彭小敏 張 瀾 蔣思遠 曹 云 程國強 王慧君 吳冰冰,4 楊 琳,5 周文浩,3

1 病例資料

例1：男，29 d，因“生后納差、體重減輕至今”入復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)?；純合礕2P2，胎齡38+6周，剖宮產(chǎn)娩出，出生體重3 150 g，Apgar評分不詳，否認窒息搶救史。出生后母乳喂養(yǎng)，納奶差，每日解稀水樣大便10～12次，未見膿液和血絲，入院前2 d添加配方奶，每次10～20 mL，2～2.5 h進食1次，大便性狀無改善，尿量減少。

家族史：患兒爸爸及爺爺進食奶制品后會出現(xiàn)腹瀉。G1P1為女孩，3歲，體健。

體格檢查：神志清楚，足月兒貌，體重2 320 g，反應(yīng)可，皮下脂肪菲薄，全身皮膚無黃染，無濕疹，無水腫，臀部皮膚有破損，淺表淋巴結(jié)未及腫大。頭顱圓，前囟平軟(1.5 cm×1.5 cm)，雙側(cè)瞳孔等大等圓(3 mm×3 mm)，對光反應(yīng)靈敏。心肺聽診未見異常，腹部平軟，肝脾未及腫大，腸鳴音正常。四肢活動可，肌力及肌張力正常。擁抱反射、吸吮反射和握持反射可引出。

實驗室檢查：入院血氣分析pH 7.232，PO295.1 mmHg，PCO228.2 mmHg，乳酸0.9 mmol·L-1，BE -15.7 mmol·L-1，Na+183.0 mmol·L-1，K+2.9 mmol·L-1， Cl-148.0 mmol·L-1， HCO3-13.3 mmol·L-1。單純皰疹病毒Ⅰ型和Ⅱ型、巨細胞病毒、EB病毒、輪狀病毒、腸道腺病毒和真菌葡聚糖陰性。血常規(guī)、CRP、血培養(yǎng)、尿培養(yǎng)和多次糞培養(yǎng)均未見異常。甲狀腺功能、血氨、血尿串聯(lián)質(zhì)譜和腎上腺激素水平均正常。免疫功能、CD系列和免疫球蛋白水平正常。

入院后予禁食，糾正脫水和電解質(zhì)紊亂，先后予深度水解蛋白無乳糖配方奶(藹兒舒)、氨基酸特殊配方奶(紐康特)和乳蛋白深度水解無乳糖配方奶(紐太特)喂養(yǎng)，大便次數(shù)隨著奶量增長而增加，每天解黃綠色稀水樣便6～10次，有酸臭味，無便血，Na+有上升趨勢，體重?zé)o增長。果糖激發(fā)試驗陽性，葡萄糖激發(fā)試驗陰性，但出現(xiàn)體溫波動，熱峰38.5℃，考慮與葡萄糖吸收障礙有關(guān)。入院第19 d腎臟B超提示雙腎結(jié)構(gòu)欠清，椎體內(nèi)結(jié)晶可能。入院第32 d予果糖+脂肪乳劑喂養(yǎng)，大便稀糊狀，第37 d予含果糖特殊配方奶Galactomin 19喂養(yǎng)，并添加維生素AD和肉堿，腹瀉漸緩解，體重緩慢增長，至第42 d出院時體重3 300 g，每天解3～5次黃色糊狀便。1月后門診隨訪患兒視聽反應(yīng)可，會吃手，抬頭可。

例2：女，7 d，因“腹瀉5 d”入我院?；純合礕3P2，胎齡39+1周，剖宮產(chǎn)娩出，出生體重3 080 g，Apgar評分9～10分，否認窒息搶救史。生后即開奶，母乳喂養(yǎng)不足添加雀巢部分水解配方奶喂養(yǎng)，納奶可，無嘔吐。生后第3 d開始出現(xiàn)腹瀉，每日解15～20次金黃色稀糊樣或水樣便，量不等，無黏胨及膿血，小便量稍少(具體量未計)。當(dāng)?shù)蒯t(yī)院予紐太特喂養(yǎng)，同時予糾酸和補液支持等治療，大便次數(shù)仍多，較稀。

家族史：父母體健，否認近親結(jié)婚。哥哥8歲，生后4～5 d開始出現(xiàn)腹瀉，幼兒時反復(fù)腹瀉，添加輔食后有所好轉(zhuǎn)，現(xiàn)智力正常。

