孫勝楠，孫銘澤，楊春，丁尚紅，張琦，郭佳，劉瑩，楊敏，彭英華※

（1.中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院特產(chǎn)研究所，長春 130112；2.延邊大學(xué)，吉林 延吉 133002）

間充質(zhì)干細(xì)胞（Mesenchymal stem cells，MSCs）因具有多項分化、歸巢、分泌多種細(xì)胞生長因子、分泌外泌體的能力，逐漸作為新的治療手段而被廣泛關(guān)注[1-2]。MSCs可直接通過細(xì)胞間接觸或分泌旁分泌因子與癌細(xì)胞相互作用，這種干細(xì)胞療法為癌癥治療提供了新的思路。研究表明，MSCs 所分泌的因子是其發(fā)揮作用的重要部分，MSCs 條件培養(yǎng)基內(nèi)含有MSCs 分泌的各種因子，并被證實對癌癥有治療作用。MSCs 的條件培養(yǎng)基可下調(diào)肝癌和乳腺癌細(xì)胞NF-B 的表達，抑制腫瘤細(xì)胞的增殖[3]。骨髓來源MSCs 釋放的可溶性因子可顯著抑制黑色素瘤、肺癌和膠質(zhì)瘤等的生長和轉(zhuǎn)移。臍帶血來源的MSCs 可通過上調(diào)腫瘤壞死因子相關(guān)凋亡誘導(dǎo)配體（TRAIL）的分泌，抑制多形性膠質(zhì)細(xì)胞瘤的增殖[4]。將MSCs 與人肝癌細(xì)胞株共培養(yǎng)，MSCs 能夠抑制肝癌細(xì)胞株增殖、促進其凋亡、下調(diào)Wnt 信號通路相關(guān)基因（Bcl-2、c-Myc、PCNA）表達。使用MSCs的條件培養(yǎng)基處理人肝癌細(xì)胞株時可獲得相同的實驗結(jié)果，這一研究證實，MSCs的旁分泌效應(yīng)參與了腫瘤的調(diào)節(jié)[5]。盡管間充質(zhì)干細(xì)胞具有多能性、趨向性等，但因其來源有限、在體外具有細(xì)胞活性較低等特點，限制了其在疾病治療中的應(yīng)用。

鹿茸是唯一能夠每年完全再生的哺乳動物組織。研究表明，鹿茸的再生是基于干細(xì)胞的再生過程。隨著鹿茸的生長，骨膜組織向間充質(zhì)組織轉(zhuǎn)化，其中的間充質(zhì)細(xì)胞仍然具有干細(xì)胞的特征[6-7]。相比之下，鹿茸組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞除了具有人源間充質(zhì)干細(xì)胞的增殖快、分化能力強等特點之外，還具有易于獲得、來源廣泛等優(yōu)點[8]。為了規(guī)避免疫原性，深入研究鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞旁的分泌作用，本試驗探討了富含旁分泌因子的鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對小鼠乳腺癌的作用，為其抗腫瘤應(yīng)用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑與儀器

胎牛血清（FBS）、青霉素-鏈霉素雙抗、0.25%胰酶、磷酸緩沖鹽溶液（Phosphate buffer saline,PBS）、膠原酶I（美國Gibco 公司）；DMEM 培養(yǎng)基、DMEM/F12培養(yǎng)基（美國Corning 公司）；總蛋白提取試劑盒、蛋白濃度測定試劑盒、ECL 發(fā)光試劑盒（上海碧云天生物技術(shù)有限公司）；Bcl-xl、cleaved-caspase 3、caspase 3、-actin一抗及二抗抗兔（美國Cell Signaling Technology公司）；CD44、CD90、CD105、CD31 一抗（美國 Biolegend 公司）；MTT 細(xì)胞增殖及細(xì)胞毒性試劑盒（北京普洛麥格生物技術(shù)有限公司）；CO2 恒溫培養(yǎng)箱（美國Thermo公司）；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀（美國Bio-Rad 公司）。

