蔣蕾， 黃冕， 趙亦卿， 李鑫東， 李冠武， 于吉利， 常時新

淫羊藿苷(icariin，ICA)在骨的代謝過程中具有雙重作用，即促進骨形成及抑制骨吸收[1-2]。有證據(jù)表明，ICA可促進間充質(zhì)干細胞成骨分化、抑制其成脂分化[3-4]。提示研究骨髓脂肪具有現(xiàn)實意義，但絕大多數(shù)研究仍停留在細胞層次，在活體動物上探討其作用的相關(guān)研究較少。

磁共振波譜成像(MRS)是普遍認可的定量評估脂肪及其代謝物的一種安全、準確、無創(chuàng)的影像檢查技術(shù)。但MRS也存在不足之處，如一次掃描僅能獲得覆蓋較小感興趣區(qū)域的代謝物信息，勻場及掃描時間長，圖像后處理復雜、繁瑣、耗時，而且在小動物成像方面受到諸多限制?；瘜W位移編碼(chemical shift encode，CSE)水-脂分離MRI，尤其是多回波T2*校正技術(shù)可準確定量分析脂肪，得到真正意義上的質(zhì)子密度脂肪分數(shù)，但需考慮T1偏倚、噪聲偏倚、T2*衰減及多脂峰模型等混雜因素。T2*校正衰減效應對定量分析骨髓或肝臟質(zhì)子密度脂肪分數(shù)(proton density fat fraction，PDFF)十分重要[5-6]。因此，本研究擬在活體水平利用CSE-MRI技術(shù)探討ICA對骨質(zhì)疏松大鼠骨髓脂肪的作用，為ICA應用于臨床實踐提供理論依據(jù)。

材料與方法

1.實驗動物及分組設(shè)計

48只3月齡雌性SD大鼠適應環(huán)境14天后，隨機均分為4組：假手術(shù)(sham-operated，SHAM)組、去卵巢(ovariectomized，OVX)對照組、OVX+雌二醇(estradiol，E2)對照組及標準劑量ICA干預組(OVX+ICA)。術(shù)后7天開始給藥(目的是使OVX大鼠血清雌二醇水平明顯降低[7])。ICA干預組給予ICA灌胃(ICA標準品，高效液像色譜證實純度>98%)，劑量為每天125 mg/kg[8]。OVX+E2對照組則給予E2，劑量為每天25 μg/kg，生理鹽水配制。SHAM組及OVX組則給予等量去離子水，給藥時間、次數(shù)與前2組相同。實驗前及實驗后每周記錄各組實驗大鼠的體重，以便于調(diào)整給藥劑量，給藥劑量每周按體重調(diào)整一次，給藥持續(xù)時間12周，每周給藥6次。

2.雙能X線吸收測量儀骨密度檢測

采用雙能X線吸收測量儀進行檢查，隨機配置有小動物成像分析軟件。利用小動物模式進行掃描，獲取實驗大鼠腰椎(L4～L5)及左側(cè)股骨的密度(bone mineral density，BMD)，單位為g/cm2。每天掃描前常規(guī)完成一次DXA質(zhì)量保證測試。本研究期間，其變異系數(shù)在0.34%～0.60%范圍內(nèi)波動。

3.CSE-MRI檢查

使用Siemens virio 3.0T MRI掃描儀和4通道相控陣大鼠專用線圈。俯臥位，常規(guī)行左側(cè)股骨冠狀面T2WI掃描后，采用3D-GRE T2*衰減校正6回波水-脂分離成像技術(shù)。掃描參數(shù)：TR 5.91 ms，TE 2.45 ms/△3.675 ms，層厚1.5 mm，視野14 cm×14 cm，翻轉(zhuǎn)角9°，矩陣192×192，帶寬650 Hz/像素，激勵次數(shù)2，掃描時間54 s。掃描結(jié)束后，多回波CSE-MRI數(shù)據(jù)采用商業(yè)MATLAB(v2014-64bit,MathWorks,Natick,MA)進行處理。選擇經(jīng)過股骨中線的圖像，在股骨遠端手工繪制ROI，避開骨皮質(zhì)。每個樣本測量2次，計算骨髓脂肪分數(shù)(marrow fat fraction，F(xiàn)F)，取其均值作為最終分析結(jié)果。

4.血清E2及骨代謝標志物

應用ELLSA試劑盒 ，通過測定吸光度(Immunodiagnostic Systems，Boldon，UK)進行標準曲線繪制，利用標準曲線來計算待測樣本的含量，指標包括E2、Ⅰ型膠原交聯(lián)C末端肽(β-CrossLaps，β-CTX)及總Ⅰ型膠原氨基端延長肽(aminoterminal propeptide of type I procollagen，PINP)。

