王卓，劉曉穎，李光玉，郭肖蘭，王曉旭，張貴賢,王殿永,劉晗璐※，邱宏坤

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所吉林省特種經(jīng)濟動物分子生物學(xué)省部共建國家重點實驗室，長春 130112；2.河北省昌黎縣農(nóng)業(yè)農(nóng)村局，河北 秦皇島 066600；3.河北省昌黎縣動物疫病預(yù)防控制中心，河北 秦皇島 066600；4.黑龍江省海林市橫道河子?xùn)|北虎林園，黑龍江 海林 157114）

梅花鹿為反芻動物，其瘤胃內(nèi)含有豐富而復(fù)雜的瘤胃微生物，能幫助機體消化食物，特別是采食難以被機體直接利用的玉米秸稈、干柞樹葉等粗纖維飼料，可被動物瘤胃內(nèi)的大量微生物消化，轉(zhuǎn)化成可被機體利用的營養(yǎng)物質(zhì)[1]。微生物制劑在梅花鹿上的應(yīng)用研究極少，利用微生物制劑來促進梅花鹿的健康以及消化機能是一個很好的選擇。

枯草芽孢桿菌是一類較為常見的益生菌，因其具有良好的消化酶分泌能力，同時能夠消耗游離氧，以維持腸道厭氧環(huán)境拮抗有害菌群而被廣泛應(yīng)用[2-4]。Wehnes等[5]研究發(fā)現(xiàn)，在腹瀉犢牛中添加枯草芽孢桿菌后，腹瀉致病菌產(chǎn)氣莢膜梭狀芽孢桿菌減少，并且腹瀉情況明顯減輕。Aquilina 等[6]研究發(fā)現(xiàn)，由枯草芽孢桿菌DSM 5750 和地衣芽孢桿菌DSM 5749 組成的益生菌可以提高小牛的試驗?zāi)┲亍Ⅲw增重和生長速率。

枯草芽孢桿菌是吉林省特種經(jīng)濟動物分子生物學(xué)省部共建國家重點實驗室從梅花鹿瘤胃液中分離篩選的新菌株，已證實其不僅具有良好的抗逆性，而且其纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶等消化酶的分泌能力也很強。但是，益生菌作為一類活性微生物，特別是新型益生菌菌株，對其安全性能必須通過全面客觀的評價[7-9]，才能進一步為其在梅花鹿養(yǎng)殖業(yè)中應(yīng)用奠定基礎(chǔ)。本試驗對枯草芽孢桿菌進行小鼠安全性檢驗，檢測小鼠健康、生長狀況和死亡情況以及細菌易位情況，以期判斷其作為益生菌的可行性，為其在養(yǎng)鹿業(yè)中應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)和試驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗菌株

枯草芽孢桿菌（編號D-12）由吉林省特種經(jīng)濟動物分子生物學(xué)省部共建國家重點實驗室從健康梅花鹿瘤胃中分離并保存。取枯草芽孢桿菌D-12 菌株接種到LB 液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)48 h，刮取菌泥，采用平板計數(shù)法測量有效活菌數(shù)，用15%脫脂乳粉作為保護劑，凍干制成D-12 凍干粉，封存?zhèn)溆谩?/p>

1.2 試驗動物

實驗用48 只健康雄性ICR 小鼠，體重為17～21 g，購于長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司〔動物質(zhì)量合格證號：SCXK-（吉）2016-0003〕。

1.3 試驗和儀器

白蛋白（ALB）測定試劑盒（溴甲酚綠法）、總蛋白（TP）測定試劑盒（雙縮脲法）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL）測定試劑盒（直接法表面活性劑清除法）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL）測定試劑盒（直接法過氧化氫酶清除法）、葡萄糖（GLU）測定試劑盒（己糖激酶法）、堿性磷酸酶（ALP）測定試劑盒（NPP 底物-AMP 緩沖液法）、膽固醇（CHO）測定試劑盒（CHOD-PAP法）、甘油三酯（TG）測定試劑盒（GPO-PAP 法）（中生北控有限公司）；血液細胞分析儀（BC-2800Vet，邁瑞公司）；血液生化分析儀（Selectra-E，荷蘭威圖公司）。

