張正海，張亞玉※，孫海，張淋淋，張悅，侯淑麗

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112；2.吉林省醫(yī)藥中等職業(yè)學(xué)校，長春 130031）

山蘭〔Oreorchis patens(Lindl.)Lindl.〕是蘭科山蘭屬多年生陰生草本植物，廣泛分布于我國西南、華中、西北及東北各地，朝鮮半島至西伯利亞地區(qū)，日本等地也有少量分布[1]。其干燥假鱗莖入藥，甘、辛，寒，有小毒，具有滋陰清肺、化痰止咳的功效，用于治療癰疳瘡腫、瘰疬、無名腫毒[2]，但長期以來，山蘭的藥用價(jià)值并未受到重視，而是被當(dāng)作山慈菇偽品對(duì)待[3]或者作為習(xí)用品入藥[4]。隨著近些年山蘭需求量增加，價(jià)格暴漲，導(dǎo)致其野生資源遭到毀滅性破壞，被列為吉林省三級(jí)保護(hù)植物[5]。有關(guān)山蘭的資源開發(fā)[6-7]、藥效成分、藥理活性[8-10]、野生馴化[11]以及菌根真菌[12]等的相關(guān)研究較多，但制約山蘭大面積人工栽培的種苗繁育關(guān)鍵技術(shù)研究極少[13]。本研究以山蘭萌發(fā)種子為試驗(yàn)材料，研究不同分裂素和生長素及配比對(duì)山蘭從種子到種苗發(fā)育過程中的調(diào)節(jié)和促進(jìn)作用，使山蘭萌發(fā)種子定向發(fā)育，縮短成苗時(shí)間，提高成苗效率。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

以肉眼可分辨的萌發(fā)種子為原球莖增殖試驗(yàn)的外植體（約1 mm 1 mm 1 mm），以增殖的原球莖為球莖分化外植體，以原球莖分化產(chǎn)生的球莖為生根試驗(yàn)外植體。

1.2 分裂素對(duì)原球莖增殖的影響

以MS+NAA 0.1 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉4.5 g/L為基本培養(yǎng)基，添加分裂素為TDZ、Zt、6-BA、KT，添加量分別為 0.1、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L，培養(yǎng)溫度23 ℃、光暗周期14 h/10 h、光照強(qiáng)度1 500 lx、培養(yǎng)時(shí)間55 d，每處理3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)15 個(gè)外植體，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為外植體均重。

1.3 生長素對(duì)原球莖增殖的影響

以MS+6-BA0.1 mg/L+蔗糖30g/L+瓊脂粉4.5g/L為基本培養(yǎng)基，添加生長素為2,4-D、NAA、IBA、IAA，添加量分別為 0.1、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L，培養(yǎng)溫度23 ℃、光暗周期14 h/10 h、光照強(qiáng)度1 500 lx、培養(yǎng)時(shí)間55 d，每處理3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)15 個(gè)外植體，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為外植體均重。

1.4 6-BA 和NAA 組合對(duì)原球莖增殖的影響

以 MS+蔗糖30 g/L+瓊脂粉4.5 g/L 為基本培養(yǎng)基，以對(duì)原球莖增殖效果最好的6-BA和NAA進(jìn)行組合，6-BA 濃度為 2.0、3.0、4.0、5.0、6.0 mg/L，NAA 濃度為 6.0、7.0、8.0、9.0、10. 0 mg/L，培養(yǎng)溫度 23 ℃、光暗周期14 h/10 h、光照強(qiáng)度1 500 lx、培養(yǎng)時(shí)間55 d，每處理3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)15 個(gè)外植體，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為外植體均重。

1.5 6-BA、KT 和ZT 對(duì)原球莖分化為球莖的影響

以MS+IBA 6.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉4.5 g/L為基本培養(yǎng)基，添加分裂素為6-BA、KT、ZT，添加量分別為 0.1、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L，培養(yǎng)溫度 23℃、光暗周期14 h/10 h、光照強(qiáng)度1 500 lx、培養(yǎng)時(shí)間55 d，每處理3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)15 個(gè)外植體，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為原球莖分化為球莖系數(shù)，原球莖分化為球莖系數(shù)=分化球莖數(shù)/接種原球莖數(shù)。

