生紙擦拭，晾干后方可進行下一只動物的實驗，以避免氣味對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響。

1.2.2 十字高架實驗（elevated plus maze test，EPM）

Fig.1 Process diagram

開始時手持小鼠，使其背對實驗人員，放置在開臂與閉臂接合處的中心區(qū)，讓小鼠面對開放臂。放置好鼠后，實驗人員迅速遠離，用攝像機記錄5 min 內(nèi)小鼠在高架十字迷宮內(nèi)的活動情況，觀察小鼠進入開放臂和閉合臂次數(shù)及時間、直立次數(shù)。每一只鼠實驗結(jié)束后，需將迷宮內(nèi)鼠的排泄物清理干凈，并用75%酒精及衛(wèi)生紙擦拭，晾干后方可進行下一只動物的實驗，以避免氣味對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響。

1.2.3 新奇事物識別實驗（novel object recognition test，NORT）

曠場為一個50 cm×50 cm×50 cm 的不透明黑色玻璃敞箱。小鼠提前適應(yīng)曠場15 min。24 h 后放入小鼠，此時曠場內(nèi)放入兩個形狀大小顏色相同的物體A，記錄并觀察。24 h 后將其中一個A 物體換成一個大小顏色相同但形狀不同的物體B，攝像機記錄并觀察5 min，見（Fig.2）。結(jié)果以分辨指數(shù)（distinguish index，DI）來表示，分辨指數(shù)計算公式為：DI=N/（N+F）100%，式中N 為探索新物體所用的時間，F(xiàn) 為探索舊物體所用的時間。每只動物實驗結(jié)束后，需將敞箱內(nèi)的排泄物全部清理，并用75%酒精及衛(wèi)生紙擦拭敞箱和物體A 或B，晾干后進行下一只動物的實驗，以避免氣味對實驗結(jié)果產(chǎn)生的影響。

1.2.4 明暗箱實驗（light/dark box test，LDBT）

明暗箱實驗利用小鼠對明亮地方的好奇與厭惡的這種矛盾心理，評估小鼠焦慮相關(guān)行為。明暗箱為自制玻璃箱30 cm×30 cm×80 cm，不封閉的明箱占裝置的3/5，完全涂成白色，而暗箱占箱子的2/5，全部涂成黑色。中間有隔斷將裝置分為明箱和暗箱，暗箱有頂蓋。在明暗箱之間的隔斷底部留有一個7 cm×7 cm 的出入口。實驗開始時，將小鼠置于背朝著出入門的明箱中央，觀察5 min 內(nèi)小鼠的活動情況。觀察指標(biāo)為記錄明箱停留時間和穿箱次數(shù)。每次實驗開始前將明暗箱用75%酒精徹底擦拭，以排除前一個小鼠的殘留氣味對下一個小鼠行為的影響。

1.3 統(tǒng)計學(xué)方法：

所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 22.0 進行數(shù)據(jù)分析處理，各組實驗數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（x-±s）表示。由于大多數(shù)行為數(shù)據(jù)不是正態(tài)分布的，所以使用了非參數(shù)檢驗，當(dāng)接受H1時，繼續(xù)用Kruskal-Wallis H 法進行兩兩比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。若數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布且方差齊，采用單因素方差分析（one-way ANOVA），采用LSD 兩兩比較，以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 曠場實驗結(jié)果

對照組進入中間格子的次數(shù)為（15.15±0.92）次，模型組進入中間格子的次數(shù)為（11.15±1.47）次，葉酸組進入中間格子次數(shù)為（17.93±1.26）次。相比于對照組，母嬰分離操作可以使小鼠進入中間格子次數(shù)減少（P＜0.05）。給予葉酸后，可使小鼠進入中間格子次數(shù)顯著增加（P＜0.01）；同時小鼠進入曠場中心時間，對照組（21.49±1.27）s，模型組（17.00±1.94）s，葉酸組（26.12±1.22）s。但在進入曠場時間上模型組與對照組無顯著差異（P=0.1），而模型組與葉酸組有顯著差異（P＜0.01）。垂直運動水平站立次數(shù)無明顯差異（Fig.3）。

2.2 十字高架實驗結(jié)果

Fig.2 Novel object recognition

Fig.3 Open-field test

對照組小鼠進入開臂次數(shù)百分比為（24.07±4.344）%，模型組小鼠進入開臂次數(shù)百分比為（7.943±3.731）%，葉酸組為（10.17±2.947）%（P＜0.01）。對照組在開臂時間百分比為（8.516±1.91）%；模型組（1.385±0.522 8）%，葉酸組（3.077±1.332）%。相比于對照組，模型組在開臂次數(shù)和時間明顯降低（P＜0.01），但葉酸組與模型組比較無顯著性差異。在豎直運動中，站立次數(shù)各組無顯著性差異（Fig.4）。

