王偉青 宋東坡 于春冬 呂金峰 李文杰

1 病例資料

男，14 d，因新生兒疾病篩查肉堿異常入青島市婦女兒童醫(yī)院就診。

患兒系G2P2，胎齡41周，出生體重3 350 g，Apgar評分10分。父母體健、非近親結(jié)婚，母親孕期產(chǎn)檢未發(fā)現(xiàn)異常。有一胞兄16歲，體健，智力及體格發(fā)育正常。母親自述自己有一胞妹8歲因病去世，病因未明。

體格檢查：體重3 490 g，身長48 cm，頭圍30 cm，營養(yǎng)發(fā)育良好。精神反應(yīng)可，心肺聽診無異常，呼吸43·min-1，前囟平軟，淺表淋巴結(jié)未觸及，雙側(cè)瞳孔反射未見異常，神經(jīng)系統(tǒng)查體未見異常，腹軟，肝脾無腫大，四肢活動好，肌張力正常。皮膚黏膜生理性黃疸未退，無皮疹。

實(shí)驗(yàn)室檢查：血常規(guī)WBC 5.98×109·L-1，RBC 3.86×1012·L-1，Hb 102 g·L-1，PLT 279×109·L-1。新生兒疾病篩查結(jié)果異常，多項(xiàng)?；鈮A增高(表1)。氣相色譜-質(zhì)譜法聯(lián)用分析顯示尿液有機(jī)酸無特異性改變。顱腦和腹部B超未見異常。

基因檢測：取得患兒家長知情同意后，分別抽取患兒及其父母外周血2 mL，使用QIAGEN?試劑盒提取基因組DNA，純化擴(kuò)增后用MiSeq測序儀(Illumina Inc，USA)對4 811個臨床相關(guān)基因的外顯子區(qū)域進(jìn)行二代高通量測序。TruSight One Sequencing Panel根據(jù)人類基因突變數(shù)據(jù)庫(HGMD Professional)、在線人類孟德爾遺傳數(shù)據(jù)庫(OMIM)、GeneTests網(wǎng)站 (www.genetests.org)、Illumina等公司的其他商業(yè)化試劑盒的信息，使用BWA算法將所有數(shù)據(jù)與參考序列(UCSC hg19)進(jìn)行比較[1, 2]。通過篩選和生物信息學(xué)軟件(PolyPhen，Variant Taster和SPIDEX)分析預(yù)測結(jié)果，對基因的功能、變異情況以及遺傳模式進(jìn)行分析，得到可疑候選突變，根據(jù)蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和突變位置結(jié)構(gòu)保守性預(yù)測該基因突變對蛋白功能的影響。對患兒行基因測序和父母驗(yàn)證后發(fā)現(xiàn)，該患兒存在ETFDH基因復(fù)合雜合突變，即c.872T>G(p.Val291Ala)和c.1084G>A(p.Gly362Arg)，其中c.872T>G來自父親，c.1084G>A來自母親，支持多種?；o酶A脫氫酶缺乏癥(MADD)的診斷(圖1)。根據(jù)HGMDpro數(shù)據(jù)庫顯示，ETFDH基因c.872T>G為臨床意義未明突變，SPIDEX軟件預(yù)測影響外顯子剪接可能較小(預(yù)測值78)，Polyphen軟件預(yù)測結(jié)果為致病，SIFT軟件預(yù)測為有害(0.009)。c.1084G>A為疑似致病突變，SPIDEX軟件預(yù)測可能會影響外顯子剪接以形成新的剪接位點(diǎn)(預(yù)測值1.4)，Polyphen和SIFT軟件預(yù)測結(jié)果分別為致病和有害(0.034)。

圖1 病例家系測序結(jié)果

注 患兒存在ETFDH基因c.872T>G(p.Val291Ala)和c.1084G>A(p.Gly362Arg)復(fù)合雜合突變，其中c.872T>G來自父親，c.1084G>A來自母親

本院確診后在青島和上海兩地隨訪，情況穩(wěn)定，未出現(xiàn)明顯發(fā)育遲緩、肌張力減退現(xiàn)象。早期干預(yù)措施為口服維生素B2和左旋肉堿。維生素B2每日2次，4月齡時劑量由30 mg增加至50 mg；左旋肉堿每日3次，每次500 mg。低脂低蛋白高碳水化合物飲食喂養(yǎng)。治療后，MADD引起的代謝指標(biāo)改善，血清?；鈮A比初始水平低50%以上(表1)。隨訪至5月齡時，患兒肌肉較正常兒童張力減退，5月齡時沒有自發(fā)動作，頭部控制能力差，10月齡不能自主坐立，腦和脊髓MRI、肝臟超聲和超聲心動圖未見異常，肝功能正常?；純何窗l(fā)現(xiàn)先天畸形，新生兒期未發(fā)病，考慮遲發(fā)型MADD。

