孫亞男，林茹，潘曉陽，陳月，陶磊，郭長虹

(哈爾濱師范大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，黑龍江省分子細(xì)胞與遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，黑龍江 哈爾濱 150000)

在自然界中存在許多限制植物生長的非生物脅迫因子，其中對(duì)植物生長影響較大的是土壤鹽分和低溫，嚴(yán)重時(shí)會(huì)造成植物生長緩慢及農(nóng)作物減產(chǎn)[1-2]。植物經(jīng)過長時(shí)間的進(jìn)化，在細(xì)胞、分子、形態(tài)結(jié)構(gòu)和生理代謝上形成了一系列復(fù)雜的脅迫應(yīng)答機(jī)制，來感知并應(yīng)對(duì)外界的脅迫環(huán)境[3]。脅迫環(huán)境誘導(dǎo)植物體內(nèi)的大量相關(guān)基因表達(dá)[4]，其中多種類型的轉(zhuǎn)錄因子在植物的抗逆應(yīng)答中起到重要作用。

鋅指蛋白(zinc-finger protein)是植物應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫的一類重要調(diào)節(jié)因子[5]。鋅指蛋白根據(jù)保守基序的特點(diǎn)一共分為9類，分別是C2H2、C4、C6、C8、Cys3HisCys4、Cys2HisCys、Cys2HisCys5、Cys3His和Cys4HisCys3，其中以C2H2型居多[6]。研究表明，擬南芥(Arabidopsisthaliana)的C2H2型鋅指轉(zhuǎn)錄因子在干旱，鹽以及ABA(脫落酸，abscisic acid)處理早期被誘導(dǎo)；大豆(Glycinemax)中的C2H2型鋅指蛋白基因SCOF-1可以增強(qiáng)轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性[7]。說明C2H2型鋅指蛋白對(duì)于增強(qiáng)植物對(duì)鹽、干旱和冷脅迫的抗性具有重要作用。本實(shí)驗(yàn)室之前對(duì)紫花苜蓿(Medicagosativa)的低溫轉(zhuǎn)錄組分析中發(fā)現(xiàn)ZAT10上調(diào)表達(dá)，然而目前關(guān)于紫花苜蓿ZAT10基因是否參與非生物脅迫應(yīng)答尚未有報(bào)道。肇東苜蓿(M.sativacv. Zhaodong)為紫花苜蓿的地方性品種，具有較強(qiáng)的抗寒、抗鹽堿等特性[8]。本研究以肇東苜蓿為材料，克隆其MsZAT10基因，運(yùn)用生物信息學(xué)方法分析其蛋白結(jié)構(gòu)域特征及同源性。構(gòu)建MsZAT10植物表達(dá)載體，轉(zhuǎn)化煙草(Nicotianatabacum)，在低溫及鹽脅迫條件下對(duì)轉(zhuǎn)基因煙草進(jìn)行相關(guān)表型分析。為揭示MsZAT10基因的功能，通過轉(zhuǎn)基因技術(shù)提高植物抗逆境能力奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

MsZAT10基因從肇東苜蓿中克隆得到；用于轉(zhuǎn)化的植物材料為煙草(N.tabacumcv. SR-1)；DNA膠回收試劑盒、RNA提取試劑盒、質(zhì)粒提取試劑盒均來自TIANGEN公司；反轉(zhuǎn)錄試劑盒來自TOYOBO公司；Gelmini Purification Kit(ZOMANBIO)膠回收試劑盒來自TAKARA公司。大腸桿菌Top10、根瘤農(nóng)桿菌EHA105、克隆載體pMD18-T Vector和表達(dá)載體pCBM均由本實(shí)驗(yàn)室提供，試驗(yàn)時(shí)間為2014-2016年。

1.2 紫花苜蓿葉片RNA的提取

將紫花苜蓿的組培苗馴化移入蛭石和土混合(1∶1)的基質(zhì)中，在室溫(25 ℃，16 h光照)條件下培養(yǎng)1個(gè)月左右，每周澆Hoagland營養(yǎng)液2～3次。將培養(yǎng)1個(gè)月的紫花苜蓿置于4 ℃條件下處理4 h，取其葉片用液氮快速冷凍，用RNA提取試劑盒(TIANGEN)提取RNA，在-80 ℃中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 MsZAT10基因的克隆

