吳曉婷， 常 悅， 賴榮泉?， 陳志厚， 郭萍婷， 白晶晶

(1.福建農(nóng)林大學(xué)植物保護(hù)學(xué)院， 閩臺作物有害生物生態(tài)防控國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，福建 福州350002； 2.福建省煙草公司南平市公司， 福建 南平353000)

化感作用是指植物或微生物的代謝分泌物對環(huán)境中其它植物或微生物有利或不利的作用(吳曉華，2010)。 植物可通過釋放化感物質(zhì)來實(shí)現(xiàn)其化感作用，而化感物質(zhì)的釋放途徑包括揮發(fā)、分泌、腐解、淋溶(王大力，1998；韓麗梅等，2002)和花粉直感(Jimenezet al，1983)等。 植物化感作用不僅對作物的輪作、間作、套作的合理安排有重大影響，而且可有效控制農(nóng)作物病蟲草害的發(fā)生(楊陽等，2013；李軒等，2013)。

目前大蒜被認(rèn)為是良好的前茬作物，而大蒜根系分泌物是前茬影響后茬的主要物質(zhì)，在農(nóng)業(yè)間套作體系中應(yīng)用非常普遍且效應(yīng)良好(丁海燕，2017)。 張磊等(2015)研究大蒜根系分泌物對當(dāng)歸的化感作用時發(fā)現(xiàn):隨著大蒜濃度的提高，大蒜根系分泌物對當(dāng)歸種子的發(fā)芽勢、發(fā)芽率和發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)出先增加后降低的促進(jìn)提高作用。 劉素慧等(2011)發(fā)現(xiàn)含有大蒜根系分泌物的混合瓊脂培養(yǎng)基對受體作物種子的萌芽和生長均有一定的抑制作用，而且隨著分泌物比例的增大，抑制程度也越明顯。 周艷麗等(2012)發(fā)現(xiàn)乙酸乙酯組分中所含的化感物質(zhì)為:2，6-二異丙基苯酚、2，6-二叔丁基對甲酚、二烯丙基二硫化物和鄰苯二甲酸二丁酯。 李春龍(2018)發(fā)現(xiàn)化感物質(zhì)香豆酸對豌豆種子萌發(fā)、幼苗根長和幼苗苗高等指標(biāo)均表現(xiàn)出“低濃度促進(jìn)、高濃度抑制”的效應(yīng)。 賴榮泉等(2010)研究表明大蒜根系分泌物對烤煙幼苗有一定的抑制作用，對其成株無明顯影響，但其主要成份對烤煙的化感作用未見報(bào)道。

因此研究大蒜根系分泌物，特別是其主要成份對烤煙的化感作用具有重大意義。 本試驗(yàn)通過收集大蒜根系分泌物，并分析其主要成份對烤煙K326 的種子萌發(fā)、幼苗生長及成株的生理指標(biāo)的影響，來研究大蒜根系分泌物的化感作用，以期為大田利用大蒜間作、套種或連作等提供科學(xué)參考。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試材料為大蒜(山東孝賢故里尋味魚臺生產(chǎn)紫皮蒜)、受體材料為“烤煙K326”(福建省煙草農(nóng)業(yè)科學(xué)研究所南平分所提供)。

試劑:鄰苯二甲酸二丁酯(99.5%，天津市恒興化學(xué)試劑制造有限公司生產(chǎn))、2，6-二叔丁基對甲酚(99%，麥克林試劑制造有限公司生產(chǎn))。

儀器:氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀(Agilent 6890 B-5977 A，中國安捷倫科技有限公司生產(chǎn))、智能光照培養(yǎng)箱(ZGX-300 C，中國杭州錢江儀器有限公司制造)、真空數(shù)種儀(ZL-2000 D，中國杭州錢江儀器有限公司制造)、葉綠素含量測定儀(A1RT-207，中國杭州錢江儀器有限公司生產(chǎn))。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 大蒜根系分泌物的獲取 采用沙培、沙土培和水培3 種栽培方法對大蒜根系分泌物進(jìn)行收集。