5.骨髓脂肪細胞定量分析

左側(cè)股骨遠端使用4%多聚甲醛固定24h后，使用10% 乙二胺四乙酸脫鈣液(PH 7.3)，4℃脫鈣。每兩天更換新的脫鈣液，28天后脫鈣結(jié)束。之后進行包埋，在冠狀面方向切取4 μm厚薄片，HE染色，中性樹膠封片。采用Leica Q-win Plus圖像分析系統(tǒng)對脂肪細胞進行定量分析，每張切片上下、左右隨機選擇5個200倍光鏡視野，進行骨髓中脂肪細胞的定量計數(shù)，包括脂肪細胞平均直徑(μm)、每個視野內(nèi)脂肪細胞密度(個/mm2)及脂肪細胞總面積/骨髓面積(除骨小梁外的所有區(qū)域)的百分比(%)，將5個視野內(nèi)各指標測量值的均值作為最終分析結(jié)果。

表1 各時點四組大鼠骨密度比較

注：同時點不同組比較：與SHAM組比較，aP<0.001，fP<0.05；與OVX組比較，bP<0.001,cP<0.05。同組不同時間點比較：與基線(0周)比較，dP<0.05；與前一時點比較，eP<0.05。ΔBMD1代表較基線水平的變化率，ΔBMD為較前一個時間點的變化率。

表2 各時點四組大鼠骨髓FF值及組間比較

注：同時點不同組比較：與SHAM組比較，aP<0.001；與OVX組比較，bP<0.001，cP<0.001。同組不同時間點比較：與基線0周比較，dP<0.05，eP<0.01；與前一時點比較，fP<0.05，gP<0.01。ΔFF代表2個時間點之間FF值的變化率。

6.統(tǒng)計學處理

使用IBM SPSS 23.0統(tǒng)計軟件包，采用Shapiro-Wilk檢驗判斷數(shù)據(jù)的正態(tài)性，符合正態(tài)性分布的計量數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標準差來表示，F(xiàn)F值及BMD的組間比較采用重復測量方差分析，通過球形檢驗的結(jié)果判斷重復測量數(shù)據(jù)之間是否存在相關(guān)性后，采用重復測量的多元方差分析模型對時間與分組的交互作用進行分析，其它研究參數(shù)在多組間的比較采用單因素方差分析(多重比較Bonferronid)。以P<0.05為差異具有統(tǒng)計學意義。

結(jié) 果

1.大鼠一般情況

在造模過程中及3次MRI、DXA掃描過程中因為麻醉意外引起的大鼠死亡情況：SHAM組3只，OVX組2只、OVX+E2組1只、OVX+ICA組2只。在整個給藥過程中，不明原因死亡：OVX+E2組1只，OVX+ICA組1只。骨標本處理不當引起標本不能使用：OVX組1只、OVX+E2組1只。因此，剩余36只動物有完整的實驗數(shù)據(jù)。

2.大鼠BMD變化

表1為各組大鼠腰椎及股骨BND的動態(tài)變化。二元重復測量方差分析顯示，OVX組腰椎或股骨BMD隨時間推移呈明顯漸進性降低，與基線相比，在第6周時，腰椎及股骨BMD分別降低3.3%、5.2%；在第12周時，則分別降低9.6%、7.0%。OVX組腰椎骨丟失率從第6周的7.5%增加至第12周的14.1%，股骨骨丟失率則分別為5.4%、10.7%。二元方差分析提示，同一時間點不同組別比較，至第12周時，OVX組與SHAM組BMD差異存在統(tǒng)計學差異。E2治療，腰椎及股骨BMD值基本恢復至SHAM組水平。ICA治療，可在一定程度上恢復由于雌激素缺乏所致的骨丟失，但BMD不能恢復至SHAM組水平。

3.四組大鼠不同時間點股骨FF值的變化

在各時間點四組大鼠股骨FF值的測量值及組間比較結(jié)果見表2。在基線水平，四組FF值的差異無統(tǒng)計學意義(F=2.393，P=0.684)；而第6周和12周時，四組間FF值的差異具有統(tǒng)計學意義(F=9.692，P<0.001；F=30.456，P<0.001)。圖1為大鼠股骨各個時間點CSE-MRI圖像。重復測量方差分析示，OVX組骨髓FF值隨時間進程呈明顯增高，F(xiàn)F值在每兩個時間點的差異均有統(tǒng)計學意義；OVX組在第6周、第12周時FF值分別較基線時增高40.0%、69.4%%，而且第12周較第6周增高21.7%。二元方差分析示，在第6周和12周，OVX組FF值較SHAM組明顯增高。 E2治療后，F(xiàn)F呈現(xiàn)時序性降低；給予ICA治療后，各時間點FF值與OVX組比較，差異均有顯著統(tǒng)計學意義；而SHAM組的FF值與OVX+E2和OVX+ICA組間在各個時間點的差異均無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