1.2 細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

1.2.1 鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞的分離、培養(yǎng) 參考Li 等[9]的分離培養(yǎng)方法，取生長初期的梅花鹿鹿茸，消毒，切取5 cm 長的鹿茸尖部，擠血。從鹿茸中部縱向切開，75%乙醇清洗 3 遍，每次2 min，PBS 洗3 遍。剝離真皮層，在解剖顯微鏡下定位并切取鹿茸間質(zhì)層，用含有雙抗的PBS 清洗間質(zhì)層組織3 次，將其切碎成沫狀，PBS 清洗后，用0.1%膠原酶I 于37℃的CO2 培養(yǎng)箱中孵育2 h。消化后離心（1000 r/min 8 min）除去消化液，用細(xì)胞培養(yǎng)液清洗2 次后轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶中，放入37℃的CO2 培養(yǎng)箱中進行培養(yǎng)，每隔2 d換液，細(xì)胞融合度達80%凍存即可。

1.2.2 小鼠乳腺癌細(xì)胞系4T1 的培養(yǎng) 使用含10%胎牛血清以及含100 U/mL 青霉素和100g/mL 鏈霉素的DMEM 培養(yǎng)基，于 37 ℃、5%CO2 培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)小鼠乳腺癌細(xì)胞4T1。

1.3 鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基的制備

用含10%FBS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基培養(yǎng)鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞，待細(xì)胞長至融合度為80%以上時，將培養(yǎng)液換為不含F(xiàn)BS 的DMEM/F12 培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)24 h后，收集培養(yǎng)上清，1 000 r/min 離心10 min，收取上清液，過0.22m 無菌濾器，80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 細(xì)胞處理

分別用0、50%、75%、100%的條件培養(yǎng)基處理4T1細(xì)胞24 h。

1.5 流式細(xì)胞術(shù)鑒定

取對數(shù)生長期的鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞，接種到6 孔板中，細(xì)胞融合度達到80%后，加入一抗（CD44、CD90、CD105、CD31），室溫避光條件下孵育30 min，流式細(xì)胞儀檢測陽性細(xì)胞率。

1.6 細(xì)胞增殖檢測

取對數(shù)生長期的4T1 細(xì)胞，均勻接種于96 孔板中，每孔1 104個，加入終濃度分別為0、50%、75%、100%的鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基，設(shè)置3次重復(fù)，增殖檢測嚴(yán)格按MTT 說明書操作。

1.7 Western Blot檢測

使用預(yù)冷的PBS清洗處理后的細(xì)胞，蛋白裂解液裂解30 min。5%的濃縮膠電泳0.5 h 后，12%分離膠電泳1 h，使用濕轉(zhuǎn)的方法將蛋白轉(zhuǎn)膜至PVDF 膜上，5%的脫脂奶粉室溫封閉1 h，一抗4℃過夜孵育，每隔5 min 使用 TBST 清洗 1 次，共洗 5 次，二抗室溫孵育1 h，TBST 洗滌 5 次，顯影。

1.8 統(tǒng)計學(xué)處理

使用圖像分析軟件Image J，對Western blot 圖像條帶進行灰度分析量化表達的蛋白。使用 GraphPad Prism 5.0 軟件對數(shù)據(jù)分析，并用two-tailed unpaired ttest 及Tukey 檢驗法進行多重統(tǒng)計學(xué)分析。

2 結(jié)果

2.1 鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞的分離

使用倒置光學(xué)顯微鏡，觀察培養(yǎng)不同階段的細(xì)胞形態(tài)，消化1 d 后的組織塊均勻貼壁于培養(yǎng)瓶底部，3～4 d可見組織塊周圍爬出少量細(xì)胞，5～7 d貼壁細(xì)胞形成群落，組織塊四周細(xì)胞呈放射狀向周邊生長。連續(xù)培養(yǎng)14 d 后，細(xì)胞融合可達80%。經(jīng)傳代培養(yǎng)，細(xì)胞成典型的單層長梭樣生長。傳代培養(yǎng)12 h 后即可完全貼壁，2 d左右細(xì)胞即可長滿整個培養(yǎng)瓶底面，并可繼續(xù)傳代擴增。P5 和 P7 代鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞呈魚群樣生長，且細(xì)胞生長狀態(tài)良好。結(jié)果見圖1。