沙培:首先挑選大小均一蒜瓣，剝?nèi)ネ庖?，用流水沖洗2 h，晾干。 將其播入裝有2 cm 純沙的塑料瓶中(高:8.2 cm；上直徑:9 cm；下直徑:8 cm)，每瓶5 瓣，以不種大蒜為對照，每個處理重復(fù)4 次，室內(nèi)培養(yǎng)。 培養(yǎng)過程中每天下午5:00 加入8 mL 水以保證蒜瓣生長，40 d 后拔出，用蒸餾水淋洗根系，靜置數(shù)分鐘后過濾，即得到大蒜根系分泌物。

沙土培:將挑選好的大蒜播種到裝有2 cm 沙土中(沙土比7 ∶3)，40 d 后拔出大蒜，用蒸餾水淋洗根系，靜置數(shù)分鐘后過濾，即得到大蒜根系分泌物。

水培:將挑選好的大蒜播種到裝有2 cm 水中，用棉花固定，40 d 后拔出大蒜，用蒸餾水清洗根系，將大蒜更換到另一個塑料瓶中(直徑約13 cm)，加入蒸餾水，5d 后收集培養(yǎng)液，所收集的培養(yǎng)液即為大蒜根系分泌物。

1.2.2 大蒜根系分泌物主要成份的測定 參照周艷麗(2007)方法并加以修改，采用萃取法將所得的根系分泌物用乙酸乙酯進(jìn)行萃取，各取3 種收集方法大蒜根系分泌物3 mL，按乙酸乙酯∶分泌物體積比為2 ∶1 的比例萃取3 次，萃取后大蒜根系分泌物主要成份在下層液體中，然后將上述三種樣品經(jīng)無水硫酸鈉干燥后，用氣相-質(zhì)譜聯(lián)用儀測定其主要成份。

1.2.3 對烤煙種子發(fā)芽影響的測定 參照周艷麗(2007)方法:選取鄰苯二甲酸二丁酯(本文測出，含量最高)和2，6-二叔丁基對甲酚(據(jù)報(bào)道使用最多)兩種物質(zhì)，分別稱取0.1 g 的2，6-二叔丁基對甲酚和量取0.1 mL 的鄰苯二甲酸二丁酯于兩個100 mL 容量瓶中，用少量乙醇溶解后用蒸餾水定容，定容后的溶液為母液，將母液稀釋為100、500、1 000 mg·L-1的溶液，以乙醇為對照，每個濃度重復(fù)三次。 先在培養(yǎng)皿(直徑9 cm)中放兩層定性濾紙，再用移液槍吸取各溶液9 mL 于培養(yǎng)皿中，待乙醇完全揮發(fā)后加入蒸餾水9 mL，對照先加9 mL 乙醇，待揮發(fā)后加等量的蒸餾水，然后用真空數(shù)種儀數(shù)100 粒K326 煙草種子于培養(yǎng)皿中，放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng)(溫度:25 ℃，相對濕度:40.3%)，并于每天下午5:00 滴加蒸餾水3 mL，以保持濾紙濕潤。于5 d 后，每天調(diào)查種子的發(fā)芽情況及數(shù)量，根據(jù)以下公式計(jì)算種子的發(fā)芽率、發(fā)芽指數(shù)、化感效應(yīng)指數(shù)。 并于20 d 后，在每個培養(yǎng)皿中選取幼苗5 株，測定其根長、苗高、鮮重。

發(fā)芽率/%＝(置床后第7 d 正常發(fā)芽種子數(shù)/供試種子數(shù))×100

發(fā)芽指數(shù)＝Σ(Gt/Dt)