以紫花苜蓿葉片RNA為模板，利用反轉(zhuǎn)錄試劑盒獲得cDNA。反應(yīng)結(jié)束后，將其保存于-20 ℃。根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序獲得紫花苜蓿MsZAT10基因序列，應(yīng)用Primer 3軟件設(shè)計(jì)克隆引物 (表1)。將上一步獲得的cDNA進(jìn)行稀釋，利用ExTaqDNA polymerase (5 U·μL-1)進(jìn)行PCR擴(kuò)增。反應(yīng)體系包含模板DNA (50 ng·μL-1) 10 μL、10×PCR Buffer 5 μL、dNTP Mix 4 μL、ExTaq DNA polymerase 0.25 μL、正、反向引物(10 μmol·L-1)各2 μL，用ddH2O補(bǔ)足50 μL。反應(yīng)條件為94 ℃ 5 min、94 ℃ 30 s、53.5 ℃ 30 s、72 ℃ 65 s、30個(gè)循環(huán)。用1%瓊脂糖凝膠分離PCR產(chǎn)物，將目的片段用膠回收試劑盒回收后與pMD18-T Vector載體連接，送至上海生工公司測(cè)序。

表1 本研究中所用的引物

1.4 生物信息學(xué)分析

利用Contig Express軟件對(duì)測(cè)序結(jié)果進(jìn)行拼接，通過在線ORF Finder(https://www.ncbi.nlm.nih.gov/orffinder/)找到MsZAT10基因的開放讀碼框。利用SMART軟件對(duì)MsZAT10開放讀碼框氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，將預(yù)測(cè)的MsZAT10的氨基酸序列利用NCBI protein BLAST進(jìn)行比對(duì)，同MtZAT10蛋白的結(jié)構(gòu)域比較，利用Clustal X 2.1軟件找出其所相對(duì)應(yīng)的結(jié)構(gòu)域中氨基酸的差異位點(diǎn)。從NCBI獲取蒺藜苜蓿(Medicagotruncatula)、大豆等其他物種ZAT10同源的氨基酸序列，利用Clustal X 2.1和MEGA 4軟件進(jìn)行比對(duì)并構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

1.5 轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草的獲得及qRT-PCR檢測(cè)

將MsZAT10基因與pMD18-T Vector載體連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒，進(jìn)行PCR和酶切檢測(cè)，篩選出正向插入的陽性克隆，用PstⅠ和SacⅠ對(duì)pMD18-T-MsZAT10和pCBM進(jìn)行酶切并連接，然后進(jìn)行PCR和酶切鑒定，獲得植物表達(dá)載體pCBM-MsZAT10。利用凍融法將陽性克隆轉(zhuǎn)入到農(nóng)桿菌EHA105中，采用葉盤法對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化[9]，經(jīng)過草丁膦(phosphinothricin, PPT)抗性篩選和PCR鑒定，獲得轉(zhuǎn)基因煙草植株。

將長勢(shì)相對(duì)一致，生長狀態(tài)良好的轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草進(jìn)行qRT-PCR，選取的植株為OX1，OX2，OX3，OX5，OX15，OX21，OX22，OX23，OX24(過表達(dá)株系overexpression line 1、2、3、5、15、21、22、23和24號(hào))。應(yīng)用Primer 3軟件設(shè)計(jì)PCR定量引物，引物序列(表1，其中GAPDH為內(nèi)參基因)，引物退火溫度為55 ℃左右，引物長度20 nt，GC含量40%～60%，擴(kuò)增片段長度180～250 bp。使用TOYOBO公司qRT-PCR試劑盒(THUNDERBIRD SYBR?qPCR Mix)，每個(gè)樣品設(shè)置3次技術(shù)重復(fù)，qRT-PCR反應(yīng)總體系20 μL，內(nèi)含SYBR 10 μL、50×ROX 0.4 μL、上下游引物各0.8 μL、模板2 μL、ddH2O 6 μL。反應(yīng)程序?yàn)?5 ℃ 5 min、94 ℃ 15 s、55 ℃ 30 s，40個(gè)循環(huán)；72 ℃ 30 s、95 ℃ 15 s、60 ℃ 20 s、95 ℃ 15 s。其中最后一步為擴(kuò)增產(chǎn)物的溶解曲線分析。定量結(jié)果采用比較2-ΔΔCT法[10]計(jì)算基因表達(dá)量。