表1 新生兒疾病篩查和治療后?；鈮A水平情況(μmol·L-1)

2 討論

MADD(OMIM231680)是一種罕見的脂肪酸、氨基酸和膽堿代謝的常染色體隱性遺傳病，由線粒體電子傳遞黃素蛋白(ETFA，OMIM 608053；ETFB，OMIM 130410)α或β亞基中的變體或電子傳遞黃素蛋白脫氫酶(ETF-QO，OMIM 231675)引起[3]。根據(jù)發(fā)病時間可分為3型，Ⅰ型為伴有先天畸形的新生兒型，Ⅱ型為不伴有先天畸形的新生兒型，Ⅲ型為癥狀較輕的遲發(fā)型[4]，常見先天畸形包括巨頭、前額高、鼻梁低平、眼距寬、外耳畸形、內(nèi)臟移位、多囊腎、生殖器畸形等。遲發(fā)型可以在任何年齡出現(xiàn)，大多數(shù)存在于年齡較大的兒童和成人中。臨床癥狀表現(xiàn)為近端進(jìn)行性肌病，肌肉活檢顯示脂質(zhì)沉積性肌病[5, 6]。MADD已被納入許多國家的新生兒疾病篩查計劃，篩查主要依賴于血漿?；鈮A分析和尿液有機(jī)酸含量分析，但在確診時基因診斷更為重要[7, 8]。

目前為止，ETFA、ETFB或ETFDH基因純合和復(fù)合雜合變異涵蓋了幾乎所有MADD發(fā)病類型。ETFA和ETFB中的變異傾向于引起新生兒發(fā)病形式，而ETFDH變異通常以遲發(fā)型存在。本文患兒基因檢測存在ETFDH基因復(fù)合雜合突變，后續(xù)隨訪中未出現(xiàn)發(fā)病癥狀，考慮遲發(fā)型MADD。目前已報道ETFDH中的錯義突變廣泛分布在ETF-QO蛋白的黃素腺嘌呤二核苷酸(FAD)、泛醌結(jié)合區(qū)(UQ)和4Fe-4S結(jié)構(gòu)域中[9-14]，F(xiàn)AD和UQ功能域緊密結(jié)合并且共享結(jié)構(gòu)元件，F(xiàn)AD與黃素結(jié)構(gòu)域中蛋白質(zhì)折疊的相互作用可能影響UQ功能結(jié)構(gòu)域[14]。MADD發(fā)病的嚴(yán)重程度取決于基因變異的位置，遲發(fā)型MADD相關(guān)的大多數(shù)錯義突變與FAD結(jié)構(gòu)域和UQ結(jié)構(gòu)域相關(guān)[15]。

以“MADD”、“Multiple acyl-CoA dehydrogenase deficiency”、“ETFDH”、 “戊二酸血癥Ⅱ型”和“多種?；o酶A脫氫酶缺乏癥”為檢索詞，對PubMed、中國知網(wǎng)、萬方數(shù)據(jù)庫和維普數(shù)據(jù)庫進(jìn)行檢索，檢索時間為2000年1月1日至2018年12月31日。總結(jié)報道所有與MADD相關(guān)的基因突變類型，共28篇文獻(xiàn)[1-28]，其中英文文獻(xiàn)26篇，中文文獻(xiàn)2篇，共127例病例，涉及128種突變，其中錯義突變104種，缺失10種，插入5種(表2)。多數(shù)突變致病性未明，臨床數(shù)據(jù)庫、計算機(jī)預(yù)測和蛋白結(jié)構(gòu)分析的組合能夠提供關(guān)于新突變對MADD患者的蛋白質(zhì)功能和臨床表型的可靠和及時的信息。檢索文獻(xiàn)總結(jié)了亞洲人中ETFDH基因的熱點(diǎn)變異，中國北方患者以c.770A>G(p.G362R)和c.1227A>C(p.L409F)常見，在中國南方患者中c.250G>A(p.A84T)常見[26]。表明ETFDH突變類型有地域性分布[27]，這對該疾病的分子流行病學(xué)有意義。