式中:Gt為播種t日的發(fā)芽數(shù)；Dt為相應(yīng)的發(fā)芽日數(shù)。

化感效應(yīng)指數(shù)(RI):當(dāng)T≥C時，RI＝1-C/T；當(dāng)T＜C時，RI＝T/C-1

式中:C為發(fā)芽指數(shù)對照值，T為發(fā)芽指數(shù)處理值(RI＞0 為促進(jìn)作用，RI＜0 為抑制作用，RI絕對值代表作用強(qiáng)度大小)

1.2.4 對煙株成苗生長影響的測定 采用漂浮育苗，播種45 d 后，選取長勢均一幼苗移載置花盆中，每盆1 株，共24 盆，自然生長，每株煙株基部分別澆灌9 mL 濃度為100、500、1 000 mg·L-1的兩種試劑，乙醇為對照，每個濃度三次重復(fù)，每隔3 d 澆灌一次，共澆灌3 次。10 d 后選取各煙株同一部位的煙葉測量葉綠素含量，并選取濃度為1 000 mg·L-1的煙株測根系活力大小(葉尚紅，2004)。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用Excel 2010 與SPSS 19.0 對數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，進(jìn)行單因素方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 大蒜根系分泌物成份分析

采用沙培、沙土培和水培方法收集大蒜根系分泌物，用乙酸乙酯萃取后利用GC/MS 進(jìn)行質(zhì)譜掃描，圖譜分別見圖1～3，各成份相對含量見表1。

圖1 沙培大蒜根系分泌物中乙酸乙酯組分的GC/MS 鑒定圖譜Figure 1 GC/MS spectrum of ethyl acetate fraction in the sand culture of the garlic root exudates

圖2 沙土培大蒜根系分泌物中乙酸乙酯組分的GC/MS 鑒定圖譜Figure 2 GC/MS spectrum of ethyl acetate fraction in sand and soil culture of the garlic root exudates

圖3 水培大蒜根系分泌物中乙酸乙酯組分的GC/MS 鑒定圖譜Figure 3 GC/MS spectrum of ethyl acetate fraction in the water culture of the garlic root exudates

表1 大蒜根系分泌物中乙酸乙酯相成份Table 1 Allelochemicals of ethyl acetate fractions in the garlic root exudates

由圖1 和表1 可知，沙培大蒜根系分泌物乙酸乙酯組分中的物質(zhì)成份，按照百分含量由高到低依次為:鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯(正辛烷的4 位)、3，4-己烷二乙基、2-丁烯酸，4-硝基苯基酯。 由圖2 和表1 可知，沙土培中的物質(zhì)成份，按照百分含量由高到低依次為:鄰苯二甲酸二丁酯、己二酸二辛酯(正辛烷的4 位)、2，4-二(1，1-二甲基乙基)苯酚、1，2-苯二甲酸二異丁酯。 由圖3 和表1 可知，水培中的物質(zhì)成份，按照百分含量由高到低依次為:2，4-二(1，1-二甲基乙基)苯酚、1，2-苯二甲酸，丁基辛酯、1，2-苯二甲酸，丁基2-甲基丙基酯、鄰苯二甲酸二丁酯。

2.2 大蒜根系分泌物主要成份對烤煙的化感作用

2.2.1 大蒜根系分泌物主要成份對烤煙種子發(fā)芽及幼苗生長的影響 本試驗(yàn)測出的大蒜根系分泌物主要成份與報(bào)道的有些差異(周艷麗等，2007；李春龍，2018)，因此，本次試驗(yàn)選擇測出的主要成份鄰苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基對甲酚(經(jīng)查閱文獻(xiàn)，前人用此試劑去測定對蘿卜種子等化感作用)來測定對烤煙K326 的化感作用。

