焦曉霖，繆天琳，張秀梅*，王長寶*

(1.佳木斯大學 理學院，黑龍江 佳木斯 154007；2.佳木斯大學 生命科學學院，黑龍江 佳木斯 154007)

鈴蘭(ConvallariamajalisL.)又稱香水草、山谷百合，是百合科的多年生草本植物，通常生于西北、東北和華北地區(qū)的林緣灌叢中或針闊混交林林下[1-2]。鈴蘭可以帶花全草入藥，它的莖和葉中含有的鈴蘭毒甙具有強心利尿的功能。從鈴蘭中還可提取在國際上被列為上等名貴香料的鈴蘭浸膏，它可以用來調配多種花香型香精，常用在香皂、化妝品等的生產制作之中[3]。因為鈴蘭種子的收集非常困難，且鈴蘭的繁殖系數很低，難以滿足日益增長的市場需求[4]，所以當前廣泛應用于生產的繁育方式主要是通過組織培養(yǎng)獲得組織培養(yǎng)苗，然而在組織培養(yǎng)過程中鈴蘭外植體的褐變普遍發(fā)生，這已成為影響鈴蘭大規(guī)模繁殖的主要因素，因此鈴蘭組織培養(yǎng)能否成功的關鍵是抑制褐變的產生。本研究基于前人有關褐變的報道上通過暗培養(yǎng)處理以及在培養(yǎng)基中添加吸附劑聚乙烯吡咯烷酮(PVP)和活性炭(AC)、抗氧化劑硫代硫酸鈉(Na2S2O3)和抗壞血酸(VC)等4種抑褐劑的方法，獲得抑制鈴蘭褐變的最佳方法。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 外植體的選取。選擇健壯生長的鈴蘭植株，將其根莖作為外植體材料。

1.1.2 培養(yǎng)基?；九囵B(yǎng)基為MS+ 6-BA 0.3 mg/L + NAA 0.1 mg/L[5]，MS培養(yǎng)基中附加9.0 g /L的瓊脂粉和30.0 g/L的蔗糖，pH為6.0。

1.2 處理方式

將鈴蘭的根莖段先用表面活性劑清洗，除去表面的塵土和雜質等，再用水流沖洗30 min，將其置于超凈工作臺上用75%的乙醇消毒30 s，用無菌水沖洗3～4次，即刻浸入濃度為0.1%的HgCl2溶液中消毒8 min，用無菌水沖洗3～4次，用已滅菌的濾紙將其吸干，最后將鈴蘭根莖切成長約0.3 cm 的長度、并具有1個節(jié)間的根莖段[6]，將其分別接種于對應的培養(yǎng)基上。培養(yǎng)溫度為25 ℃，光照時間為12 h/d，光照強度為2000～2500 lx。每種處理方式接種5瓶，每瓶接種4個外植體，進行3次重復試驗，30 d后統(tǒng)計褐變率。

1.2.1 抗褐變劑對鈴蘭根莖組培的褐變影響實驗。將外植體分別接種在添加以下濃度抗褐變劑的培養(yǎng)基中，將不含抗褐變劑的一組作為對照實驗(CK)，最后計算褐變率并比較。

表1 不同類型和濃度的抗褐變劑

1.2.2 暗培養(yǎng)對鈴蘭根莖組培的褐變影響實驗。將外植體接種于基本培養(yǎng)基上，在以下4個條件下培養(yǎng)：(1) 接種后，在25 ℃的條件下進行黑暗處理5 d，然后轉移至光培養(yǎng)，光照時間為12 h/d;(2)接種后,在25℃下進行黑暗處理10 d,后轉移至光培養(yǎng),光照時間為12 h/d;(3) 接種后,在25 ℃下進行黑暗處理15 d,后轉移至光培養(yǎng),光照時間為12 h/d;(4)接種后,在25 ℃下直接進行光培養(yǎng),光照時間為12 h/d,并以此組作為對照組(CK)。最后，計算褐變率以及記錄誘導出的芽的生長情況并進行比較。

1.3 數據統(tǒng)計

用Excel和 SPSS 20.0 統(tǒng)計軟件對原始數據進行處理。

2 結果與分析

2.1 抗褐變劑對鈴蘭根莖組培褐變的影響

在培養(yǎng)基中加入不同濃度的抗吸附劑和抗氧化劑可以明顯降低鈴蘭外植體的褐變程度，褐變率均低于CK，且PVP的最佳濃度為2.0 g/L，褐變率為33.33%；VC的最佳濃度為2.0 g/L，褐變率為25.33%；Na2S2O3的最佳濃度為0.5 g/L，褐變率為50.00%；AC的最佳濃度為0.5 g/L，褐變率為30.00%。其中，2.0 g/L的VC抗褐變劑效果最好，比CK低41.34%，實驗結果如圖1所示。