圖1 SHAM組第12周大鼠股骨CSE-MRI，測量FF=13.6%。a)脂像；b)水像 。 圖2 OVX組第0周大鼠股骨CSE-MRI，F(xiàn)F=14.9%。a)脂像；b)水像。 圖3 OVX組第6周大鼠股骨CSE-MRI，F(xiàn)F=20.0%。a)脂像；b)水像。 圖4 OVX組第12周大鼠股骨CSE-MRI，F(xiàn)F=27.1%。a)脂像；b)水像。圖5 OVX+E2組第12周大鼠股骨CSE-MRI，F(xiàn)F=14.0%。a)脂像；b)水像 。 圖6 OVX+ICA組第12周大鼠股骨CSE-MRI，F(xiàn)F=15.6%。a)脂像；b)水像。

圖7 骨髓組織病理圖(×200，HE)。a)SHAM組，可見骨髓腔內(nèi)有散在分布的脂肪細胞及骨小梁 ；b)OVX組，可見脂肪細胞明顯增多、增大，骨小梁稀疏；c)E2組，脂肪細胞減少、體積縮小；d)ICA組，可見脂肪細胞減少，體積縮小，骨小梁結(jié)構(gòu)較OVX組增多。

表3 各組動物血清雌二醇及骨代謝指標的比較

注：a與SHAM組比較，P<0.01；b與OVX組比較，P<0.01；c與E2組比較，P<0.05；d與SHAM組比較，P=0.001；e與OVX組比較，P<0.01。

4.四組大鼠血清E2及骨代謝標記物變化

四組大鼠血清E2及骨代謝標記物的測量值及組間比較結(jié)果見表3。OVX術(shù)后，E2水平明顯下降，外源性補充E2，可維持血清E2水平。與SHAM組相比，OVX+E2組血清E2水平無明顯差異。給予ICA治療，血清E2水平高于OVX組而低于SHAM組和OVX+E2組(P均<0.05)。與SHAM組相比，OVX 組的PINP和CTX水平均升高(P<0.01)，且CTX增高的程度比PINP顯著。與OVX組相比，OVX+ICA組的PINP增高、而CTX降低(P<0.01)。

表4 各組動物骨髓脂肪細胞定量分析結(jié)果

注：a與SHAM比較，P<0.001；b與OVX比較，P<0.001。

5.四組大鼠骨髓脂肪細胞定量分析

四組大鼠骨髓脂肪細胞定量分析結(jié)果見表4、圖7。與SHAM組相比，OVX組骨髓脂肪細胞4個指標值均明顯升高(P<0.001)，分別增高163%、29.5%、57.3%和40.0%；與OVX組相比，OVX+E2組和OVX+ICA組骨髓脂肪細胞4個指標值均明顯降低(P<0.001)；骨髓脂肪細胞4個指標值在OVX+E2及OVX+ICA組間的差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)。

討 論

CSE-MRI在評估脂肪組織方面不僅可提供定量及定性信息，而且考慮了骨髓內(nèi)脂肪組織空間分布不均質(zhì)性的問題。而且，CSE-MRI PDFF還能反映骨髓脂肪組織空間分布的不均質(zhì)性[5]。T2*校正對CSE-MRI準確定量分析脂肪含量相當重要，尤其是骨髓腔內(nèi)因骨小梁的存在可導致局部磁場不均勻，縮短水和脂肪的T2值[9,10]。多數(shù)CSE-MRI研究中，假定水及脂肪具有相同T2*值，以此對T2*進行校正，提供對脂肪定量的準確性[11]。它適于肝臟脂肪的定量分析，因為在肝臟中脂肪含量相對來說比較低。實際上水及脂肪具有各自特定的T2*值，尤其是在脂肪豐富區(qū)域，如骨髓腔[6,12]。Karampinos等[13]利用先前測定的骨髓水及脂肪T2值，利用T2*校正方法消除由于H2O及脂質(zhì)子T2*差異所導致的測量腰椎骨髓PDFF時的誤差。本研究中，基于T2*校正方法采用6回波采集方式，較好的平衡了T2*衰減效應及采集時間，獲得真正含義上的質(zhì)子密度脂肪分數(shù)(PDFF)。

