李美佳，王秋霞，關(guān)一鳴，劉政波，孫海，潘曉曦，邵財(cái)，劉寧，張亞玉

（中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長(zhǎng)春 130112）

人參（Panax ginseng C.A.Mey）為五加科多年生草本植物，是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材。由銹腐菌（Cylindrocarpon destructans）引起的人參銹腐病是人參連作障礙中最主要的土傳病害之一，從苗期到收獲期均可發(fā)生，連作發(fā)生更為嚴(yán)重，甚至導(dǎo)致絕收，為當(dāng)前生產(chǎn)上防治較難的主要病害之一[1-4]。而鐵脅迫又是人參連作障礙中主要理化因素之一[5-6]。鐵的毒害表現(xiàn)為鐵附著在植株根部表面，進(jìn)而形成紅色鐵斑，對(duì)植物根部造成毒害[6-8]。在植物根部土壤中，微生物群落結(jié)構(gòu)及其組成變化能反映土壤的生態(tài)現(xiàn)狀及其變化趨勢(shì)，對(duì)植物健康十分重要[9]。目前，有關(guān)鐵脅迫下人參銹腐病的土壤微生物群落結(jié)構(gòu)變化研究鮮見(jiàn)報(bào)道。基于 16S rRNA 基因和ITS 序列高通量測(cè)序是一種高效、經(jīng)濟(jì)的現(xiàn)代微生物生態(tài)學(xué)工具，以此可獲得高通量分析數(shù)據(jù)，進(jìn)一步探明根際土壤組成，深入了解土壤細(xì)菌和真菌群落結(jié)構(gòu)[10-11]。因此，本研究通過(guò)Illumina 高通量測(cè)序手段，從而揭示鐵脅迫條件下人參銹腐病感染的土壤真菌群落結(jié)構(gòu)多樣性，為解決鐵及銹腐病導(dǎo)致的人參連作障礙提供數(shù)據(jù)支撐。

1 材料

1.1 試驗(yàn)材料與試劑

2 年生健康人參苗，取自撫松縣抽水參場(chǎng)；供試土壤采自中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所左家自然保護(hù)區(qū)山皮土（土壤pH 7.7、全氮0.052‰、有效鉀192 g/kg、速效磷13.2 mg/kg）；供試菌株人參銹腐菌（C.destrctans，中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所藥用植物栽培實(shí)驗(yàn)室分離鑒定并保存）；供試鐵溶液（FeNaEDTA，200 mmol/L，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司）。

1.2 孢子懸浮液制備

取培養(yǎng)好的菌絲塊，分多點(diǎn)接種到PDA培養(yǎng)基平板上，置于28 ℃恒溫培養(yǎng)箱中約7 d，菌絲長(zhǎng)滿全皿，將少許無(wú)菌水倒入培養(yǎng)皿中，用滅菌毛筆輕輕刷洗培養(yǎng)基表面，獲得孢子懸浮液，用滅菌水制成1 106cfu/mL的分生孢子懸浮液進(jìn)行接種。

2 方法

2.1 試驗(yàn)場(chǎng)地與設(shè)計(jì)

2.1.1 試驗(yàn)場(chǎng)地 試驗(yàn)于2018 年在中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所溫室進(jìn)行。供試人參苗栽種于室溫內(nèi)塑料盆中。

2.1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)病菌的接種和鐵的施用方法設(shè)置4 個(gè)處理：不接種銹腐病菌不加鐵（CK）組；接種銹腐病菌不加鐵（XF）組；不接種銹腐病菌加鐵（FE）組；接種銹腐病菌加鐵（FEXF）組。每個(gè)處理設(shè)3 個(gè)重復(fù)，每個(gè)重復(fù)3 盆，每盆種植5 株。

2.2 試驗(yàn)方法

2.2.1 銹腐菌病接種 采用針刺接種法[2]，將供試人參栽種于裝土的塑料盆中，每盆種植5 株2 年生人參苗。需接種銹腐菌的處理，用濃度1 106cfu/mL 的分生孢子懸浮液進(jìn)行接種，每株人參根部接種15 mL 孢子懸浮液。在接種后的第7 d 向土壤中添加濃度為200 mmol/L的FeNaEDTA溶液，放置于20/28 ℃培養(yǎng)，接種后的第15 d 取根際土樣，將人參植株洗干凈，再用蒸餾水沖洗，濾紙吸干水分，80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.2.2 試驗(yàn)管理 試驗(yàn)期間，各盆栽管理措施一致。盆栽人參20～28 ℃培養(yǎng)，紅、藍(lán)光比7∶1，試驗(yàn)全過(guò)程中采用稱重法對(duì)所有處理均澆灌經(jīng)高壓蒸汽滅菌處理的蒸餾水，使得整個(gè)試驗(yàn)過(guò)程中不同處理間的土壤濕度均基本保持在55%～65%。

