潘兆軍, 田兆方, 武 榮

(1. 南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院新生兒科, 淮安 223002；2. 淮安市婦幼保健院新生兒醫(yī)學(xué)中心, 淮安 223002)

壞死性小腸結(jié)腸炎(necrotizing enterocolitis,NEC)是早產(chǎn)兒胃腸疾病死亡的主要原因，隨著新生兒救治技術(shù)的提高，極低及超低出生體質(zhì)量嬰兒生存率不斷提高，但NEC發(fā)病率及相關(guān)的死亡率并未下降。據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，出生體質(zhì)量低于1500 g的早產(chǎn)兒，NEC發(fā)病率在10%左右，死亡率在20%～30%，并且隨著疾病嚴(yán)重程度呈上升趨勢(shì)[1-3]。到目前為止，NEC的病理生理學(xué)機(jī)制仍未完全闡明，但已經(jīng)確定了早產(chǎn)、細(xì)菌定植、腸內(nèi)營(yíng)養(yǎng)和不成熟的免疫系統(tǒng)等幾個(gè)危險(xiǎn)因素[4]。大多數(shù)現(xiàn)有的NEC動(dòng)物模型都沒(méi)有在實(shí)驗(yàn)中考慮早產(chǎn)因素。剛出生的大鼠腸道隱窩和絨毛發(fā)育相當(dāng)于人類22周的孕齡[5]，而人類NEC多發(fā)生于孕齡低于32周的早產(chǎn)兒，可以模擬人類NEC發(fā)病時(shí)期建立充分表征的NEC模型，對(duì)探討NEC的發(fā)病機(jī)制及有效的預(yù)防治療措施具有重要價(jià)值。本實(shí)驗(yàn)在目前相關(guān)研究現(xiàn)狀基礎(chǔ)上，對(duì)出生后不同日齡的新生大鼠，通過(guò)人工喂養(yǎng)、缺氧、冷刺激及LPS胃內(nèi)注入等方法建立NEC大鼠模型，并對(duì)兩者進(jìn)行比較以探索適宜的NEC模型。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物與分組

妊娠18 d SPF級(jí)SD大鼠6只，購(gòu)自上海西普爾-必凱實(shí)驗(yàn)動(dòng)物有限公司[SCXK(滬)2013-0016], 飼養(yǎng)于南京醫(yī)科大學(xué)附屬淮安第一醫(yī)院動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中心[SYXK(蘇)2018-0012]。選取出生2 h及48 h SD大鼠各24只，按體質(zhì)量大小編號(hào)，2個(gè)時(shí)點(diǎn)再隨機(jī)分為人工喂養(yǎng)組(A、B組）、人工喂養(yǎng)+脂多糖(LPS)組(C、D組)、對(duì)照組(E、F組)，即2 h的A、C、E組及48 h的B、D、F組，每個(gè)亞組8只小鼠。

1.2 主要試劑及儀器

低出生體質(zhì)量嬰兒配方奶粉(超級(jí)能恩)購(gòu)自雀巢公司； 脂肪乳注射液(C6-C24)購(gòu)自華瑞制藥有限公司； 蛋白質(zhì)粉購(gòu)自湯臣倍健公司； LPS(E.coli055：B5)購(gòu)自美國(guó)Sigma公司； 胃管由24G靜脈留置針導(dǎo)管改裝； TED-60T測(cè)氧儀購(gòu)自美國(guó)Teledyne公司； 保育箱為戴維YP-90A嬰兒保育箱； 缺氧箱由戴維無(wú)接觸輸氧頭罩改裝； 37 ℃恒溫水浴箱購(gòu)自上海醫(yī)療器械廠, 4 ℃冰箱購(gòu)自青島海爾電器有限公司。

1.3 鼠乳配方奶配置步驟

參照參考文獻(xiàn)[6]稱取早產(chǎn)兒配方奶5 g、蛋白粉8 g，脂肪乳(C6-C24)50 mL，加入約80 ℃滅菌注射用水自100 mL，使用玻璃棒充分混勻，總熱量為617.4 kJ。

1.4 造模流程

A組采用24G靜脈置留置針定時(shí)經(jīng)口插管喂養(yǎng)，第1日按0.1 mL/3 h給予，隨后每24 h增加0.05 mL；B組人工喂養(yǎng)第1日按0.15 mL/3 h給予，隨后每24 h增加0.05 mL。C組、D組分別在A組、B組基礎(chǔ)上每日加用LPS 10 mg/kg(2 mg/mL稀釋于滅菌水中)1次，經(jīng)胃內(nèi)注入，連續(xù)3次。LPS灌胃時(shí)的配方奶喂養(yǎng)量=需奶量-LPS量-胃殘奶量。E、F組：僅由母鼠母乳喂養(yǎng)。