維生素B2是治療遲發(fā)型MADD有效且理想的方法。Gempel等研究中提到7例MADD患者均出現(xiàn)肌張力減退等脂質(zhì)肌病癥狀，僅低脂飲食治療無效，給予維生素B2(100 mg·d-1)后，癥狀明顯改善，幾個月后，患者癥狀完全恢復(fù)正常[28]，這類患者又被稱為核黃素反應(yīng)型MADD。補(bǔ)充維生素B2可能增加線粒體內(nèi)FAD濃度。維生素B2對ETF-QO蛋白表達(dá)的影響主要是通過FAD結(jié)構(gòu)域，影響FAD結(jié)構(gòu)域折疊的動力學(xué)或熱動力學(xué)，限制了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)有利構(gòu)象的數(shù)量[18]。FAD與折疊中間體的結(jié)合可以抵消由此導(dǎo)致的熵增加從而增加整體未折疊結(jié)構(gòu)。FAD的結(jié)合可以促進(jìn)蛋白質(zhì)正確的折疊、組裝和提高蛋白質(zhì)穩(wěn)定性以及催化活性[19]。

表2 ETFDH基因突變位點(diǎn)及氨基酸蛋白質(zhì)變化

續(xù)表1 c.1074G>Cp.R358S/c.433G>Cp.D145HUQc.1078G>Cp.A360P/c.451A>Gp.T151A/c.1084G>Ap.G362RUQc.503A>Gp.N168SUQc.1099A>Gp.N367DUQc.508G>Tp.G170C/c.1130T>Cp.L377P/c.524G>Ap.A175HFADc.1141G>Cp.G381A/c.524G>Tp.R175LFADc.1205C>Tp.T402IFADc.528G>Cp.L176FFADc.1211T>Cp.M404T/c.560C>Tp.A187V/c.1212T>Cp.M404TFADc.571G>Ap.G191SFADc.1217G>Ap.S406N/c.622G>Cp.A208HLinkerc.1227A>Cp.L409FFADc.643G>Ap.A215TFADc.1285G>Cp.G429A/c.65A>Gp.K22RMTPc.1295T>Ap.V432GFADc.692T>Cp.F231SFADc.1331T>Cp.V444AFADc.715G>Ap.A239TFADc.1351G>Cp.V451L/c.728T>Cp.I243TFADc.1366C>Tp.P456SUQc.736G>A//c.1367C>Tp.P456LUQc.769T>Cp.T257HFADc.1378G>Tp.G460?PTCc.770A>Gp.Y257CFADc.1395T>Gp.Y465?PTCc.79C>Tp.P27S線粒體靶向肽c.1399G>Cp.G467RUQc.806A>Tp.G269L/c.1436G>Cp.R479TUQc.835T>Cp.W279RUQc.1445A>Tp.G482V/c.872T>Gp.V291GUQc.1448C>Tp.P483LUQc.877C>Gp.H293AUQc.1450T>Cp.W484RUQc.890G>Tp.W297L/c.1454C>Gp.T485SUQc.892C>T//c.1519T>Gp.Y507D/c.920C>Gp.S307CUQc.1522C>Ap.P508T/c.949C>Ap.P317TUQc.1528C>Tp.P510SUQc.950C>Gp.P317R/c.152G>Ap.R51QFADc.976G>Cp.G326RUQc.1531G>Ap.D511NUQc.992A>Tp.N331I/c.1544G>Tp.S515L/c.993T>Gp.N331KUQc.158A>Gp.L53Arg/c.998A>Gp.Y333CUQc.1601C>Tp.P534L/c.449_453delTAACAp.L150T/c.1649T>Gp.L550P/c.1270_1273del//c.1657T>Cp.Y553H4Fe4Sc.1241_1246delp.I414_P415delFADc.1675C>Tp.R559X/c.1254-1257delp.L418TfsX10UQ & 4Fe4Sc.172G>Ap.E58KPTCc.1281_1282delp.I428Rfs?6PTCc.1732C>Tp.A578T4Fe4Sc.1372_1375delp.C458Tfs?10PTCc.1744A>Tp.N582YFe4Sc.1773_1774delp.C592?PTCc.1763A>Gp.H588RFe4Sc.213_215delp.V72delFADc.1768A>Gp.K590E/c.973del312p.325del48FAD&4Fe4Sc.1774T>Cp.C592R/c.453delAp.G152AfsTer15/c.1787A>Gp.D596G/c.1471_1473delins8p.S491GfsX3/c.191G>Ap.R64KFADc.1583_1584insAp.N528KfsX3/c.226G>Ap.A76KFADc.361_362 insTp.P121Lfs?5PTCc.227C>Ac.51_52insTp.A18fs/c.236C>Gp.A79GFADc.606+5insT//

注 FAD：黃素腺嘌呤二核苷酸；UQ：泛醌結(jié)合區(qū)；PTC：跨膜蛋白受體；/：文獻(xiàn)中未提到影響的蛋白結(jié)構(gòu)域