張曉英，饒春榮，鄭新妹，傅建煒*

(1.福建省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)業(yè)質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)與檢測技術(shù)研究所，福建福州350003；2.福建連城蘭花股份有限公司，福建龍巖366211)

國蘭指中國境內(nèi)蘭屬(Cymbidium)的地生種類，如春蘭(C.goeringii)、蕙蘭(C.faberi)、寒蘭(C.kanran)、建蘭(C.ensifolium)、墨蘭(C.sinense)等，在我國有一千余年的栽培歷史，全屬約48種，分布于亞洲熱帶與亞熱帶地區(qū)，向南到達(dá)新幾內(nèi)亞島和澳大利亞。我國有29種，廣泛分布于秦嶺山脈以南地區(qū)(吉占和，1999；陳心啟等，1998)。

蘭花作為中國的傳統(tǒng)名花，因其株型典雅、花姿優(yōu)美、幽香四溢，自古以來深受人們的喜愛，被譽為“花中君子”并賦予各種美好的寓意。蘭花種子非常細(xì)小、呈粉狀，只有在顯微鏡下才能看清楚其結(jié)構(gòu)。一般國蘭種子長1～2 mm，直徑為0.1～0.2 mm，重量只有0.3～6.5 μg，呈長紡錘形(田甜等，2009)，數(shù)量極多且非常細(xì)小，其種皮致密、透性差或種皮含有抑制物(丁秋露等，2010)，種胚經(jīng)常發(fā)育不完全或不成熟，并且沒有胚乳(潘銀萍，2011)，所以導(dǎo)致國蘭種子在自然條件下萌發(fā)率非常低。自1922年Kundson將消毒后蘭花種子播種于含糖培養(yǎng)基上成功萌發(fā)后，蘭花組培技術(shù)得到不斷的開發(fā)和完善，為蘭花雜交育種和蘭花產(chǎn)業(yè)發(fā)展奠定了堅實的技術(shù)基礎(chǔ)(劉武等，2008；周輝明等，2010；李風(fēng)童等，2015)。

本試驗選取3種國蘭傳統(tǒng)品種進(jìn)行雜交和無菌播種，以前人研究為基礎(chǔ)，通過改進(jìn)培養(yǎng)基配方來選育性狀優(yōu)良的新品種。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

本試驗選取國蘭7大類中的春蘭、建蘭和蕙蘭里的傳統(tǒng)名種為父母本材料，分別是黃梅(父本)×黃荷(母本)、君荷(父本)×市長紅(母本)、315梅(父本)×慶華梅(母本)。

1.2 雜交

2015年2月開始，在花期挑選生長良好的植株進(jìn)行雜交，采集所選品種的成熟飽滿花粉授粉到親本雌蕊柱上，做好標(biāo)記。

1.3 組培

無菌播種：在授粉后120～210 d，每隔30 d采收黃梅×黃荷，君荷×市長紅，315梅×慶華梅雜交果實進(jìn)行無菌萌發(fā)試驗。將采回的果莢用75%酒精消毒1～5 min，視果莢大小而定，然后用1%～2%的次氯酸鈉漂白液消毒20～25 min。消毒后用滅菌過的刀片將果莢切開，將果莢里的蘭花種子播種到蔗糖含量20 g·L-1的改良的MS培養(yǎng)基上，在暗培養(yǎng)室內(nèi)進(jìn)行萌發(fā)，觀察萌發(fā)率。

初代培養(yǎng)：種子成功萌發(fā)出原球莖后將其夾出，接種到蔗糖含量20 g·L-1的改良的MS培養(yǎng)基中進(jìn)行擴繁。原球莖均勻分散在增殖培養(yǎng)基上并與其充分接觸。由于原球莖增殖速度較快，因此原球莖之間的擺放不可太緊湊，留0.3～0.5 cm空隙，然后置于恒溫室內(nèi)暗培養(yǎng)，并觀察原球莖的增殖情況。

繼代培養(yǎng)：將增殖好的原球莖及根狀莖(俗稱龍根)夾出，在超凈臺內(nèi)用刀片將附著在根狀莖表面的舊培養(yǎng)基刮凈，然后接種到蔗糖含量25 g·L-1和椰子汁含量50 g·L-1的改良的MS培養(yǎng)基中誘導(dǎo)小芽，接種到催芽培養(yǎng)基中時，應(yīng)將生長大小較一致的根狀莖放在一起。

成苗培養(yǎng)：起芽后隨時觀察小芽的生長情況，待其生長至7～10 cm時即可進(jìn)行生根定植。

生根培養(yǎng)：將成功誘導(dǎo)出的國蘭小芽切下，不可弄傷假鱗莖和小芽，切下后接種到生根培養(yǎng)基中進(jìn)行定植生根。定植時需將小芽的假鱗莖壓至培養(yǎng)基內(nèi)2/3處左右，如小芽已有生根，盡量保留其根部定植于培養(yǎng)基中。生根定植后期適當(dāng)添加光照，防止煉苗時小苗葉片起斑點。待小苗生根成功后將其轉(zhuǎn)移到煉苗室內(nèi)進(jìn)行煉苗、壯苗。煉苗要適當(dāng)遮光，不可陽光直射，避免小苗焦尖等。