2.2.3 采樣方法 樣品在接種后第9 d 取根際土，同時(shí)記錄發(fā)病率及發(fā)病指數(shù)。采用抖落法采集粘附在人參根系上的根際土，裝入無(wú)菌袋中，每個(gè)土壤分為2份，1 份去除雜質(zhì)，過(guò)2 mm篩子，并將同一處理的3 次平行混合到一起，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3 分析測(cè)試方法

2.3.1 土壤樣品總DNA提取及檢測(cè)方法 選擇12 份土壤樣品，每個(gè)重復(fù)土樣稱取0.5 g，試劑盒提取土壤總DNA，送交北京百邁客生物科技有限公司構(gòu)建DNA文庫(kù)。采用Illumina Hiseq2 500 PE250 模式進(jìn)行測(cè)序，擴(kuò)增引物：采用真菌通用引物：5'-CTTGGTCATTTAGAGGAAGTAA-3', 5'-GCTGCGTTCTTCATCGATGC-3'；PCR 擴(kuò)增參數(shù)：95 ℃預(yù)變性 30 s；55 ℃退火 30 s；72 ℃延伸 40 s，25 個(gè)循環(huán)；72 ℃延伸 7 min。

2.3.2 測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量評(píng)估方法 對(duì)原始數(shù)據(jù)進(jìn)行拼接[12]，將拼接得到的序列進(jìn)行質(zhì)量過(guò)濾[13]，并去除嵌合體[14]，得到高質(zhì)量的Tags 序列。

2.3.3 操作分類單元（OTU）分析方法 在相似性97%的水平上對(duì)序列進(jìn)行聚類分析[15]，以測(cè)序所有序列數(shù)的0.005%作為閾值過(guò)濾OTU[16]。

2.3.4 物種注釋及分類學(xué)分析 物種注釋RDP Classifier[17]：置信度閾值為0.8，多重比對(duì) PyNAST[18]；建樹(shù)方法：鄰接法；Alpha多樣性指數(shù)分析：Qiime（1.9.1）計(jì)算 Shannon、Chao1 等多樣性指數(shù)；Beta 多樣性分析：多種算法呈現(xiàn)物種多樣性矩陣。

3 結(jié)果與分析

3.1 鐵對(duì)人參銹腐病感染下的真菌群落組成影響與多樣性分析

在測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)后，從12 個(gè)樣品中獲得總共819 101個(gè)有效標(biāo)簽，主要分為8 個(gè)已知真菌門、135 個(gè)已知真菌屬。如圖1 所示，隨著測(cè)序量的不斷增大，各樣品OTU 數(shù)目增加趨于平緩，達(dá)到飽和，說(shuō)明測(cè)序數(shù)據(jù)量能夠真實(shí)地反映土壤樣本的真菌群落。樣本文庫(kù)的覆蓋率指數(shù)均在99.9%以上，反映此次測(cè)序結(jié)果代表了樣本中真菌種群的真實(shí)情況。各樣品的菌群豐度指數(shù)（Chao 1、Ace）、生物多樣性指數(shù)（Shannon、Simpson）表明，采集的土壤樣品中真菌菌種群多樣性較高（表1）。分析表明，在97%相似度水平下，XF 組與CK 組，F(xiàn)E 組與FEXF 組樣品之間的OTU 數(shù)目差異不顯著，F(xiàn)EXF 組與CK 組樣品之間的OTU 數(shù)目呈顯著差異。

表1 不同處理中真菌群落多樣性指數(shù)Table 1 Diversity index of fungal community in different samples

