徐麗華，蘭勝芝，李軍星，余斌，張鵬超，李寶臣，袁秀芳*

(1.浙江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所，浙江 杭州 310021； 2.浙江詩(shī)華諾倍威生物技術(shù)有限公司，浙江 杭州 310018)

支原體(mycoplasma)是一種介于病毒和細(xì)菌之間的多形性微生物，廣泛存在于人體、畜禽、昆蟲(chóng)、植物及土壤污水等自然界中[1]，能引起人、動(dòng)物和植物的多種疾病，且大都具有傳染性[2-3]。在養(yǎng)豬業(yè)中，現(xiàn)已證實(shí)的支原體有豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬滑液支原體、豬腹支原體、豬喉支原體、豬絮狀支原體等[3]。豬肺炎支原體能引起豬的一種低死亡率、高發(fā)病率的慢性呼吸道傳染病，患病豬只生長(zhǎng)緩慢，飼料利用率低下[3-4]；豬鼻支原體定植于仔豬呼吸道表面，能引起豬的多發(fā)性漿膜炎、中耳炎和關(guān)節(jié)炎；豬滑液支原體感染關(guān)節(jié)和扁桃體，引起豬的軟骨病和關(guān)節(jié)炎[5]。這3種支原體或與其他呼吸系統(tǒng)疾病混合感染，導(dǎo)致豬死亡率升高，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)嚴(yán)重的經(jīng)濟(jì)損失。近年來(lái)，浙江省生豬存欄量增加，飼養(yǎng)密度高，豬病特別是呼吸道疾病發(fā)生率居高不下。本實(shí)驗(yàn)室對(duì)2014—2018年浙江省內(nèi)送檢的臨床疑似病豬進(jìn)行3種豬支原體的流行病學(xué)調(diào)查，旨在了解浙江省3種支原體的流行狀況，為制定有效的防治措施提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 樣品來(lái)源

豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬滑液支原體陽(yáng)性樣品由本實(shí)驗(yàn)室分離鑒定保存。臨床案例為2014—2018年采集自浙江省不同規(guī)模豬場(chǎng)，具有關(guān)節(jié)腫脹、肺小葉實(shí)變、心包積液等臨床疑似支原體病變豬只。

1.2 試劑和儀器

病毒DNA提取試劑盒購(gòu)自上海申能博彩生物科技有限公司(L0t0507)，Taq DNA聚合酶、1 000 bp DNA Marker、dNTPs等購(gòu)自上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司，無(wú)水乙醇等化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.3 引物合成

參考Stakenborg等[6]公布的引物序列，委托上海生工生物工程技術(shù)有限公司合成。

1.4 DNA模板制備

從-70 ℃取出臨床病料0.1 g，置于Eppendorf管中，加入pH 7.0 PBS緩沖液0.5 mL，勻漿機(jī)碾磨成勻漿，離心取上清0.1 mL。按照病毒DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作，提取DNA模板于-20 ℃保存。

1.5 PCR擴(kuò)增

用提取的3種支原體DNA作為模板，分別擴(kuò)增3種支原體基因片段。反應(yīng)體系分別為25 μL，在PCR反應(yīng)管中分別加入10×PCR Buffer 2.5 μL、2.5 mM dNTPs 2.0 μL、上、下游引物各1.25 μL、DNA模板2.5 μL、Taq酶0.2 μL、雙蒸水15.3 μL。擴(kuò)增條件為：95 ℃ 5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，35個(gè)循環(huán)；最后72 ℃延伸10 min。反應(yīng)完成后，取5 μL PCR產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，用BIO-RAD成像系統(tǒng)觀察拍照。

2 結(jié)果與分析

2014—2018年，浙江省不同縣市的養(yǎng)豬場(chǎng)采集臨床疑似病料238份，分別進(jìn)行豬肺炎支原體、豬鼻支原體、豬滑液支原體擴(kuò)增，擴(kuò)增片段分別為1 000、1 129、754 bp。

結(jié)果(圖1)顯示，臨床疑似樣品中豬肺炎支原體檢測(cè)陽(yáng)性數(shù)為45份，陽(yáng)性率18.9%；豬鼻支原體陽(yáng)性數(shù)為105份，陽(yáng)性率為44.1%；豬滑液支原體陽(yáng)性數(shù)為0。