1.6 低溫處理下轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草表型的觀察和電導(dǎo)率的測(cè)定

選取大小及生長狀態(tài)一致的4周齡轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草和野生型煙草，將其先置于4 ℃條件下處理4 h，之后再繼續(xù)降溫至-4 ℃條件下處理2 h，觀察其表型變化。參照Zhao等[11]測(cè)定相對(duì)電導(dǎo)率，取低溫處理后的轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草和野生型煙草的第2～3片葉子，每片葉子用直徑約5 mm的打孔器進(jìn)行打孔，將煙草葉圓片放于20 mL去離子水(大約為10個(gè)葉圓片)，通過真空泵抽真空15 min，靜置20 min后，利用電導(dǎo)儀測(cè)得S1。再煮沸20 min，涼置室溫，測(cè)得S2，S1/S2×100%即為電導(dǎo)率。每個(gè)處理設(shè)置3次重復(fù)。

1.7 轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草的鹽脅迫處理方法

選取大小及生長狀態(tài)一致的4周齡轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草和野生型煙草用直徑9 mm的打孔器在葉片的相同部位打孔(打孔時(shí)盡量避免葉脈部分)，將取得的葉圓片浸泡在含有300 mmol·L-1NaCl的1/2MS溶液中，觀察葉片變化。采用80%丙酮抽提比色法測(cè)定葉片中葉綠素含量[12]。

1.8 生理指標(biāo)測(cè)定

選取大小及生長狀態(tài)一致的4周齡轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草和野生型煙草，將低溫處理組置于0 ℃，對(duì)照組置于25 ℃培養(yǎng)5 h后，取煙草第2～3片葉子，每份0.1 g稱好后采用硫代巴比妥酸(thiobarbituric acid，TBA)比色法測(cè)定丙二醛(malondialdehyde,MDA)含量[12]、采用考馬斯亮藍(lán)G-250染色法測(cè)定可溶性蛋白含量[13]、采用酸性茚三酮法測(cè)定脯氨酸含量[13]。所有指標(biāo)測(cè)定均設(shè)置3次重復(fù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

所有試驗(yàn)均設(shè)置3次重復(fù)，所用數(shù)據(jù)為3次重復(fù)的平均值。用生物統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件SPSS 13.0對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行顯著性分析，數(shù)據(jù)用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差(mean±SE)表示。兩組以上采用單因素方差分析(One-way ANOVA)進(jìn)行檢驗(yàn)分析，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)。兩組之間采用t檢驗(yàn)，*代表P<0.05；**代表P<0.01；***代表P<0.001。

2 結(jié)果與分析

2.1 紫花苜蓿MsZAT10基因的克隆及蛋白結(jié)構(gòu)域分析

提取紫花苜蓿總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，以cDNA為模板，根據(jù)轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)MsZAT10的上下游克隆引物，利用RT-PCR技術(shù)擴(kuò)增MsZAT10，將其克隆到pMD18-T Vector。經(jīng)測(cè)序該基因全長762 bp，編碼253個(gè)氨基酸。利用軟件SMART對(duì)MsZAT10開放讀碼框氨基酸序列進(jìn)行結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)，發(fā)現(xiàn)MsZAT10含有2個(gè)單C2H2型的保守結(jié)構(gòu)域(圖1)，有典型的QALGGH保守基序，屬于C2H2型鋅指蛋白。

