張嘉榮,莊 儉,吳大鳴,許 紅,郜王鑫,孫靖堯
(北京化工大學(xué)機電工程學(xué)院,北京 100029)
微針作為一種新型的經(jīng)皮給藥技術(shù),具有高效、無痛、安全等特點[1],能打破角質(zhì)層對藥物的阻滯作用,提高遞送效率,可用于麻醉、胰島素等藥物的遞送[2]。目前,麻醉方式主要是通過注射或在表皮涂覆的方式實現(xiàn)給藥,表皮涂覆的主要缺點主要是起效慢[3],而注射給麻醉藥的主要缺點是患者依從性差,特別是在浸潤麻醉中[4-5]。微針給麻醉藥時則不存在以上缺點,微針既可以穿過表皮層使得脂溶性麻醉藥起效快,又可以保證不會觸及血管,以免引起麻醉藥的毒性反應(yīng),患者依從性好,而且微針在使用上不需要人專操作,使用過程簡單,保存條件也不苛刻。因此,微針在表面麻醉和浸潤麻醉上有著巨大的優(yōu)勢以及市場的前景[6-9]。
與可溶性微針比較,不可溶微針通常生物相容性較差,且載藥量有限[10]。若為空心微針,則制造工藝較復(fù)雜,制造難度較大、針體強度較小[11-13]。因此制作可溶性微針給藥是較好的選擇。但目前麻醉微針的制備還存在工藝不穩(wěn)定、周期長、針體強度差等問題[14-15]。
本文選擇鹽酸利多卡因以及利多卡因作為小分子模型藥物,以PVP、PVA、HA材料為基礎(chǔ)制備高生物相容性的可溶性麻醉微針陣列,探究了兩種微針制備方法控制藥物分布的效果,使用顯微鏡觀測微針成型率以及成型效果并且對制備的可溶性麻醉微針進行了皮膚刺穿實驗,對穿刺結(jié)果進行了表征。
PVA,Mowiol?PVA-203,Mw≈31,000,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
HA,Mw≈350KDa,北京伊諾凱科技有限公司;
利多卡因,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
無水乙醇,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
PVP,平均分子量58000,K29-32,上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
次甲基藍,上海上海阿拉丁生化科技股份有限公司;
4周齡ICR小鼠的腹部皮膚5 cm2,北大醫(yī)學(xué)部。
真空干燥箱,DZF-6065,鞏義市予華儀器有限責(zé)任公司;
鼓風(fēng)干燥箱,101-0B,浙江力辰儀器科技有限公司;
光學(xué)顯微鏡,JTVMS-1510T,東莞市捷騰電子有限公司;
掃描電子顯微鏡(SEM),S-4700,株式會社日立制作所。
1.3.1分步澆鑄微針制備法
圖1 微針模具結(jié)構(gòu)圖Fig.1 Structure of microneedle mold
可溶性微針由針體以及將微針連接為整體的基底部分兩部分構(gòu)成。微針制備實驗中采用厚度為1.2 mm、直徑為100 mm的PDMS圓片模具,如圖1所示。微針形狀為四棱錐,微針間距為1 mm,微針設(shè)計高度是500 μm。
為了保證微針的強度,在第一步澆鑄中首先配置出10 %PVA(質(zhì)量分數(shù),下同)水溶液、5 %HA水溶液、10 %利多卡因乙醇溶液以及5 %PVP乙醇溶液,其中在利多卡因溶液中加入次甲基藍染色。然后,將HA溶液、PVA溶液、利多卡因溶液以及PVP溶液按照1∶1∶4∶1體積比混合。使用滴管在PDMS模具表面鋪上1 mm厚度的溶液層,再將模具置于真空烘箱中室溫抽真空5 min,隨后取出模具在30 ℃溫度下鼓風(fēng)干燥1 h。第二步澆鑄加入5 %HA高黏度水溶液并置于鼓風(fēng)干燥箱中65 ℃干燥6 h取出,即可得到分分部澆鑄微針陣列,微針陣列成型率為100 %,測量其基底高度為0.8 mm。利多卡因分布微針針體中,實現(xiàn)藥物精確控制和節(jié)約,可針對不同皮膚部位,實施定量麻醉給藥。
1.3.2澆鑄黏合微針制備法
由于分步澆鑄法中微針基底干燥時間過長,因此嘗試把基底單獨干燥。利用PVA與其他材料黏接性好的特點,將干燥后的針體部分和基底黏合在一起,成功地縮短了干燥成型周期。
首先,配置出10 %PVA水溶液、5 %HA水溶液、10 %利多卡因乙醇溶液以及5 %PVP乙醇溶液。為了觀測藥物在微針中的分布,加入次甲基藍對利多卡因溶液染色后將HA溶液、PVA溶液、利多卡因溶液以及PVP溶液按照1∶1∶4∶1體積比混合配成微針溶液。然后,使用滴管取液在PDMS模具上鋪一層約1 mm厚度微針溶液層,將模具置入鼓風(fēng)干燥箱中30 ℃鼓風(fēng)干燥1 h,獲得微針陣列針體結(jié)構(gòu)。然后,將5 %HA和10 %PVA溶液按照2∶1體積比混合得到基底溶液,然后倒入方形平底模具中,液面高度為8 mm,70 ℃下鼓風(fēng)干燥5 h,獲得高度為1 mm的HA/PVA薄片。最后,在PDMS模具中干燥成型后的微針陣列上涂抹約0.5 mm厚的PVA黏合劑溶液,將HA/PVA片放入黏合劑溶液層上,施加約0.5 MPa壓力,60 ℃干燥3 h取出,即可得到澆鑄黏合微針陣列。