M—1 000 bp DNA Marker；1—臨床樣品；2—陰性對(duì)照；3—陽(yáng)性對(duì)照。A—豬肺炎支原體；B—豬鼻支原體；C—豬滑液支原體。圖1 3種支原體的PCR擴(kuò)增結(jié)果

在不同年份檢測(cè)3種豬支原體病原，其中2014—2018年分別檢測(cè)58、74、45、38、23份。2014—2018年豬肺炎支原體陽(yáng)性率分別為12.1%、20.3%、20.0%、34.2%、4.3%；豬鼻支原體陽(yáng)性率分別為51.8%、47.3%、40%、42.1%、26.1%；豬滑液支原體陽(yáng)性率均為0。2014—2018年，豬肺炎支原體和豬鼻支原體發(fā)生混合感染24份，分別為5、10、5、4和0份，兩者混合感染比例為10.08%。

3 討論

豬肺炎支原體、豬鼻支原體和豬滑液支原體能引起患病豬關(guān)節(jié)腫大，心包積液，咳嗽、氣喘等呼吸道癥狀，已經(jīng)成為豬場(chǎng)的常見(jiàn)病和慢性多發(fā)病，因其常發(fā)生混合感染和繼發(fā)感染，已嚴(yán)重危害養(yǎng)豬業(yè)的發(fā)展。目前檢測(cè)支原體的方法主要有分離培養(yǎng)、血清學(xué)法和PCR方法等。豬支原體分離培養(yǎng)條件苛刻，且生長(zhǎng)速度緩慢，需要1周甚至更長(zhǎng)時(shí)間才能觀察其形態(tài)，也容易造成實(shí)驗(yàn)環(huán)境污染。血清學(xué)方法可檢測(cè)豬肺炎支原體和豬滑液支原體的抗體水平，不能直接反映病原感染情況。本試驗(yàn)采用PCR方法，從疑似病料中分別檢測(cè)3種支原體的感染情況，給養(yǎng)殖場(chǎng)確診疫病提供了快速準(zhǔn)確的方法。

調(diào)查發(fā)現(xiàn)，豬滑液支原體檢出率為0，說(shuō)明該病原近幾年在浙江省地區(qū)沒(méi)有流行。豬肺炎支原體、豬鼻支原體檢出率分別為18.9%、44.1%，豬鼻支原體感染率明顯高于豬肺炎支原體，與Joyce等[7]對(duì)江蘇省豬肺炎支原體和豬鼻支原體感染的調(diào)查結(jié)果符合。實(shí)際生產(chǎn)中，大部分豬場(chǎng)均會(huì)接種豬肺炎支原體疫苗，尚無(wú)豬鼻支原體疫苗，且一般抗菌藥物對(duì)豬鼻支原體治療效果不佳，導(dǎo)致豬場(chǎng)豬鼻支原體發(fā)病率高于豬肺炎支原體。同時(shí)，豬鼻支原體可能污染PK-15等細(xì)胞，導(dǎo)致豬瘟疫苗、豬藍(lán)耳病疫苗等細(xì)胞苗污染，在豬場(chǎng)免疫接種時(shí)同時(shí)接種了豬鼻支原體。研究發(fā)現(xiàn)，豬肺炎支原體和豬鼻支原體混合感染病例24份，混合感染比例10.08%，說(shuō)明豬場(chǎng)發(fā)病豬存在兩者混合感染的現(xiàn)象。2018年8月，由于豬場(chǎng)疫病暴發(fā)，各地豬場(chǎng)嚴(yán)進(jìn)嚴(yán)出，臨床病料減少，豬支原體檢出率下降。2014—2017年，豬肺炎支原體檢出率有逐年上升趨勢(shì)，豬鼻支原體每年略有下降。分析原因，近幾年臨床上大量使用支原凈等抗生素，導(dǎo)致豬肺炎支原體耐藥性越來(lái)越嚴(yán)重，豬肺炎支原體發(fā)病率有所反彈[8]。另外，2014年豬常見(jiàn)疫苗中豬鼻支原體污染嚴(yán)重，疫苗免疫時(shí)人為接種豬群可能性大，隨著豬場(chǎng)及經(jīng)銷商對(duì)豬鼻支原體污染細(xì)胞培養(yǎng)物問(wèn)題的重視，近幾年豬鼻支原體污染逐漸減少。