圖1 MsZAT10的蛋白結(jié)構(gòu)域

圖2 物種間的ZAT10構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹

2.2 MsZAT10氨基酸序列同源性分析

將紫花苜蓿MsZAT10氨基酸序列與蒺藜苜蓿、大豆等10種不同物種的ZAT10氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，利用MEGA 4制作系統(tǒng)進(jìn)化樹，得知MsZAT10與大豆、花生(Arachishypogaea)等物種中ZAT10氨基酸序列的親緣關(guān)系較近，與蒺藜苜蓿序列的親緣關(guān)系最近(圖2)。通過NCBI protein BLAST對(duì)MsZAT10的氨基酸序列進(jìn)行分析，與蒺藜苜蓿的氨基酸相似性為76%。MsZAT10的氨基酸序列與MtZAT10的保守結(jié)構(gòu)域相同，非保守結(jié)構(gòu)域氨基酸序列差異很大。MsZAT10的氨基酸序列與MtZAT10的氨基酸序列相比有30個(gè)缺失、31個(gè)替換以及32個(gè)插入(圖3)。

圖3 MsZAT10和MtZAT10氨基酸的比對(duì)

2.3 植物表達(dá)載體pCBM-MsZAT10的構(gòu)建與轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草的qRT-PCR檢測(cè)

用PstⅠ和SacⅠ對(duì)pMD18-T-MsZAT10和pCBM進(jìn)行酶切并連接，然后進(jìn)行PCR和酶切鑒定，獲得植物表達(dá)載體pCBM-MsZAT10(圖4)。通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法對(duì)煙草進(jìn)行遺傳轉(zhuǎn)化，獲得PCR陽性植株25株。通過qRT-PCR(表1)分析轉(zhuǎn)基因煙草中MsZAT10的表達(dá)量(圖5)，結(jié)果顯示，MsZAT10在轉(zhuǎn)基因煙草中均有表達(dá)，其中有3個(gè)株系的MsZAT10基因表達(dá)量較高，分別是OX3、OX15和OX23，因此后續(xù)研究以這3個(gè)轉(zhuǎn)基因株系為材料。

圖4 植物pCBM-MsZAT10過表達(dá)載體的構(gòu)建

2.4 轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草低溫脅迫表型及電導(dǎo)率分析

圖5 過表達(dá)MsZAT10幼苗中的MsZAT10表達(dá)水平

選取大小及生長狀態(tài)一致的4周齡轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草和野生型煙草置于4 ℃處理4 h后，再置于-4 ℃處理2 h，觀察表型變化，可以看到轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草葉片的萎蔫程度明顯低于野生型煙草(圖6A)。測(cè)煙草葉片的電導(dǎo)率發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草葉片的電導(dǎo)率比野生型煙草低。其中OX23的電導(dǎo)率較野生型煙草相比下降了21.47%，其次是OX3下降了18.07%，最后是OX15下降了15.31%。說明轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草的細(xì)胞質(zhì)膜受損傷程度較野生型煙草輕(圖6B)，說明轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草具有較強(qiáng)的抗寒能力。

2.5 低溫脅迫下轉(zhuǎn)基因煙草生理指標(biāo)的測(cè)定

選取大小及生長狀態(tài)一致的4周齡轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草和野生型煙草經(jīng)0 ℃處理5 h，取葉片測(cè)定其生理指標(biāo)(圖 7)。低溫處理后，3個(gè)轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草的脯氨酸和可溶性蛋白含量均顯著高于野生型煙草，其中OX3較野生型相比升高55%和52%，OX15升高48%和42%，OX23升高62%和57%。而3個(gè)轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草的MDA含量明顯低于野生型煙草，其中OX3較野生型相比下降38%、OX15下降31%、OX23下降35%。以上結(jié)果表明轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草具有較強(qiáng)的抗寒能力。

圖6 低溫處理后WT和轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草的表型和電導(dǎo)率

圖7 低溫脅迫下WT和轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草的生理指標(biāo)

圖8 在300 mmol·L-1 NaCl處理下，WT和轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草的表型和葉綠素含量

