劉琳玲，宋姍姍，叢波，劉宗岳，宋興超，楊福合，彭英華※，邱宏坤

（1.中國農業(yè)科學院特產研究所特種經濟動物分子生物學國家重點實驗室農業(yè)部特種經濟動物遺傳育種與繁殖重點實驗室，長春 130112；2.黑龍江省海林市橫道河子東北虎林園，黑龍江 海林 157114）

水貂是一種珍貴的毛皮動物，貂皮毛絨細密、光澤度好、平齊、有彈性，素有“皮之王”美稱。貂皮皮張面積越大，價值越高，皮張面積大小取決于取皮前水貂生長性狀。培育出體型大、體重重的水貂是當前水貂育種的主要方向之一。通過分子標記輔助選擇（Marker assisted selectiong，MAS），篩選出與水貂生長性狀相關的單核苷酸多態(tài)性位點（Single nucleotide polymorphisms，SNPs），可加快水貂品種選育進程。

阿片黑素促皮質激素原（Pro-opiomelanocortin，POMC）在腦垂體中表達并編碼成多種激素的共同前體肽[1]，它包括黑素皮質素、促腎上腺皮質激素（ACTH）和 -促脂素（ -LPH）[2]，它們影響著食物的攝入和能量平衡調控[3]。POMC 基因發(fā)生突變影響進食量和體重[4]。Buchanan 等[5]把牛POMC 基因定位在了11 號染色體上，并且發(fā)現(xiàn)了1 個同義突變位點，這個位點與牛的屠體重、平均日增重等相關。有人對不同品種的牛、羊、兔子和狗等動物群體都進行了POMC基因的序列分析，發(fā)現(xiàn)了很多突變位點，并通過相關分析發(fā)現(xiàn)這些位點跟生長性狀相關[6-7]。國內、外研究表明，POMC 基因和生長性狀中的體長、體重有相關性，但是POMC基因多態(tài)性與水貂生長性狀的相關性尚不清楚。本研究以POMC 基因作為水貂生長性狀的潛在候選基因，檢測水貂POMC基因的多態(tài)性，分析其與水貂生長性狀的相關性，以期為水貂生長性能的分子遺傳標記提供依據(jù)，為水貂的育種工作奠定理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

樣本取自大連名威貂業(yè)有限公司7 月齡左右59只雄性咖啡色水貂和120 只雄性紅眼白水貂。水貂取皮期，無菌心臟采血，檸檬酸鈉抗凝，冰盒 80 ℃保存。在采樣的同時，對水貂的體重、體長進行測量。

1.2 基因組DNA的提取

采用全血基因組試劑盒提取基因組DNA，紫外分光光度計測OD值，計算濃度后稀釋成20ng/L，20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 引物設計和PCR擴增

參照GenBank 數(shù)據(jù)庫中公布的水貂POMC 序列信息（登錄號：JF288182.1）。利用引物設計軟件Primer Premier 5.0 分析設計2 對引物（表1），引物由吉林省庫美生物科技有限公司合成。

PCR 反應條件：預變性 94 ℃ 5 min；94 ℃變性 30 s，60 ℃退火 30 s，72 ℃延伸 45 s，共 30 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。

表1 引物序列及相關信息Table 1 The primer sequences and information

1.4 測序

1.5 SNPs篩查和基因型分析

利用DNAMAN 軟件Multiple alignment 程序對基因序列進行比對篩查 SNPs。用 Chromas 5.0 軟件根據(jù)找到的SNPs 通過測序峰圖區(qū)分基因型。

1.6 數(shù)據(jù)分析

采用PopGen32 軟件分析基因型頻率、等位基因頻率、雜合度等群體遺傳參數(shù)。利用SPSS（16.0）軟件分析生長性狀數(shù)據(jù)，構建線性分析模型，分析各基因型與生長性狀之間的關聯(lián)性。相關分析模型 yij=+Gi+eij，yij為性狀表型值為群體均值，Gi為標記基因型效應，eij為隨機誤差。

2 結果與分析

2.1 POMC基因PCR擴增結果

PCR 產物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，與預期擴增片段大小一致，可以進行直接測序分析，結果見圖1。

圖1 水貂POMC 基因PCR 擴增產物電泳結果Fig.1 Electrophoresis results of the products of POMC gene in mink

2.2 SNPs位點檢測

咖啡水貂和紅眼白水貂引物P1 擴增的產物序列中發(fā)現(xiàn)，g.171A ＞G、g.470T ＞G這 2 個突變位點；咖啡水貂和紅眼白水貂引物P2 擴增的產物序列中發(fā)現(xiàn)，g.514C ＞ T 突變位點。

2.3 不同品種水貂POMC基因型頻率和基因頻率分析

根據(jù)測序峰圖進行基因型判定（圖2～4），g.171A＞G 位點型可分為 AA、GG 和 AG 型；g.470T ＞ G 位點型可分為 TT、GG 和 TG 型；g.514C ＞ T 位點基因型可分為 CC、TT 和 CT 型。