1.6 IBA 和IAA 對(duì)原球莖分化為球莖的影響

以MS+6-BA 4.0 mg/L+蔗糖30 g/L+瓊脂粉4.5 g/L為基本培養(yǎng)基，添加生長素為IBA、IAA，添加量分別為 0.1、2.0、4.0、6.0、8.0、10.0 mg/L，培養(yǎng)溫度 23 ℃、光暗周期14 h/10 h、光照強(qiáng)度1 500 lx、培養(yǎng)時(shí)間55 d，每處理3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)15 個(gè)外植體，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為原球莖分化為球莖系數(shù)。

1.7 KT 和IBA 組合對(duì)原球莖分化為球莖的影響

以 MS+蔗糖30 g/L+瓊脂粉4.5 g/L 為基本培養(yǎng)基，以對(duì)原球莖分化為球莖效果最好的KT 和IBA 進(jìn)行組合，KT 濃度為 2.0、2.5、3.0、3.5、4.0 mg/L，IBA 濃度為 2.5、3.0、3.5、4.0、4.5 mg/L，培養(yǎng)溫度 23 ℃、光暗周期14 h/10 h、光照強(qiáng)度1 500 lx、培養(yǎng)時(shí)間55 d，每處理3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)15 個(gè)外植體，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為原球莖分化為球莖系數(shù)。

1.8 6-BA 和IAA 組合對(duì)球莖生根的影響

以 MS+蔗糖30 g/L+瓊脂粉4.5 g/L 為基本培養(yǎng)基，以 6-BA 和 IAA 進(jìn)行組合，6-BA 濃度為 0.1、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/L，IAA 濃度為 0.1、2.5、5.0、7.5、10.0 mg/L，培養(yǎng)溫度23 ℃、光暗周期14 h/10 h、光照強(qiáng)度1 500 lx、培養(yǎng)時(shí)間55 d，每處理3 個(gè)重復(fù)，每重復(fù)15 個(gè)外植體，統(tǒng)計(jì)指標(biāo)為球莖生根數(shù)。

1.9 數(shù)據(jù)分析

試驗(yàn)數(shù)據(jù)用SAS 8.01 進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 分裂素對(duì)原球莖增殖的影響

各分裂素對(duì)原球莖增殖效果差異不顯著，但6-BA的增殖效果較好，且隨6-BA 濃度增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，在6-BA 4.0 mg/L 時(shí)達(dá)到最大值39.62 mg/原球莖。結(jié)果見表1。

表1 分裂素對(duì)原球莖增殖的影響Tab.1 Effect of cytokinins on protocorm multiplication （mg/原球莖）

2.2 生長素對(duì)原球莖增殖的影響

對(duì)原球莖增殖效果顯著的生長素是NAA，增殖效果呈先降后增再降的趨勢(shì)，在NAA 8.0 mg/L時(shí)達(dá)到最大值78.05 mg/原球莖。結(jié)果見表2。

表2 生長素對(duì)原球莖增殖的影響Tab.2 Effect of auxins on protocorm multiplication （mg/原球莖）

2.3 6-BA 和NAA 組合對(duì)原球莖增殖的影響

在6-BA 5.0mg/L 時(shí)原球莖增殖效果較好，且隨NAA 濃度增大呈先增加后降低的趨勢(shì)，在6-BA 5.0 mg/L+NAA 8.0 mg/L 時(shí)達(dá)到最大值106.88 mg/原球莖。結(jié)果見表3、圖1。

2.4 分裂素對(duì)原球莖分化為球莖的影響

對(duì)原球莖分化為球莖效果較好的分裂素是KT，分化系數(shù)隨KT濃度增加呈先增加后降低的趨勢(shì)，在KT 4.0 mg/L 時(shí)達(dá)到最大值0.40。結(jié)果見表4。