1.5 缺氧及冷刺激流程

打開(kāi)缺氧箱中的純氮?dú)馔擦髁勘恚刂频獨(dú)饬髁繛?5 L/min, 當(dāng)缺氧箱氧濃度為零時(shí)開(kāi)始計(jì)時(shí),置入實(shí)驗(yàn)大鼠，持續(xù)90 s后，隨后將其置入冰箱冷藏室中，保持環(huán)境溫度4 ℃，持續(xù)10 min，結(jié)束后放回保育箱，每12 h進(jìn)行1次缺氧+冷刺激，共6次。

1.6 處理

觀察大鼠活動(dòng)情況，所有大鼠試驗(yàn)前和試驗(yàn)后同一時(shí)間稱重，并進(jìn)行記錄。所有實(shí)驗(yàn)大鼠均于相應(yīng)實(shí)驗(yàn)時(shí)點(diǎn)的84 h空腹斷頭處死大鼠，打開(kāi)腹腔取出取回盲部近端腸管1 cm置于體積分?jǐn)?shù)10%甲醛溶液中固定，取冠狀切面，HE染色，光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行腸道組織病理評(píng)分。

1.7 腸道組織病理評(píng)分

腸道組織病理評(píng)分參考文獻(xiàn)[7]，由不參與本實(shí)驗(yàn)項(xiàng)目的揚(yáng)州大學(xué)醫(yī)學(xué)院附屬淮安市婦幼保健院病理科二位中級(jí)以上職稱人員進(jìn)行雙盲法評(píng)分，評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)如下，0分：腸黏膜絨毛完整，組織結(jié)構(gòu)正常；1分：輕微黏膜下和(或)固有層腫脹分離；2分：中度黏膜下和(或)固有層分離，黏膜下和(或)肌層水腫；3分：重度黏膜下和(或)固有層分離，黏膜下和(或) 肌層水腫，局部絨毛脫落；4分：腸絨毛消失伴腸壞死。病理評(píng)分≥2分者視為NEC造模成功。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2 結(jié)果

2.1 一般狀態(tài)及存活情況

造模后，A、C組大鼠8～12 h相繼出現(xiàn)不同程度排黃綠色黏液稀便、腹脹、體質(zhì)量減輕，隨后出現(xiàn)胃潴留、嘔吐、嗜睡，常蜷縮而臥、抱團(tuán)反應(yīng)消失、活動(dòng)度下降、反應(yīng)遲鈍, 且逐漸加重。B、D組大鼠在實(shí)驗(yàn)開(kāi)始后12 h內(nèi)即出現(xiàn)主動(dòng)活動(dòng)減少，對(duì)外界刺激反應(yīng)減緩，均出現(xiàn)不同程度出現(xiàn)腹脹和胃潴留的癥狀, 伴有排黃綠色甚至黑色稀便等大便性狀的改變，并出現(xiàn)生長(zhǎng)緩慢或體質(zhì)量不增, 以D組大鼠癥狀為重。造模期內(nèi)A組大鼠死亡2只，C組死亡3只，B、D組各有1只死亡, 6組動(dòng)物死亡率分別為25%、12.5%、37.5%、12.5%、0、0。E、F組大鼠生長(zhǎng)發(fā)育無(wú)明顯異常，體質(zhì)量增長(zhǎng)穩(wěn)定，主動(dòng)活動(dòng)及對(duì)外界刺激反應(yīng)良好，進(jìn)食及排便正常，無(wú)消化道異常表現(xiàn)。各組大鼠體質(zhì)量增長(zhǎng)情況見(jiàn)表1。

2.3 腸道組織病理學(xué)觀察

早期人工喂養(yǎng)A組(圖1A1、A2)、C組(圖1C1、C2)回盲部腸道組織壞死嚴(yán)重，腸壁絨毛大部分脫落壞死，腺體排列紊亂消失，固有層與黏膜下層重度水腫，部分樣本腸絨毛消失伴腸壞死。晚期喂養(yǎng)B組(圖1B1、B2)、D組(圖1D1、D2)腸黏膜下部分和固有層分離，肌層變薄甚至斷裂，腸壁絨毛部分脫落壞死，黏腺體結(jié)構(gòu)紊亂，部分腸管可見(jiàn)腸壁積氣。正常對(duì)照E組(圖1E1、E2)、F組(圖1F1、F2)新生鼠的腸道結(jié)構(gòu)完整，組織結(jié)構(gòu)清晰正常。上皮完整連續(xù)，腺體排列規(guī)則，絨毛高聳整齊，黏膜層、黏膜下層、固有層無(wú)充血水腫。死亡大鼠尸檢見(jiàn)腹脹明顯、部分有明顯腹水，腸道擴(kuò)張，迂曲，顏色呈黃綠色或暗紫色，部分為黑色，腸壁積氣，符合NEC病理改變。