圖1 鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)Figure 1 Morphology of antler mesenchymal stem cells

2.2 鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定

為確定所分離的間充質(zhì)細(xì)胞為實驗所需的鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞，對所分離的細(xì)胞進行干細(xì)胞表面抗原鑒定。經(jīng)流式細(xì)胞術(shù)檢測，鹿茸間充質(zhì)細(xì)胞高表達間充質(zhì)干細(xì)胞標(biāo)志蛋白為CD44（83.23%）、CD90（83.08%）、CD105（97.64%），不表達白細(xì)胞特異性標(biāo)志蛋白為CD31（1.59%）。結(jié)果表明，實驗過程中所獲得的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞的鑒定標(biāo)準(zhǔn)（圖2）。

圖2 流式細(xì)胞術(shù)檢測鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞表達表型Figure 2 Flow cytometry was used to detect the expression phenotype of antler mesenchymal stem cells

2.3 鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對4T1細(xì)胞增殖情況的影響

取對數(shù)生長期的4T1 小鼠乳腺癌細(xì)胞均勻接種于96 孔板中，分別使用0、50%、75%、100%的鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理4T1 小鼠乳腺癌細(xì)胞24h。MTT檢測結(jié)果顯示，條件培養(yǎng)基對4T1 細(xì)胞活性具有抑制作用，并且隨著條件培養(yǎng)基的濃度增加抑制作用增強。0、50%、75%、100%的鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基相對應(yīng)的細(xì)胞存活率為100%、81.1%、73.7%、59.6%。結(jié)果見圖3、表1。

圖3 MTT 法檢測鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對4T1 細(xì)胞增殖的影響Figure 3 MTT was used to detect the effect of antler mesenchymal stem cells conditioned medium on 4T1 cell proliferation

表1 鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對4T1 細(xì)胞增殖的影響Table 1 The effect of antler mesenchymal stem cells conditioned medium on 4T1 cell proliferation

2.4 鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對4T1細(xì)胞凋亡信號通路的影響

不同濃度的鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理4T1 小鼠乳腺癌細(xì)胞24 h 后，Western blot 方法檢測凋亡相關(guān)蛋白 Bcl-xl、Cleaved-caspase 3、Caspase 3 的表達水平。結(jié)果顯示，隨著條件培養(yǎng)基處理濃度的增加，4T1 細(xì)胞中Bcl-xl 蛋白表達水平呈濃度梯度下降，而Cleaved-caspase 3 蛋白表達水平呈濃度梯度升高。這一結(jié)果提示，4T1 小鼠乳腺癌細(xì)胞的增殖能力下降，是通過影響細(xì)胞中Bcl-xl、Cleaved-caspase 3 凋亡通路的 蛋白表達實現(xiàn)的。結(jié)果見圖4。

圖4 Western blot 檢測 Bcl-xl、cleaved-caspase 3、caspase 3 蛋白表達水平Figure 4 Western blot was used to detect the expression of Bcl-xl,cleaved-caspase 3 and caspase 3 in 4T1 cells

3 討論

干細(xì)胞在體外可誘導(dǎo)分化為特定的細(xì)胞和組織。近年來，隨著對其研究和應(yīng)用的不斷深入，間充質(zhì)干細(xì)胞在腫瘤治療中的潛在價值也逐漸為人們所認(rèn)識。有研究發(fā)現(xiàn)，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞可以抑制乳腺癌干細(xì)胞增殖，且抑制作用呈現(xiàn)出劑量依賴性，其原因可能是人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞具有抑制細(xì)胞周期、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡的作用，并能夠抑制PI3K 和Akt 蛋白激酶的活性，從而顯著抑制乳腺癌干細(xì)胞的增殖[10]。然而，人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞來源有限，在很大程度上限制了其在疾病治療中的應(yīng)用，相比之下，鹿茸組織來源的間充質(zhì)干細(xì)胞來源廣泛，其旁分泌作用更應(yīng)被考慮應(yīng)用于癌癥的治療。本研究分離獲得了鹿茸組織來源的間充質(zhì)細(xì)胞，經(jīng)流式細(xì)胞儀檢測，細(xì)胞不表達白細(xì)胞表面特異性標(biāo)志CD31，但可以表達CD44、CD90、CD105干細(xì)胞標(biāo)志蛋白。結(jié)果表明，實驗過程中所獲得的細(xì)胞為鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞（圖1～2）。