出瓶移栽：將煉好的小苗掏出，并用清水將根部的培養(yǎng)基洗凈，避免根部發(fā)霉死苗。洗干凈的小苗晾干后種植于大棚內(nèi)。前期需做好水分的調(diào)控，防止焦尖。

2 結(jié)果與分析

2.1 雜交種子萌發(fā)

由各組萌發(fā)情況(表1)可知，種子的萌發(fā)情況與種子的成熟度密切相關(guān)，不同成熟度的果實，對種子的萌發(fā)影響較大。授粉后150～180 d的種子，播種后種子萌發(fā)率達(dá)60%以上，萌發(fā)效果較好，因此，采收時期以150～180 d為佳。

表1 不同采收時期播種萌發(fā)情況Table 1 Germination of various seeds obtained at different harvesting stages

2.2 培養(yǎng)基

本試驗使用的是改良的MS培養(yǎng)基。在種子無菌萌發(fā)和初代培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入蔗糖(20 g·L-1)，在繼代培養(yǎng)的培養(yǎng)基中加入蔗糖(25 g·L-1)和椰汁(50 g·L-1)，種子能正常萌發(fā)，不定芽形成且生長健壯，并成功獲得了生長健壯的雜交后代完整植株(圖1，表2)；3個組合雜交后代均獲得小苗種植于大棚內(nèi)(圖2)。

圖1 不同雜交組合后代在改良MS培養(yǎng)基的生長情況Figure 1 Growth of progenies of different hybrid combinations on improved MS medium

表2 不同雜交組合后代生長情況Table 2 Growth of progenies of different hybrid combinations

圖2 雜交后代的幼苗生長情況Figure 2 The seedlings of hybrid offspring

圖1 (a)、圖2(a)黃梅×黃荷雜交后代小苗，葉尖圓鈍，葉姿中垂型。圖1(b)、圖2(b)君荷×市長紅雜交后代芽點與其母本市長紅新芽一樣，均帶有粉紅色。圖1(c)、圖2(c)為315梅×慶華梅雜交后代苗芽，與母本相似，其葉脈清晰可見。

3 討論與結(jié)論

蘭屬的種子萌發(fā)難，其原因可能是由于胚發(fā)育不全或無胚乳，也可能是由于種皮較厚、結(jié)構(gòu)致密，阻礙了空氣和水的透入，還有可能存在抑制萌發(fā)的物質(zhì)(祝鵬芳等，1997)。相關(guān)資料顯示，一般用半成熟的種子進(jìn)行培養(yǎng)萌發(fā)，這可能是因為蘭花種子里的抑制物質(zhì)隨著種子成熟逐漸形成并加強，且未成熟種子更容易滅菌(陳光祿，1983)。徐曉薇等(2011)研究了果齡對寒蘭雜交種子萌發(fā)的影響，發(fā)現(xiàn)雜交授粉后180～240 d為寒蘭種子的最佳采收時間，早于180 d，種子萌發(fā)欠佳，晚于240 d，種子萌發(fā)率顯著下降。以上研究均表明，蘭花種子在不同發(fā)育階段存在不同的萌發(fā)特性。本試驗對春蘭(黃梅×黃荷)、建蘭(君荷×市長紅)、蕙蘭(315梅×慶華梅)不同時期采摘的果莢在無菌萌發(fā)過程中的萌發(fā)情況進(jìn)行觀察，結(jié)果表明，種子的萌發(fā)數(shù)量與種子的成熟度密切相關(guān)。授粉后150～180 d的種子，播種后可獲得理想的無菌萌發(fā)效果，種子萌發(fā)率達(dá)60%以上。因此，采收時期以150～180 d為佳。

蘭屬組織培養(yǎng)的培養(yǎng)基種類較多，無菌播種最常用的基本培養(yǎng)基有：MS、I/2SH、VW、White等 (李方等，1998；張志勝等，2001；陳菁瑛等，2004；范成明等，2003)。 原球莖誘導(dǎo)增殖的培養(yǎng)基，常用的是改良的 Knudson C、MS、Kyoto、White、VW(張菊野等，1993；王熊，1990)。曾宋君等(1998)對墨蘭無菌萌發(fā)研究發(fā)現(xiàn)，在以10%椰子汁、香蕉汁、蘋果汁、綠豆汁作添加物時，椰子汁對胚萌發(fā)的促進(jìn)作用最大；活性炭對胚萌發(fā)的促進(jìn)作用不明顯。鄭琪等(2007)認(rèn)為，活性炭能提高雜交春蘭種子的萌發(fā)率。朱國兵(2006)在寒蘭的無菌萌發(fā)研究中也發(fā)現(xiàn)活性炭對寒蘭種子萌發(fā)有促進(jìn)作用。本試驗在種子無菌萌發(fā)和初代培養(yǎng)改良的MS培養(yǎng)基中加入蔗糖(20 g·L-1)，在繼代培養(yǎng)改良的培養(yǎng)基中加入蔗糖(25 g·L-1)和椰汁(50ml g·L-1)，春蘭(黃梅×黃荷)、建蘭(君荷×市長紅)、蕙蘭(315梅×慶華梅)雜交的F1代種子在改良的MS培養(yǎng)基上能正常萌發(fā)，并成功獲得生長健壯的雜交后代完整植株，為進(jìn)一步篩選株型適中且抗逆性強的新種質(zhì)提供了基礎(chǔ)，對今后開展蘭屬雜交育種以及優(yōu)良株系的快速繁殖提供了參考。