圖1 不同種類抑褐劑濃度對褐變的影響

2.2 暗培養(yǎng)對鈴蘭根莖組培的褐變影響

在許多的植物組織培養(yǎng)中適當的暗處理可推遲或減輕褐變的發(fā)生，經暗處理后外植體的褐變率均低于CK，隨著暗處理的時間的增加，褐變率逐漸降低，但暗處理10 d的效果最好，褐變率比CK降低41.67%,且誘導出來的芽色澤鮮嫩長勢良好。盡管經15 d的暗處理褐變率最低，但因為暗處理時間過長導致誘導長出的芽生長和發(fā)育情況并不理想。實驗結果如表2所示。

表2 暗培養(yǎng)對褐變的影響

3 結果與討論

近些年來，前人針對植物組織培養(yǎng)中普遍發(fā)生的褐變問題做了大量的研究[7-9]，認為褐變是指接種外植體后，在組培過程中，因切割造成細胞的損傷，使傷口處分泌出酚類化合物，在有氧的條件下，酚類化合物在多酚氧化酶(PPO)的催化作用下氧化為醌，醌再通過非酶促反應產生有色物質使組織發(fā)生褐變，呈棕褐色或深褐色，并逐步擴散到培養(yǎng)基中，抑制細胞內其它酶的活性，從而影響細胞的正常代謝，毒害整個組織，甚至導致愈傷組織的凋亡。外植體的褐變程度與培養(yǎng)條件、吸附劑的添加物等因素具有很大的相關性。適宜的培養(yǎng)條件、添加適合的吸附劑等因素可以有效地削減褐變對植物組織培養(yǎng)的影響。

抗褐變劑抑制外植體的褐變主要是通過降低底物(如酚類物質)、相關酶活性以及改變相關基因的表達方式來實現。不同的抗褐變劑的對外植體的抗褐變效果是不同的，本實驗對抗褐變劑的研究表明，PVP、VC、AC和Na2S2O3這4種抗褐變劑均具有減少褐變的作用，這是因為吸附劑PVP和AC具有較強的吸附能力，可以吸附外植體傷口處分泌的酚類物質及其被氧化而生成的醌，從而防止外植體褐變的產生；抗氧化劑VC可改變外植體周圍的氧化還原電位，將酚氧化酶的Cu2+還原成Cu+，從而抑制酚類的氧化，減少褐變；抗氧化劑Na2S2O3則可影響酚類化合物與酶的結合，致使褐變減少[10-12]。本實驗結果與陳瑤瑤等[13]、段文武等[14]的研究報告中這幾種抗褐變劑對外植體有抑褐作用的結果一致，在培養(yǎng)基中添加防止酚類氧化的抗氧化劑和吸收醌類物質的吸附劑可減少褐變的產生。

對外植體進行暗培養(yǎng)的研究結果表明，適當的暗培養(yǎng)可降低鈴蘭外植體的褐變率。如果時間過短，抑制褐變的效果不明顯，原因可能是前期采用暗培養(yǎng)可以抑制酚類化合物的合成，降低多酚氧化酶的活性，減少酚類的氧化，從而減輕褐變，然而如果暗培養(yǎng)處理的時間過長，誘導產生的根莖芽的存活率會降低。在王倩穎等[15]的研究中顯示，培養(yǎng)初期的黑暗環(huán)境培養(yǎng)可以降低外植體的褐變程度，隨著暗培養(yǎng)時間的延長，其葉片和莖段的褐變程度逐漸增加，但根部褐變程度卻逐漸降低，這是因為植物的根部對光不敏感，因此隨著暗培養(yǎng)的時間的增長，根莖段的褐變率降低，這與本實驗中采用鈴蘭根莖為外植體的結果一致。但夏小環(huán)等[16]的試驗結果顯示，在暗培養(yǎng)的條件下，外植體會發(fā)生嚴重褐變，這可能與實驗采用的外植體的材料以及材料的部位有關。

綜上所述，在單因素影響下，對外植體進行適當暗培養(yǎng)處理，在培養(yǎng)基中添加抗褐變劑均可降低褐變率，且暗培養(yǎng)10 d的效果最佳，抗褐變劑對外植體褐變的影響為VC(2.0 g/L)>AC(0.5 g/L )>PVP(2.0 g/L)> Na2S2O3(0.5 g/L)。