SEM分析:將微針貼片試樣裁剪成3 mm×1 mm小片,分別在觀測臺的上面和側(cè)面各貼一片,然后噴金處理,進行SEM觀測;
光學(xué)顯微鏡觀測:將微針貼片裁剪成3 cm×3 cm小片,使用夾具夾住微針貼片,調(diào)整照明光強,顯微鏡放大40倍觀測并測量微針高度。
基質(zhì)材料PVA加水后成水凝膠狀態(tài),其水分為3種狀態(tài):自由水、可凍結(jié)結(jié)合水以及不可凍結(jié)結(jié)合水[16-19]。不可凍結(jié)結(jié)合水與聚合物中的親水分子(羥基)中的氫鍵緊密結(jié)合,幾乎不可流動,可凍結(jié)結(jié)合水與聚合物的距離比不可凍結(jié)結(jié)合水遠,其性質(zhì)介于不可凍結(jié)結(jié)合水和自由水之間,自由水與聚合物距離最遠,可自由流動,擴散于水凝膠內(nèi)部空間。針體中溶于水的次甲基藍染色利多卡因在遇到黏合劑溶液后會繼續(xù)擴散到PVA中,由同時由于針體中PVA遇到黏合劑溶液后也會有部分溶解,釋放出自由水,這也會導(dǎo)致微量染色利多卡因擴散。但僅是針體根部微量染色利多卡因擴散到基底材料中,幾乎不影響微針針體中利多卡因的載藥量。
制備的微針陣列基底為邊長2 cm的正方形貼片,每片微針陣列上含有 360根針,其局部電鏡照片如圖2所示。四棱錐型微針針體部分成型良好,成型率達到 100 %,微針平均高度約為450 μm。
(a)局部放大150倍 (b)俯視圖圖2 微針陣列Fig.2 Microneedle array
(a)單個微針 (b)微針陣列圖3 染色的微針陣列Fig.3 Dyed single microneedle
利用光學(xué)顯微鏡觀測分層微針,如圖3所示。微針針體部分呈現(xiàn)深藍色,說明絕大部分被甲基藍染色過的利多卡因集中在微針針體上,基底呈現(xiàn)出微微藍色,這是因為次甲基藍是水溶性的并且二次干燥后涂覆了PVA水溶液,導(dǎo)致次甲基藍有微量擴散到涂覆的溶液里,最終成型后留在基底上。
從以上結(jié)果可以對比分布澆鑄法和澆鑄黏合法成型的微針,比較結(jié)果見表1。兩種微針制備方法成型率和微針高度相同。但澆鑄黏合法相比較分步澆鑄成型法藥物擴散少,可以使得藥物更好地集中在微針針體上,且澆鑄黏合法可以控制基底高度,實現(xiàn)柔性基底,并且縮短微針制造周期至4 h。
表1 兩種制備微針方法效果比較
由于澆鑄黏合法制造的微針針體含藥量高、周期短,因此在測試微針強度以及透皮給藥效果的穿刺試驗中選擇澆鑄黏合法制造的微針陣列。利用含有利多卡因的5 mm×5 mm大小的微針貼片,穿刺4周齡小鼠腹部皮膚,拇指持續(xù)按壓5 min,取出微針。為了增強微針穿刺通道的顯示效果,在穿刺實驗前在微針針體外側(cè)再浸漬一層高濃度次甲基藍溶液,然后立即進行小鼠皮膚穿刺動作,微針穿刺結(jié)束后局部放大如圖4所示。小鼠皮膚上留下了微針陣列刺出的深藍色微通道,這也說明微針強度足夠刺穿皮膚,穿刺后的微針如圖5所示,微針約90 %以上已經(jīng)完全溶解。
圖4 皮膚穿刺后局部放大圖Fig.4 Partial enlargement of punctured skin
圖5 穿刺后溶解的微針陣列Fig.5 Dissolved microneedle array after puncture
使用微針穿刺結(jié)束后,小鼠皮膚放入組織固定液中固定保存24 h,然后進行冷凍切片觀察,切片效果如圖6所示,微針在皮膚上打開了一個約250 μm深度的通道。由于皮膚具有彈性,微針刺入過程皮膚壓縮,因此微通道高度小于微針針體高度。
圖6 微針穿刺冷凍切片顯微鏡結(jié)果Fig.6 Microscopic results of frozen sections ofmicroneedle punctured skin
皮膚外層深色為角質(zhì)層,下面箭頭標(biāo)注的淺色為表皮層主要部分,再往下白色部分為真皮層。微針高度使得微針剛好到達真皮層,刺穿了表皮層。微針刺穿表皮層后形成微通道,縮短了藥物有效作用位置,使得利多卡因可以直接影響到真皮層的神經(jīng)細胞,加速了利多卡因的起效速度。由于微針陣列尚未到達真皮層中的神經(jīng)分布位置,即可實現(xiàn)無痛穿刺。
(1)使用分層澆鑄法制備出微針針體含有利多卡因的分層微針,微針成型率為100 %實現(xiàn)可以精確控制載藥量、節(jié)約藥物,防止利多卡因過量引起毒性作用;
(2)相比較分步澆鑄成型法,澆鑄黏合法成型的微針陣列,成型率仍保持100 %,尤為突出的是加工周期縮短了一半以上;由于微針陣列基底單獨成型,且制備工藝相對簡單,因此澆鑄黏合法適合微針陣列的大批量成型;
(3)在小鼠腹部皮膚穿刺實驗中,90 %以上的微針針體能夠5 min內(nèi)迅速溶解,冷凍切片顯微鏡觀察顯示出制備的可溶性利多卡因微針具有良好的穿刺效果,微針針體恰好到達真皮層并且在皮膚上打開一個約250 μm的通道,達到良好的透皮效果。