2.6 轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草耐鹽性分析

取葉圓片，在300 mmol·L-1NaCl中處理(圖 8A)，隨著時(shí)間的增長轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草和野生型煙草的葉圓片均受到不同程度的鹽脅迫損傷。處理4 d后觀察到野生型煙草葉圓片白化，而轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草葉圓片保持綠色。對(duì)照組中轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草和野生型煙草的葉綠素含量差異不顯著，但在處理組中轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草的葉綠素含量顯著高于野生型煙草，其中最高的是OX15，比野生型高82%；其次是OX23，比野生型高81%；最后是OX3，比野生型高62%(圖 8B)。以上結(jié)果表明，轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草具有較強(qiáng)的抗鹽能力。

3 討論與結(jié)論

C2H2型鋅指蛋白家族是植物中轉(zhuǎn)錄因子數(shù)目居多的龐大家族，功能也較復(fù)雜。研究表明，C2H2型鋅指蛋白廣泛參與植物生長和發(fā)育等生物過程，包括表皮形成，種子發(fā)芽，花器官發(fā)育，主要的microRNA生物合成等[14]。一些C2H2型鋅指蛋白也參與了非生物脅迫應(yīng)答。近年來克隆獲得了許多與非生物脅迫相關(guān)的植物鋅指蛋白基因，這些基因在應(yīng)對(duì)外界不利的環(huán)境中發(fā)揮了重要的作用。Zhang等[15]從番茄(Lycopersiconesculentum)克隆到C2H2型基因SlCZFP1，該基因受低溫、干旱、鹽脅迫誘導(dǎo)，過表達(dá)SlCZFP1可顯著提高轉(zhuǎn)基因擬南芥的低溫抗性。擬南芥ZAT18基因受干旱脅迫誘導(dǎo)，過表達(dá)ZAT18基因的擬南芥植株表現(xiàn)出較強(qiáng)的干旱抗性，而該基因的突變體則降低了對(duì)干旱脅迫的抗性[16]。番茄的SIZF3基因被鹽誘導(dǎo)，轉(zhuǎn)SIZF3基因的番茄和擬南芥表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗鹽性[17]。小麥(Triticumaestivum)的一個(gè)新型C2H2型鋅指蛋白TaZNF的編碼基因受鹽脅迫誘導(dǎo)。轉(zhuǎn)TaZNF擬南芥植株，會(huì)極大地增強(qiáng)耐鹽能力[11]。在紫花苜蓿低溫脅迫轉(zhuǎn)錄組測(cè)序工作中，發(fā)現(xiàn)MsZAT10基因明顯上調(diào)表達(dá)，暗示該基因可能在紫花苜蓿抵抗低溫脅迫過程中發(fā)揮重要作用。ZAT10屬于雙鋅指結(jié)構(gòu)域類的鋅指蛋白，有研究表明ZAT10參與植物不依賴ABA的低溫信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑，還受到上游ZAT12與CBFs信號(hào)通路的調(diào)控，同時(shí)下游的低溫相關(guān)基因COR被其調(diào)控[18]。此外還有研究表明，MAPK激酶磷酸化途徑可能直接調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄因子ZAT10[19-20]。本研究克隆獲得的MsZAT10基因具有2個(gè)鋅指蛋白結(jié)構(gòu)域(圖1)，有典型的QALGGH保守基序(圖3)，屬于C2H2型鋅指蛋白。紫花苜蓿MsZAT10與蒺藜苜蓿MtZAT10的氨基酸有76%的同源性，有93個(gè)氨基酸差異位點(diǎn)，其中有31個(gè)替換、30個(gè)缺失以及32個(gè)插入(圖3)。肇東苜蓿為多年生牧草，具有較強(qiáng)的抗寒、抗鹽堿等抗逆能力，這些氨基酸差異可能是MsZAT10在肇東苜?？鼓嫘灾衅鹱饔玫年P(guān)鍵位點(diǎn)。