表1 大鼠體質(zhì)量比較 g

2.4 腸道組織病理評(píng)分

2 h大鼠組腸道病理積分組間差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=47.41，P=0.000)，48 h大鼠組組間差異也有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=31.89，P=0.000)。詳見(jiàn)表2。

2.5 NEC的發(fā)生率

A、B、C、D、F、F組存活大鼠NEC發(fā)生率分別為100%(6/6)、85.71%(6/7)、100%(5/5)、100%(7/7)、0(0/8)和 0(0/8)。A、B、C、D 組NEC發(fā)生率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

自從1974年Barlow等[8]利用配方奶人工喂養(yǎng)、缺氧成功建立新生大鼠NEC模型后，此后大部分學(xué)者以此為基礎(chǔ)運(yùn)用人工喂養(yǎng)、缺氧冷刺激來(lái)建立模型[9-12]。國(guó)內(nèi)亦有通過(guò)腹腔注射LPS建立NEC模型，所致模型全身炎癥重而腸道反應(yīng)輕[13]。李美雪等[14]應(yīng)用人工喂養(yǎng)和LPS灌胃成功建立NEC大鼠模型，該方法需要30 mg/kg以上的LPS方可誘導(dǎo)出典型病理改變的NEC模型，并可誘發(fā)肝、肺等臟器嚴(yán)重充血壞死。本實(shí)驗(yàn)結(jié)合NEC的病因和機(jī)制[15]，參考不同胎齡NEC發(fā)病情況，選擇出生2 h以及48 h(2日齡)SD大鼠為研究對(duì)象，以人工喂養(yǎng)、缺氧冷刺激為基礎(chǔ)條件,選擇加或不加LPS(10 mg/kg)灌胃，均誘導(dǎo)出符合NEC臨床表現(xiàn)和組織學(xué)特征的大鼠模型。

圖1 大鼠回盲部腸道病理學(xué)觀察

表2 大鼠腸道病理積分比較

出生2 h內(nèi)造模NEC大鼠臨床癥狀重于2日齡NEC大鼠，體質(zhì)量增長(zhǎng)率低于2日齡NEC大鼠，死亡率高于2日齡NEC，大鼠病理學(xué)改變重于2日齡NEC大鼠。與臨床上孕周越小的早產(chǎn)兒NEC發(fā)病率越高、病情越重類似。這可能與早產(chǎn)時(shí)腸道Toll樣受體4(TLR4)表達(dá)量較成熟腸道明顯升高[16], 新生大鼠腸組織TLR4表達(dá)量隨時(shí)間逐漸降低[17]，且負(fù)調(diào)控不足，對(duì)腸道細(xì)菌表現(xiàn)為過(guò)度炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致腸道發(fā)生嚴(yán)重的炎癥反應(yīng)，腸組織壞死，導(dǎo)致NEC的發(fā)生。

LPS是革蘭氏陰性桿菌細(xì)胞壁的主要成分，也是穿過(guò)腸道黏膜屏障的主要炎癥分子之一[6,18]。本實(shí)驗(yàn)中同日齡加10 mg/kg LPS灌胃的臨床癥狀和病理學(xué)改變(病理積分)重于僅缺氧和冷暴露的大鼠。這可能與LPS能夠啟動(dòng)炎癥反應(yīng)，結(jié)合CD14/TLR4/MD2受體復(fù)合物，促進(jìn)炎癥細(xì)胞分泌多種細(xì)胞因子，引起強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)，并可激活補(bǔ)體系統(tǒng)和凝血系統(tǒng)等有關(guān)。

新生大鼠NEC模型可用于NEC生物標(biāo)志物研究和發(fā)病機(jī)制研究，具有價(jià)格適宜，可成批量試驗(yàn)等優(yōu)勢(shì)，但也要考慮人類和大鼠的差異，對(duì)應(yīng)激的恢復(fù)存在差異，當(dāng)使用大鼠誘導(dǎo)NEC時(shí)，大鼠對(duì)細(xì)菌污染和內(nèi)毒素具有更好的耐受性。本實(shí)驗(yàn)中具備早產(chǎn)、人工喂養(yǎng)、部分母乳接觸、缺氧、冷刺激以及LPS灌胃等多種高危因素，與新生兒NEC發(fā)病機(jī)制的最新研究相似[15]，剛出生的大鼠臨床癥狀及病理情況重于生后2 d大鼠，同日齡大鼠中加LPS灌胃的臨床癥狀和病理學(xué)改變重于未加LPS灌胃的大鼠，但都成功誘導(dǎo)出NEC模型，因此可以根據(jù)研究?jī)?nèi)容和目的進(jìn)行重新組合使用，可靠性和靈活性兼?zhèn)洹?/p>