目前，人們對于干細(xì)胞治療疾病的作用機制尚未完全闡明，存在兩種較為認(rèn)可的機制：分化和旁分泌機制[11]。隨著研究的深入，人們發(fā)現(xiàn)旁分泌機制起重要的調(diào)控作用，即間充質(zhì)干細(xì)胞可能是通過分泌生物活性因子，對腫瘤的細(xì)胞信號通路產(chǎn)生一定的影響。干細(xì)胞的培養(yǎng)基中富含旁分泌的生物活性因子，通過條件培養(yǎng)基作用于癌細(xì)胞，可闡明旁分泌的作用效果。本研究中，鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基處理4T1 小鼠乳腺癌細(xì)胞24h后，MTT檢測結(jié)果顯示，條件培養(yǎng)基對4T1細(xì)胞的活性具有抑制作用，并隨著條件培養(yǎng)基的濃度增加抑制作用逐漸增強（圖3）。該結(jié)果證明了小鼠乳腺癌4T1 細(xì)胞的抑制依賴于旁分泌的活性因子。

在多細(xì)胞生物中，細(xì)胞凋亡是發(fā)展和維持組織穩(wěn)態(tài)的一個重要的進化保守機制，但在癌細(xì)胞中其機制會受到干擾，比如原癌基因的激活、抑癌基因的失活等，導(dǎo)致其凋亡受到顯著抑制，從而凋亡率極低[12]。細(xì)胞凋亡能導(dǎo)致細(xì)胞發(fā)生某些變化，如活化Caspases、線粒體去極化和DNA 斷裂等[13]。Bcl-2 基因家族成員編碼具有促進或抑制細(xì)胞凋亡功能的蛋白，如抗凋亡蛋白（Bcl-xl）能夠通過多種刺激抑制細(xì)胞凋亡的發(fā)生。Caspases是一個成員較多的蛋白酶家族，目前發(fā)現(xiàn)，人體內(nèi)的Caspases蛋白家族成員至少有11 種，其中Caspase 3 在細(xì)胞凋亡過程中發(fā)揮凋亡執(zhí)行因子的作用。Caspase 3 在正常情況下以酶原的形式存在，當(dāng)細(xì)胞發(fā)生凋亡時，Caspase 3 被活化成為Cleaved-caspase 3，發(fā)揮促進細(xì)胞凋亡的作用，并標(biāo)志著細(xì)胞凋亡進入不可逆轉(zhuǎn)的階段[14-15]。在本研究中，隨著條件培養(yǎng)基濃度升高，4T1 細(xì)胞中Cleaved-caspase 3 表達水平呈上升趨勢，而Bcl-xl 蛋白表達水平呈下降趨勢。這一實驗結(jié)果表明，鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基抑制乳腺癌4T1 細(xì)胞的增殖，其機制與細(xì)胞凋亡通路有關(guān)（圖4）。

綜上所述，在體外實驗中，鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基可抑制乳腺癌細(xì)胞4T1 的增殖，其機制與Cleaved-caspase 3 表達水平升高和Bcl-xl 表達水平下降有關(guān)。本研究為鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)對腫瘤的作用機制研究提供了一定的實驗依據(jù)，為進一步闡明間充質(zhì)干細(xì)胞旁分泌效應(yīng)在腫瘤治療中的作用提供了基礎(chǔ)。但由于腫瘤的表現(xiàn)和機制以及鹿茸間充質(zhì)干細(xì)胞條件培養(yǎng)基對腫瘤的作用十分復(fù)雜，其具體機制仍需進一步研究。