2.3 新事物識別實驗結(jié)果

在新事物識別實驗中，對照組小鼠識別率為（0.56±0.01），模型組小鼠識別率為（0.46±0.018），葉酸組小鼠識別率為（0.54±0.018）。采用單因素方差分析可知，與對照組相比，母嬰分離可使小鼠對新事物識別率顯著降低（P＜0.001），而葉酸可以使小鼠對新事物識別率明顯提升（P＜0.01）（Fig.5）。

2.4 明暗箱實驗結(jié)果

在明暗箱實驗中，對照組小鼠明箱停留時間百分比為（58.35±6.048）%，穿梭總次數(shù)為（35.25±1.656），模型組小鼠箱停留時間百分比為（22.11±3.815）%，穿梭總次數(shù)為（35.5±2.267）；葉酸組小鼠箱停留時間百分比為（50.76±9.832）%，穿梭總次數(shù)為（24.93±1.787）。采用單因素方差分析可知，在小鼠停留明箱時間上，與對照組相比，母嬰分離使小鼠在明箱時間顯著降低（P＜0.001），而葉酸可以使小鼠在明箱時間明顯延長（P＜0.01）。在穿梭總次數(shù)上，母嬰分離操作沒有影響小鼠的活動能力。但發(fā)現(xiàn)使用葉酸后小鼠穿梭減少，更傾向于在停留在明箱（Fig.6）。

3 討論

研究表明，葉酸對早期生活至45 歲以后的健康至關(guān)重要［11］。目前我們所知葉酸可阻止神經(jīng)管畸形的發(fā)生，以及預(yù)防特定風(fēng)險人群的癌癥發(fā)生［12］、預(yù)防阿爾茨海默?。ˋlzheimer’s disease，AD）及其它神經(jīng)退行性疾病［13］等。最近的研究發(fā)現(xiàn)妊娠期母親補充葉酸可以使30 月齡兒童表達語言得分提高［14］，而整個妊娠期補充葉酸對于改善早期運動反射發(fā)育和子代的空間學(xué)習(xí)和記憶能力將更有效［15］。Shona SI 的研究［16］也證實了葉酸對產(chǎn)前暴露于丙戊酸鈉（valproate，VPA）的小腦神經(jīng)毒性保護的作用。新事物識別實驗是利用動物先天對新物體有探索傾向的原理建立，使動物在自由狀態(tài)下進行學(xué)習(xí)記憶測試，相比與對照組母嬰分離操作可使小鼠對新事物識別率顯著降低，而葉酸可以使小鼠對新事物識別率提升，這與Lehmann［17］等研究結(jié)果一致。Macrt 和Laviola 研究［18］顯示，早年經(jīng)歷母愛剝奪的小鼠，在青春期出現(xiàn)社交能力降低、性行為減少。我們的研究結(jié)果顯示，在曠場實驗和明暗箱實驗中，模型組進入曠場中心次數(shù)及進入明箱時間比例顯著低于對照組，而葉酸可以增加小鼠的水平活動能力，說明早年經(jīng)歷母嬰分離小鼠成年后存在新奇環(huán)境中的緊張、焦慮水平增加和探索行為減少，而葉酸可以初步改善早期經(jīng)歷母愛剝奪所造成的在新環(huán)境中的緊張和焦慮狀態(tài)。在十字高架迷宮，嚙齒類動物面對新奇刺激與嗜暗天性時造成了探究與回避的沖突行為［19］，從我們的結(jié)果也可知母嬰分離使小鼠進入開臂次數(shù)減少，產(chǎn)生焦慮；其中葉酸組呈現(xiàn)開臂活動增加的趨勢，但與模型組比較結(jié)果未顯示統(tǒng)計學(xué)差異，我們推測可能因小鼠個體差異較大。然而目前有關(guān)葉酸的研究主要集中在妊娠期，對出生后研究及對情緒研究較少。

Fig.4 Elevated plus maze test (EPM)

Fig.5 Percentage of novel object in novel object recognition (NOR)

Fig.6 Light and dark box test (LDB)

綜上所述，嚙齒類母愛剝奪影響其子代的行為，這提示生命早期不良環(huán)境持久影響身心健康［20］。但生命早期不良社會環(huán)境對精神健康的影響則可以通過人為干預(yù)逆轉(zhuǎn)的，如藥物、豐富環(huán)境［21］等，這與我們的研究結(jié)果一致，我們的初步的研究結(jié)果表明，葉酸可以改善早期不良環(huán)境對小鼠造成的焦慮行為和認(rèn)知缺陷。由于我們的樣本量偏小，母嬰分離模型還在摸索階段，并未涉及分子機制層面的研究，但有關(guān)其作用和機制我們正在進一步研究中。