圖2 g.171A ＞G 位點核苷酸序列變異峰及分型Fig.2 Nucleotide sequence variation peak and genotyped chart of g.171A ＞G

圖3 g.470T ＞G 位點核苷酸序列變異峰及分型Fig.3 Nucleotide sequence variation peak and genotyped chart of g.470T ＞G

圖4 g.514C ＞T 位點核苷酸序列變異峰及分型Fig.4 Nucleotide sequence variation peak and genotyped chart of g.514C ＞T

在 2 個水貂品種中，g.171A ＞ G 位點 AA、AG 和GG 這3 種基因型中，基因型頻率AA 都大于AG 和GG，為優(yōu)勢基因型；g.470T ＞ G 位點均有 TT、TG 和GG 這3 種基因型，基因型頻率GG 都大于TT 和TG，為優(yōu)勢基因型；g.514C ＞ T 位點均有 TT、TC 和 CC 這3 種基因型，基因型頻率CT 都大于TT 和CC，為優(yōu)勢基因型。

表2 3 個SNPs 位點在2 個水貂品種中的基因型頻率和等位基因頻率Table 2 Genotypic and allelic frequencies of 3 SNPs in 2 mink breeds

2.4 g.171A＞G、g.470T＞G和g.514C＞T位點群體遺傳結構分析

3 個位點在2 個水貂品種中都表現(xiàn)為中度多態(tài)（0.25 ＜ PIC ＜ 0.50）。2檢驗顯示，g.171A ＞ G、g.470T＞G和g.514C＞T位點基因型分布符合Hardy-Weinberg 平衡狀態(tài)。見表3。

2.5 POMC基因SNPs位點與生長性狀相關性分析

g.171A ＞G 位點與咖啡貂的體重有顯著相關（P ＜ 0.05），AA 型個體體重高于 AG 型個體和 GG 型個體。g.470T ＞G 位點與咖啡貂的體長有顯著相關（P ＜ 0.05），TT 型個體體長高于 TG 型個體和 GG 型個體。g.470T ＞G 位點與紅眼白水貂的體重有顯著相關（P＜0.05），TT型個體體重高于TG型個體和GG型個體。g.514C ＞T 位點與紅眼白水貂的體長有顯著相關（P ＜ 0.05），CT 型個體體長大于 CC 型個體和TT 型個體。見表4。

表4 g.171A ＞G、g.470T ＞G、g.514C ＞T 位點不同基因型與咖啡水貂和紅眼白水貂生長性狀的關聯(lián)分析Table 4 Correlation between different genotypes and growth traits of g.171A ＞ G，g.470T ＞ G，g.514C ＞ T sites

3 結論與討論

隨著測序技術的推廣和測序成本的降低，直接測序被更好地運用到 SNPs 檢測中。單一峰型為純合SNPs 位點，套峰為雜合SNPs 位點。通過峰型圖能很直觀、方便地將其區(qū)分，通過直接測序方法能百分百對SNPs 位點進行篩查。本試驗采用PCR 產物直接測序技術，對咖啡水貂和紅眼白水貂POMC基因進行了單核苷多態(tài)性檢測，在基因部分外顯子區(qū)共檢測到了3個SNPs 位點。本研究發(fā)現(xiàn)，2 個水貂品種3 個SNPs位點的多態(tài)信息含量均大于0.25，都屬于中度多態(tài)，說明這些位點的多態(tài)性比較豐富。

POMC 基因能夠調節(jié)食欲和能量穩(wěn)定。研究表明，POMC 基因敲除以后，小鼠變得肥胖[8]。POMC 基因突變失活使人的肥胖病癥更嚴重[9]。Krude 等[10]發(fā)現(xiàn)，POMC 基因多態(tài)性與青少年早期肥胖癥相關。犬的POMC 基因14 個bp 的堿基缺失會導致黑素細胞刺激素和內啡肽破壞，引起采食量增加和體重增加[11]。g.171A ＞G 位點在咖啡貂中形成的基因型與體重顯著相關（P ＜ 0.05），g.470T ＞ G 位點與紅眼白水貂體重顯著相關（P ＜0.05）。因此，POMC 基因與水貂的體重是相關的。

劉文超[12]發(fā)現(xiàn)，POMC 基因 g.112-12G ＞ T 位點與家兔生長性狀存在關聯(lián)性。王春玲等[13]研究發(fā)現(xiàn)，POMC 基因外顯子3 的273 位點多態(tài)性與生長性狀顯著相關。g.470T ＞G 位點與咖啡貂體長顯著相關（P ＜ 0.05），g.514C ＞ T 位點與紅眼白水貂體長顯著相關（P ＜0.05）。因此，POMC 基因與水貂的體長是相關的。

在腦垂體中，POMC基因表達產物是維持下丘腦-垂體-腎上腺軸的關鍵[14]。下丘腦神經元表達POMC基因可以調節(jié)采食量，其對于體內能量平衡和對身體構成的影響是至關重要的[15]。本研究表明，POMC 基因與水貂的體重、體長都相關。水貂POMC 基因的遺傳多樣性比較豐富，可作為水貂生長性狀潛在的分子遺傳標記。