本研究發(fā)現(xiàn)，OVX術(shù)后給予ICA干預12周，可提高OVX大鼠血清PINP水平，并降低CTX水平，與以往研究結(jié)果相一致，即ICA可促進骨形成、抑制破骨細胞活性作用而降低骨吸收[14]。

近期的一些研究中也提出，ICA可以調(diào)控干細胞的成脂分化[1,3]。謝小偉等[3]證實了ICA可以在一定程度上減少超生理劑量糖皮質(zhì)激素對Wnt信號通路的抑制作用，進而促進間充質(zhì)干細胞的成骨分化、抑制其成脂分化。然而，目前的絕大多數(shù)研究數(shù)據(jù)仍然是停留在離體細胞水平，其組織細胞的生存環(huán)境在很大程度上有異于體內(nèi)，離體研究所得結(jié)果尚需要得到活體研究結(jié)果的支持。正因為此，本研究將利用CSE-MRI技術(shù)從活體水平論證ICA對OVX骨髓脂肪的作用。

本研究中在給予OVX大鼠ICA治療后，基于CSE-MRI技術(shù)測量骨髓FF值的動態(tài)變化，結(jié)果顯示ICA組骨髓脂肪含量在實驗過程中與SHAM組比較無明顯差異。而且，骨髓組織病理切片的結(jié)果進一步表明應用了ICA后，不論是骨髓脂肪細胞面積百分比還是脂肪細胞周長、密度及直徑均減小，提示脂肪細胞的生成得到抑制?？傊鲜鼋Y(jié)果表明，ICA能夠很好的逆轉(zhuǎn)由于OVX引起的骨髓脂肪增多。

來源于老齡鼠的原代骨髓基質(zhì)細胞中的成骨性標志基因的表達下降同時伴隨PPAR-2的表達上升。相反，抑制間充質(zhì)干細胞成脂則可增強骨的形成。例如，給予PPAR-2拮抗劑在抑制間充質(zhì)干細胞成脂分化的同時，可促進其成骨分化，使得骨形成增多[15]。已經(jīng)證實骨髓脂肪組織可分泌許多脂肪細胞因子或炎性因子如TNF-α、瘦素和脂聯(lián)素等；其次，骨髓脂肪細胞也能產(chǎn)生脂肪酸，對成骨細胞表現(xiàn)出脂毒性作用[15,16]。臨床研究也表明，骨髓脂肪含量與骨量、骨質(zhì)量存在負性相關(guān)，骨髓脂肪增多被視為骨脆性的標志[17]。反之，降低骨髓脂肪容積可看成是骨質(zhì)量增高的標志[16,18]。

骨骼與脂肪組織的關(guān)系非常復雜，雖然大量的數(shù)據(jù)包括細胞基因水平、組織病理學和臨床研究都證實骨髓脂肪與骨質(zhì)量存在“此消彼長”的關(guān)系，骨髓脂肪組織形成增多可負性調(diào)節(jié)骨的形成，降低骨髓脂肪含量則可促進骨的形成。然而，骨及骨髓脂肪可能存在著各自獨立的調(diào)節(jié)機制，即在某些情況下，骨的代謝與骨髓脂肪的有無和多少無明顯相關(guān)性。例如，雖然很多動物物種如限制熱卡的小鼠或大鼠表現(xiàn)出骨髓脂肪異常增多伴有骨質(zhì)受損[19]，但新西蘭大白兔同樣限制熱卡也可出現(xiàn)骨質(zhì)丟失，然而并不出現(xiàn)骨髓脂肪肥胖[20]。骨髓脂肪細胞基因敲除的雌性小鼠，出現(xiàn)骨髓脂肪缺失，但并不能阻止OVX導致的骨質(zhì)衰退[21]，這也提示“無脂”并不能維持或促進骨形成。

綜上所述，雌激素缺乏狀態(tài)下骨髓脂肪容積增多，早期給予ICA干預可逆轉(zhuǎn)上述病理狀態(tài)。這提示ICA抗骨質(zhì)疏松的機制除了其雙重作用(即促進成骨及抑制破骨)外，抑制雌激素缺乏所致的骨髓脂肪形成也是其抗骨質(zhì)疏松的可能機制之一。多回波CSE-MRI對藥物抗骨質(zhì)疏松相關(guān)的骨髓脂肪的機制研究提供補充信息。