圖1 萌發(fā)種子增殖產(chǎn)生的原球莖Fig.1 Protocorm produced by germination of seed

表3 6-BA 和NAA 組合對(duì)原球莖增殖的影響Tab.3 Effect of 6-BA and NAA combination on protocorm multiplication（mg/原球莖）

表4 分裂素對(duì)原球莖分化為球莖的影響Tab.4 Effects of cytokinins on the differentiation of protocorms into corms

2.5 生長素對(duì)原球莖分化為球莖的影響

IBA 和IAA 對(duì)原球莖分化為球莖效果差異不顯著，IBA對(duì)原球莖分化為球莖效果較好，分化系數(shù)隨著IBA 濃度增加而降低，在IBA 0.1 mg/L 時(shí)分化系數(shù)達(dá)到最大值1.00。結(jié)果見表5。

表5 生長素對(duì)原球莖分化為球莖的影響Tab.5 Effects of auxins on the differentiation of protocorms into corms

2.6 KT 和IBA 組合對(duì)原球莖分化為球莖的影響

在KT 2.5 mg/L 時(shí)原球莖分化為球莖效果較好，原球莖分化為球莖效果隨IBA 濃度增加呈降低趨勢(shì)，在KT 2.5 mg/L+IBA 2.5 mg/L 時(shí)分化系數(shù)達(dá)到最大值1.30。結(jié)果見表6、圖2。

表6 KT 和IBA 組合對(duì)原球莖分化為球莖的影響Tab.6 Effect of KT and IBA combination on differentiation of protocorm into corms

2.7 6-BA 和IAA 對(duì)球莖生根的影響

在6-BA 0.1 mg/L 時(shí)球莖生根效果較好，球莖生根數(shù)隨IAA 濃度增大呈先增后減趨勢(shì)，在6-BA 0.1 mg/L+IAA 2.5 mg/L時(shí)球莖生根數(shù)達(dá)到最大值6.6條/球莖。結(jié)果見表7、圖3。

圖2 原球莖分化產(chǎn)生的球莖Fig.2 Corms produced by protocorm differentiation

圖3 球莖生根Fig.3 Rooting of corm

表7 6-BA 和IAA 對(duì)球莖生根的影響Tab.7 Effects of 6-BA and IAA on rooting of corm 條/球莖

3 討論

3.1 由于山蘭種子非常細(xì)小，剛萌發(fā)的種子繼代操作極不方便，可以將種子直接播種在原球莖增殖培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，當(dāng)原球莖體積增加到一定大小時(shí)再進(jìn)行繼代，既方便操作又減少培養(yǎng)環(huán)節(jié)。由于原球莖體積不容易測(cè)量，本研究以原球莖重量變化來代替體積變化。

3.2 當(dāng)原球莖體積達(dá)到一定標(biāo)準(zhǔn)后轉(zhuǎn)入球莖分化培養(yǎng)基，在球莖分化培養(yǎng)時(shí)，低濃度IBA 有利于球莖分化，但低濃度IBA 條件下分化出的球莖重量小，影響移栽成活率，因此選擇有利于球莖重量增加的IBA 濃度范圍與KT 進(jìn)行組合；而近緣植物杜鵑蘭種子萌發(fā)研究表明，適宜濃度的IBA 與KT 組合有利于種子萌發(fā)[14]，這可能與植物種類及激素配比有關(guān)，也對(duì)減少山蘭種苗繁育環(huán)節(jié)有啟示作用。

3.3 種子直接產(chǎn)生的原球莖體積小、重量輕、球莖分化系數(shù)低，但由于山蘭種子細(xì)小、數(shù)量巨大，因此以種子作繁殖材料，進(jìn)行人工定向培養(yǎng)，可在短時(shí)間內(nèi)獲得大量種苗。