用不同濃度的鄰苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基對甲酚處理烤煙種子，測量其發(fā)芽率以及幼苗的根長、苗高和鮮重，并計(jì)算化感作用效應(yīng)，結(jié)果見圖4 和表2。 由圖4(a)可知隨著試劑濃度的升高，烤煙種子的發(fā)芽率呈逐漸降低的趨勢，用鄰苯二甲酸二丁酯處理后的發(fā)芽率從90%下降至83%，用2，6-二叔丁基對甲酚處理后的發(fā)芽率從90.33%下降至85.33%，不同濃度的兩種試劑對煙草種子的影響達(dá)到了顯著水平(鄰苯二甲酸二丁酯:F3，8＝5.447，P＝0.025；2，6-二叔丁基對甲酚:F3，8＝6.099，P＝0.018)。 由圖4(b)可知，隨著試劑濃度的升高，烤煙種子的苗高逐漸降低，用鄰苯二甲酸二丁酯處理后的苗高從0.41 cm 下降至0.17 cm，用2，6-二叔丁基對甲酚處理后的苗高從0.51 cm 下降至0.22 cm，不同濃度的兩種試劑對幼苗苗高的影響達(dá)到了顯著水平(鄰苯二甲酸二丁酯:F3，8＝162.110，P＝0.000；2，6-二叔丁基對甲酚:F3，8＝150.882，P＝0.000)。 由圖4(c)可知隨著試劑濃度的升高，烤煙種子的根長逐漸降低，用鄰苯二甲酸二丁酯處理后的根長從0.46 cm 下降至0.11 cm，用2，6-二叔丁基對甲酚處理后的根長從0.57 cm 下降至0.11 cm，不同濃度的兩種試劑對幼苗根長的影響達(dá)到了顯著水平(鄰苯二甲酸二丁酯:F3，8＝326.21，P＝0.000；2，6-二叔丁基對甲酚:F3，8＝343.494，P＝0.000)。 由圖4(d)可知隨著試劑濃度的升高，烤煙種子的鮮重逐漸降低，用鄰苯二甲酸二丁酯處理后的鮮重從0.018 g 下降至0.015 g，用2，6-二叔丁基對甲酚處理后的鮮重從0.019 g 下降至0.017 g，不同濃度的兩種試劑對幼苗鮮重的影響達(dá)到了顯著水平(鄰苯二甲酸二丁酯:F3，8＝37.333，P＝0.000；2，6-二叔丁基對甲酚:F3，8＝3.818，P＝0.058)。

圖4 鄰苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基對甲酚對烤煙的影響Figure 4 Effects of dibutyl phthalate and 2，6-di-tert-butyl-p-cresol on flue-cured tobacco

由表2 可知，在不同濃度鄰苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基對甲酚處理下，烤煙種子發(fā)芽指數(shù)均呈現(xiàn)逐漸下降的趨勢，且濃度越大，發(fā)芽指數(shù)越小。 兩種不同濃度試劑處理下，化感效應(yīng)指數(shù)均小于0，且隨著濃度的不斷增加，絕對值也逐漸增加，當(dāng)鄰苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基對甲酚濃度為1 000 mg·L-1時，化感效應(yīng)指數(shù)分別為-0.10 和-0.07。

鄰苯二甲酸二丁酯化感效應(yīng)指數(shù)與濃度的線性回歸方程為:Y＝-14.090X-0.047(X為鄰苯二甲酸二丁酯不同濃度，Y為化感效應(yīng)指數(shù))，判定系數(shù)R2＝0.968，濃度與化感效應(yīng)指數(shù)之間有一定的線性關(guān)系。 2，6-二叔丁基對甲酚化感效應(yīng)指數(shù)與濃度的線性回歸方程為:Y＝-14.090X-0.017(X為2，6-二叔丁基對甲酚不同濃度，Y為化感效應(yīng)指數(shù))，判定系數(shù)R2＝0.968，濃度與化感效應(yīng)指數(shù)之間有一定的線性關(guān)系。

表2 鄰苯二甲酸二丁酯和2，6-二叔丁基對甲酚對烤煙的化感效應(yīng)指數(shù)和發(fā)芽指數(shù)的影響Table 2 Effect of dibutyl phthalate and 2，6-di-tert-butyl-p-cresol on allelopathic effect index and germination index of flue-cured tobacco