1.4 小鼠28 d喂養(yǎng)試驗

按照GB 15193.22-2014《食品安全國家標(biāo)準28 天經(jīng)口毒性試驗》和GB 15193.1-2014《食品安全性毒理學(xué)評價程序》要求并參照文獻[10，11]進行試驗。將實驗用48 只雄性小鼠隨機分為4 組，分別為對照組和枯草芽孢桿菌低劑量組（1 106CFU/mL）、中劑量組（1 108CFU/mL）和高劑量（1 1010CFU/mL），每組2個重復(fù)，每個重復(fù)各6 只。其中，對照組小鼠灌服生理鹽水，試驗組小鼠灌服枯草芽孢桿菌D-12 凍干粉稀釋液。每天定時經(jīng)口灌服1 次，劑量為0.2mL/只，連續(xù)灌胃28d。觀察并記錄小鼠的行為、死亡情況、中毒表現(xiàn)和腹瀉情況。在試驗期間，每隔3 d 稱量和記錄體重、攝食量，計算動物體重增長量。試驗結(jié)束后，所有小鼠經(jīng)眼球采血1mL，將每組每個重復(fù)中的2 個血樣置于EDTA 抗凝管內(nèi)，用于后續(xù)血液常規(guī)檢測；另外，每組每個重復(fù)中的4 個血樣置于促凝管中，用于后續(xù)血液生化指標(biāo)測定。處死小鼠后，進行解剖檢查，稱重肝臟、腎臟、脾臟和胸腺，并計算臟器指數(shù)，臟器指數(shù)=臟器質(zhì)量/體質(zhì)量 100。

1.5 菌株易位試驗

經(jīng)口毒性試驗結(jié)束后，在無菌條件下，每組取3 只小鼠的肝臟、脾臟、腎臟，分別加入適量的無菌生理鹽水后制成組織勻漿液，分別涂布于LB 固體培養(yǎng)基平板，37 ℃培養(yǎng)48 h，觀察菌落生成情況。

1.6 小鼠血液學(xué)指標(biāo)的測定

將血樣置于EDTA抗凝管中，進行紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)及分類、血紅蛋白濃度、血小板計數(shù)等血液學(xué)指標(biāo)測定。

1.7 小鼠血液生化指標(biāo)測定

將血樣置于促凝管中，靜置待血清析出后，3 500 r/min 4 ℃離心5 min，將分離出的血清用于檢測血清中的ALB、TP、ALP、HDL、LDL、CHO、TG、GLU 指標(biāo)，球蛋白（GLOB）通過TP 和ALB 的差值計算得出。

1.8 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

使用SPSS 21.0 統(tǒng)計軟件對試驗數(shù)據(jù)進行數(shù)據(jù)統(tǒng)計、分析、處理及顯著性檢驗。采用單因素方差（Oneway ANOVA）進行差異顯著性檢驗，若組間差異顯著，則采用Duncan's 法進行多重比較，試驗結(jié)果均以“平均數(shù)±標(biāo)準差”表示，P ＜0.05 表示差異顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 枯草芽孢桿菌對小鼠體重和采食量的影響

從表1 可以看出，枯草芽孢桿菌低、中、高劑量組對小鼠的體重和采食量均無顯著影響。

表1 不同劑量枯草芽孢桿菌對小鼠體重及采食量的影響Table 1 Effects of different doses of B.subtilis on the body weight and feed intake of mice

經(jīng)過28 d喂養(yǎng)試驗，各組小鼠在試驗期內(nèi)未觀察到任何中毒癥狀和明顯異常反應(yīng)，小鼠的一般體征、行為、活動、毛發(fā)、色澤、飲食、糞便均無不良反應(yīng)，未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，各組體重持續(xù)增長，表明該菌株經(jīng)口灌服不會對動物的表觀特征和生長性能產(chǎn)生異常反應(yīng)。

2.2 枯草芽孢桿菌對小鼠臟器指數(shù)的影響

試驗結(jié)束后，對小鼠進行解剖，觀察并稱重臟器，結(jié)果見表2。由表2 可知，小鼠心臟、肝臟、脾臟、肺、腎臟、腸道均未出現(xiàn)病變。各組肝臟指數(shù)、脾臟指數(shù)、胸腺指數(shù)和腎臟指數(shù)均無顯著差異。

表2 不同劑量枯草芽孢桿菌對小鼠臟器指數(shù)的影響Table 2 Effects of different doses of B.subtilis on organ index of mice

2.3 枯草芽孢桿菌對小鼠細菌易位情況

如圖1 所示，灌服不同劑量枯草芽孢桿菌的小鼠肝臟、腎臟、脾臟未見菌落長出。腸黏膜對腸道細菌及其毒素具有重要的局部防御屏障功能，防止聚居在腸道內(nèi)的細菌侵襲全身器官和組織。細菌易位是指胃腸道內(nèi)的活菌穿過黏膜，進入正常無菌的組織或器官。結(jié)果表明，飼喂低、中、高劑量的枯草芽孢桿菌均未發(fā)生細菌易位現(xiàn)象。

圖1 枯草芽孢桿菌對小鼠細菌易位情況Fig.1 Bacterial translocation of B.subtilis to mice

2.4 枯草芽孢桿菌對小鼠血液生化指標(biāo)的影響

ALB、TP、GLOB、ALP是檢測肝功能的重要指標(biāo)；HDL、LDL、CHO、TG、GLU是檢測體內(nèi)血糖血脂的重要指標(biāo)。由表3 可知，3 種劑量的枯草芽孢桿菌對小鼠血液生化指標(biāo)均無顯著影響。這表明，飼喂不同劑量枯草芽孢桿菌對小鼠肝功能和血糖血脂無顯著影響。