為了研究MsZAT10在抗逆方面的功能，本研究通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)法獲得過表達(dá)MsZAT10的煙草。在低溫和鹽脅迫下，轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草表現(xiàn)出較強(qiáng)的抗性表型。同時(shí)，在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草的脯氨酸和可溶性蛋白含量都高于野生型煙草，而MDA含量低于野生型煙草。在逆境脅迫下，植物體內(nèi)會(huì)積累大量的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，這些物質(zhì)的含量變化可以作為評(píng)價(jià)植物耐受性的指標(biāo)之一。其中最常見的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)是脯氨酸和可溶性蛋白，其積累量與植物的抗逆性呈正相關(guān)[21]。比如，轉(zhuǎn)枳(Poncirustrifoliata)PtrZPT2-1基因的煙草，在低溫和鹽脅迫下積累了更多的游離脯氨酸[22]，轉(zhuǎn)OsMSR15基因的擬南芥，在干旱脅迫下，積累了更多的游離脯氨酸[23]。脯氨酸含有亞氨基，可以與蛋白質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)域結(jié)合，積累更多的可溶性蛋白，進(jìn)而維持低溫脅迫時(shí)酶的構(gòu)象[24]。研究發(fā)現(xiàn)低溫脅迫后轉(zhuǎn)HuCAT基因煙草的可溶性糖含量的增加幅度大于野生型煙草,由此可見，轉(zhuǎn)HuCAT基因煙草有更強(qiáng)的耐寒性[25]。崔旭昕[26]研究表明，在低溫處理?xiàng)l件下，轉(zhuǎn)OsC2H2-12基因水稻(Oryzasativa)跟野生型相比積累了更高含量的可溶性蛋白和可溶性糖、更高的過氧化物酶活性，并且轉(zhuǎn)OsC2H2-12基因水稻的葉綠素降解速度較野生型更慢一些，由此證明OsC2H2-12基因可以增強(qiáng)水稻的耐冷性。Xu等[27]研究表明，在低溫處理下，轉(zhuǎn)EjDHN1基因材料與對(duì)照組相比，轉(zhuǎn)EjDHN1基因株系的植物生長明顯優(yōu)于野生型。EjDHN1可以保護(hù)細(xì)胞免受冷脅迫下活性氧產(chǎn)生的氧化損傷。EjDHN1過表達(dá)導(dǎo)致的耐寒性增強(qiáng)可部分歸因于它們通過減輕氧化應(yīng)激對(duì)膜的保護(hù)作用。Wang等[28]研究的轉(zhuǎn)SlNAC35基因植株在低溫脅迫下表現(xiàn)出高葉綠素含量、低活性氧物質(zhì)積累和膜損傷。SlNAC35過表達(dá)增強(qiáng)了轉(zhuǎn)基因番茄的耐寒性。本研究中，在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草與野生型煙草相比積累了更多的脯氨酸和可溶性蛋白，推測(cè)轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草增強(qiáng)了耐冷性，可能是通過積累更多的滲透調(diào)節(jié)物質(zhì)，減少脅迫帶來的損傷，使植物細(xì)胞維持正常的生命活動(dòng)。植物在受到低溫脅迫時(shí)，細(xì)胞內(nèi)會(huì)產(chǎn)生ROS，而ROS的產(chǎn)生和積累會(huì)導(dǎo)致膜脂發(fā)生過氧化作用，最后造成植物細(xì)胞的損傷[29]。MDA是膜脂過氧化產(chǎn)物，其含量的變化是衡量質(zhì)膜受損程度的重要標(biāo)志之一[30]。大豆GsZFP1基因在擬南芥植株中過量表達(dá)，提高了轉(zhuǎn)基因植株的耐冷性，降低了轉(zhuǎn)基因植株在低溫脅迫下的MDA含量[31]。本研究中，在低溫脅迫下，轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草MDA含量明顯低于野生型煙草，這說明過表達(dá)MsZAT10基因能夠降低植物膜脂過氧化程度和膜系統(tǒng)的損傷，增強(qiáng)了轉(zhuǎn)MsZAT10基因煙草對(duì)低溫脅迫的耐受性。因此MsZAT10基因可以提高煙草對(duì)低溫及鹽脅迫的耐受性，本研究結(jié)果豐富了植物逆境脅迫抗性基因資源，并在植物抗逆分子育種中具有重要價(jià)值，為今后改良植物抗逆性奠定了基礎(chǔ)。