2.2.2 大蒜根系分泌物主要成份對成苗葉綠素和根系活力的影響 由表3 可知，隨著鄰苯二甲酸二丁酯濃度的升高，烤煙K326 成苗的葉綠素含量與對照相比總體表現(xiàn)為低濃度促進(jìn)、高濃度抑制，但處理與對照之間差異不顯著(F3，8＝0.770，P＝0.542)。 2，6-二叔丁基對甲酚各濃度處理下烤煙K326 成苗的葉綠素含量較對照均有所增加，但差異不顯著(F3，8＝0.031，P＝0.992)。 當(dāng)兩種試劑濃度均為1 000 mg·L-1時，鄰苯二甲酸二丁酯對烤煙成苗根系活力的抑制率為53%，2，6-二叔丁基對甲酚對烤煙成苗根系活力的抑制率為38%。

表3 化感物質(zhì)對烤煙成苗葉綠素及根系活力的影響Table 2 Effects of allelochemicals on chlorophyll and root activity of flue-cured tobacco seedlings

3 結(jié)論與討論

作物根系分泌物中含有多種化感物質(zhì)成份，化感作用又與物種、品種及濃度有密切關(guān)系(王薇薇等，2018)。 周艷麗(2007)測出的大蒜根系分泌物的化感物質(zhì)有2，6-二叔丁基對甲酚、2，6-二異丙基苯酚、鄰苯二甲酸二丁酯、二烯丙基二硫化物，本次試驗(yàn)只測出了鄰苯二甲酸二丁酯，與周艷麗結(jié)果有差異，可能是由于大蒜品種不同或培養(yǎng)時間不同等原因造成的這一結(jié)果。 有研究表明:鄰苯二甲酸二丁酯對黃瓜種子萌發(fā)及幼苗生長有顯著促進(jìn)作用(李軼修等，2009)。 賴榮泉等人(2010)研究發(fā)現(xiàn):大蒜揮發(fā)物對烤煙種苗鮮物質(zhì)的積累具有明顯抑制作用，新鮮大蒜乙醇提取物對不同烤煙品種發(fā)芽具有較強(qiáng)的抑制作用，種過大蒜的土壤可抑制不同烤煙品種種苗鮮物質(zhì)的積累，但大蒜提取物及種過大蒜的土壤對不同烤煙品種成苗無顯著的抑制作用。 本次試驗(yàn)結(jié)果表明:隨著大蒜根系分泌物中的化感物質(zhì)濃度的升高，對烤煙K326 種子萌發(fā)以及幼苗的苗高、根長、鮮重均表現(xiàn)為降低，說明隨著化感物質(zhì)濃度的升高，其對K326 種子萌發(fā)以及幼苗的苗高、根長、鮮重抑制作用逐漸增強(qiáng)，但是對成苗煙株的葉綠素含量和根系活力沒有顯著的影響，抑制效果不明顯，且鄰苯二甲酸二丁酯對烤煙幼苗的苗高、根長和鮮重的降低趨勢較2，6-二叔丁基對甲酚明顯。 本試驗(yàn)得出的結(jié)論與賴榮泉等人(2010)的研究結(jié)果一致。 而黃翔杰等(2017)研究了2，4-二叔丁基苯酚和鄰苯二甲酸二乙酯兩種化感物質(zhì)對生菜鮮重、萵苣和油菜胚根生長的化感作用，并發(fā)現(xiàn)不同的化感物質(zhì)對同一植物化感作用不同，而同一化感物質(zhì)對不同植物的化感作用也不一定相同。

由于本試驗(yàn)中選取的兩種化感物質(zhì)不能完全代表大蒜根系分泌物主要成份，因此還需要進(jìn)一步探討、驗(yàn)證大蒜根系分泌物的其他主要成份對K326 的化感作用。