圖1 不同處理土壤真菌的稀釋曲線Fig.1 Dilution curves of fungal community in different samples

不同樣品中真菌在綱水平的相對(duì)豐度見(jiàn)圖2。對(duì)圖2 分析發(fā)現(xiàn)，不同土壤樣本真菌在群落組成和豐度上存在差異，對(duì)照組根際土壤的優(yōu)勢(shì)類群為L(zhǎng)eotiomycetes 綱；銹腐菌感染組根際土壤優(yōu)勢(shì)類群為Sordariomycetes綱；鐵脅迫組根際土壤優(yōu)勢(shì)類群為Orbiliomycetes 綱；鐵脅迫和銹腐菌感染組土壤中所共有的優(yōu)勢(shì)類群為Mortierellom-ycetes 綱。

圖2 不同樣品中真菌在綱水平的相對(duì)豐度Fig.2 Relative abundance of different fungal in different samples in class level

3.2 不同樣品中真菌群落結(jié)構(gòu)的多樣性分析

根據(jù)12 個(gè)土壤樣品中細(xì)菌OTU 類型的豐度值，利用非度量多維尺度法（NMDS）進(jìn)行多樣性分析，比較不同樣品在真菌組成上的差異。在應(yīng)力值=0.03 水平上，不同土壤中的真菌菌群受鐵和銹腐菌同時(shí)脅迫的差異影響最大（圖3），單獨(dú)鐵脅迫或者銹腐菌脅迫與對(duì)照組的距離相似，是相互獨(dú)立的，距離較近。表明同時(shí)進(jìn)行鐵和銹腐菌脅迫對(duì)土壤中真菌菌群造成明顯影響。

圖3 不同樣品中真菌群落多樣性的NMDS 分析Fig.3 NMDS analysis of bacteria community diversity

3.3 不同樣品中真菌群落結(jié)果的聚類分析

對(duì)12 個(gè)樣品基于 Beta 多樣性分析得到距離矩陣，通過(guò)非加權(quán)組平均法（UPGMA）進(jìn)行層次聚類分析（圖4）。同時(shí)有鐵及銹腐菌脅迫的土壤樣品均單獨(dú)歸為一支，其中，對(duì)照組的土壤樣品與鐵脅迫、銹腐菌感染的土壤樣品歸為一個(gè)大的分支，在物種組成上對(duì)照土壤樣品與鐵脅迫土壤樣品較銹腐菌感染土壤更近。該結(jié)果與NMDS 分析結(jié)果一致，充分說(shuō)明同時(shí)進(jìn)行鐵脅迫和銹腐菌感染影響明顯。

圖4 不同樣品中真菌群落組成的層次聚類分析Fig.4 Hierarchical cluster analysis of fungal community composition in different samples.

4 結(jié)論與討論

本研究旨在分析鐵脅迫和銹腐病感染對(duì)人參根際土壤中微生物菌落的結(jié)構(gòu)影響，探究人參連作障礙的關(guān)鍵因素，為利用微生態(tài)調(diào)控措施防控人參連作障礙提供理論依據(jù)，同時(shí)為探索土壤中存在的銹腐病菌拮抗微生物提供了新的線索。人參銹腐病發(fā)病初期侵染處出現(xiàn)銹色斑點(diǎn)，由淺入深，從表皮至根髓擴(kuò)散，逐漸擴(kuò)大為銹褐色病斑，發(fā)病嚴(yán)重時(shí)病菌深入根內(nèi)組織，病斑擴(kuò)散至側(cè)根乃至全根，最終地下參根腐爛，危害極大[19-20]。本研究采用Illumina Hiseq2 500 高通量測(cè)序技術(shù)對(duì)鐵脅迫及銹腐菌感染的土壤真菌群落組成進(jìn)行對(duì)比分析發(fā)現(xiàn)，鐵脅迫及銹腐菌感染的人參根際土壤真菌組成豐富，結(jié)構(gòu)組成及相對(duì)豐度存在一定差異。通過(guò)對(duì)不同土壤樣品進(jìn)行NMDS和層次聚類分析分析結(jié)果表明，同時(shí)進(jìn)行鐵脅迫及銹腐菌感染會(huì)使土壤種群結(jié)構(gòu)變化顯著；在綱水平，同時(shí)進(jìn)行鐵脅迫及銹腐菌的真菌中銹腐菌屬于的 Sordariomycetes 綱相對(duì)豐度減少，Mortierellomycetes 綱顯著升高。鐵的施加沒(méi)有提高銹腐病的感染數(shù)量，而是通過(guò)改變真菌群落提高了其他真菌（Mortierellomycetes）的數(shù)量。