表3 不同劑量枯草芽孢桿菌對小鼠血清生化指標(biāo)的影響Table 3 Effects of different doses of B.subtilis on serum biochemical indices of mice

2.5 枯草芽孢桿菌對小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響

灌服3 種劑量的枯草芽孢桿菌對小鼠的紅細胞計數(shù)、白細胞計數(shù)及分類，血紅蛋白濃度和血小板計數(shù)等指標(biāo)均無顯著影響。見表4。

表4 不同劑量枯草芽孢桿菌對小鼠血液學(xué)指標(biāo)的影響Table 4 Effects of different doses of B.subtilis on the hematological indices of mice

在正常生理情況下，血液中各種細胞的數(shù)量和比例有著相對穩(wěn)定的范圍，每種細胞各自在體內(nèi)承擔(dān)著不同的功能。白細胞主要扮演免疫的角色，可將病菌包圍后吞噬；淋巴細胞是體積最小的白細胞，一些感染性疾病或急性傳染病會引起顯著增高；單核細胞數(shù)目占白細胞數(shù)目的3%～8%，是白細胞中體積最大的細胞；中性粒細胞在機體受細菌嚴重感染時，其比例顯著增加。紅細胞是血液中數(shù)量最多的一種血細胞，除了運輸氧氣和二氧化碳外，也具有免疫功能；血紅蛋白是紅細胞內(nèi)運輸氧的特殊蛋白質(zhì)，與紅細胞的使用價值近似；血小板在止血和凝血過程中起重要作用。飼喂不同劑量枯草芽孢桿菌對小鼠血液學(xué)指標(biāo)沒有影響。

3 討論與結(jié)論

益生菌是指那些可以維持腸道正常微生物菌群、抑制病原菌生長、增加有益微生物的生長、改善新陳代謝、提高營養(yǎng)物質(zhì)的消化和吸收以及增強宿主免疫力的微生物[12-14]。宿主動物的胃腸道內(nèi)微生態(tài)系統(tǒng)處于一個動態(tài)平衡狀態(tài)[15]。在正常情況下，胃腸道菌群中共生菌之間相互作用，為宿主胃腸道提供一定的營養(yǎng)及屏障功能，維持胃腸道的穩(wěn)態(tài)[16]。當(dāng)腸道菌群中病原性菌群增多或者有益菌群（雙歧桿菌、乳酸桿菌等）數(shù)目減少，會導(dǎo)致腸道屏障的紊亂失調(diào)，從而影響腸道菌群組成以及對腸道病原菌的敏感性導(dǎo)致相關(guān)病理性炎癥產(chǎn)生[17]。微生物進入胃腸道后與胃腸道內(nèi)其他上百種菌群相互之間發(fā)生共生、共棲、競爭等作用[18]。當(dāng)飼喂大劑量微生物制劑后，微生物進入胃腸道后成為優(yōu)勢菌群，與胃腸道內(nèi)部生理生化環(huán)境之間相互作用，機制極其復(fù)雜，動物體是否能夠適應(yīng)這一變化以及是否引起動物的不適，仍然需要檢驗。在幵發(fā)新型微生態(tài)制劑的過程中，微生態(tài)制劑產(chǎn)品的劑量標(biāo)準、動物體自身健康狀況等各種因素的影響會產(chǎn)生微生態(tài)制劑中毒、過敏、腹瀉等安全性問題，因此對其進行安全性能評價是一個必不可少的環(huán)節(jié)。

本研究中小鼠灌服含有枯草芽孢桿菌D-12 的最大劑量為1 1010CFU /mL 后，小鼠的整體健康狀況、生長、采食量、血液學(xué)和血清生化指標(biāo)未見不良影響，試驗菌株在喂養(yǎng)28 d后沒有引起感染，也沒有從原來的定植點（腸道）移位。在細菌制劑含有1 1011個/g 細菌數(shù)，6～8 周齡雄性小鼠，體重為20g左右，體重50kg/只的仔鹿口服枯草芽孢桿菌D-12的LD50（預(yù)計可導(dǎo)致50%的死亡率）將大于1g/（kg·d），即0.05kg/d的凍干菌[10]，可接受的日攝入量是應(yīng)用于動物試驗中使用量的10倍以上[19]。由此可見，枯草芽孢桿菌D-12 是一種無致病性、安全的益生菌，值得進一步研究。

本試驗將分離篩選的枯草芽孢桿菌在小鼠上進行安全性評價，通過灌服不同劑量的枯草芽孢桿菌28 d的小鼠飼養(yǎng)試驗中對試驗期小鼠的狀態(tài)、生長情況、健康以及內(nèi)臟細菌易位情況進行分析，初步證實該菌對小鼠是安全的。以小鼠作為評價益生菌安全性的實驗動物既經(jīng)濟又方便，但小鼠屬于小型單胃動物，與鹿這種大型瘤胃反芻動物差異甚大，因此在鹿上的使用效果和安全性評價工作仍需要進一步開展，以期為該菌株的商業(yè)生產(chǎn)奠定堅實的基礎(chǔ)。