體格檢查：足月兒貌，反應(yīng)可，全身皮膚紅潤，無濕疹，無膿皰疹，無水腫，淺表淋巴結(jié)未及腫大。頭顱圓，前囟平軟(1.5 cm×1.5 cm)，顱縫平軟，雙側(cè)瞳孔等大等圓(3 mm×3 mm)，對光反應(yīng)靈敏。心肺聽診未見異常，腹部平軟，肝脾未及腫大，腸鳴音正常。四肢活動可，肌力及肌張力正常。擁抱反射、吸吮反射和握持反射正常。

實驗室檢查：入我院時血氣分析pH 7.545，PO294 mmHg，PCO219.3 mmHg，乳酸1.8 mmol·L-1，BE -5.8 mmol·L-1，K+4.4 mmol·L-1，Na+141.0 mmol·L-1，Cl-113.0 mmol·L-1。輪狀病毒和腸道腺病毒陰性。糞常規(guī)：乳糖陰性，隱血陰性，少量脂肪球。免疫功能、CD系列和免疫球蛋白水平正常。甲狀腺功能和血氨均正常。

入院后予藹兒舒奶喂養(yǎng)，酪酸梭菌二連活菌調(diào)節(jié)腸道菌群，蒙脫石散保護胃腸道黏膜，喂養(yǎng)耐受，每日解5～8次稀糊狀便。3月后門診隨訪時家屬訴患兒每日解稀水樣便10次，視聽反應(yīng)可，能獨坐。

2 全外顯子組檢測

經(jīng)患兒父母知情同意，行家系全外顯子組測序(WES)。采集患兒及其父母外周靜脈血各2 mL(例2同時采集患兒哥哥血樣)，抽提基因組DNA(德國Qiagen公司miniblood全血試劑盒)。利用Agilent SureSelct Human All Exon V5試劑盒進行外顯子捕獲、建庫，Illumina HiSeq2000平臺對全基因組編碼區(qū)外顯子進行測序，捕獲目標序列50 Mb，總體測序覆蓋度達95%。采用我院轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)中心自主建立的數(shù)據(jù)分析流程[1]，結(jié)合WuXiNextCODE分析軟件進行數(shù)據(jù)分析。通過Burrows-Wheeler Aligner (BWA)將測序數(shù)據(jù)與NCBI RefSeq (GRCh37/hg19)進行匹配比對，利用ANNOVAR、VEP和WuXiNextCODE軟件注釋變異數(shù)據(jù)，包括NCBI RefSeq和SwissPort進行基因注釋，HGMD、OMIM和ClinVar進行疾病相關(guān)注釋，千人基因組計劃、gnomAD、ExAC和內(nèi)部數(shù)據(jù)庫進行突變頻率注釋，SIFT、PolyPhen-2和MutationTaster軟件進行突變預(yù)測等。通過變異頻率和變異類別的篩選以及與疾病的關(guān)系，篩選出可能的致病變異。

結(jié)果顯示，2例患兒均檢測到SLC5A1基因(NM_000343.3)的復(fù)合雜合變異(圖1)。例1攜帶c.325dupG(p.V109GfsTer14)和c.1107_1109delAGT(p.V371del)變異，前者來自父親，為移碼變異，導(dǎo)致氨基酸編碼提前終止，公共數(shù)據(jù)庫和內(nèi)部數(shù)據(jù)庫均未見報道；后者來自母親，是HGMD數(shù)據(jù)庫已收錄的致病變異。例2及其哥哥均攜帶c.781G>A(p.D261N)和c.1298T>C(p.L433P)變異，前者來自父親，ExAc數(shù)據(jù)庫有2條雜合記錄，gnomAD有6條雜合記錄，SIFT和MutationTaster預(yù)測為有害變異，PolyPhen-2預(yù)測為很可能有害；后者來自母親，公共數(shù)據(jù)庫和內(nèi)部數(shù)據(jù)庫未見報道，軟件均預(yù)測為有害變異(表1)。

圖1SLC5A1基因變異患兒家系圖及Sanger測序結(jié)果

注 A：例1家系圖及Sanger驗證結(jié)果；B：例2家系圖及Sanger驗證結(jié)果

注 Het Hom：雜合樣本數(shù)|純合樣本數(shù)

3 文獻復(fù)習(xí)

檢索PubMed數(shù)據(jù)庫、中國知網(wǎng)、萬方和維普數(shù)據(jù)庫，以“(glucose/galactose malabsorption [Title/Abstract])”為英文檢索式，以“葡萄糖/半乳糖吸收不良”為中文檢索式，檢索時間均為建庫至2019年5月30日。檢索到18篇有臨床資料和基因突變分析的文獻(中文1篇，英文17篇)，與本文合并后共74例患者，詳細信息見表2。

74例患者中，男28例，女43例，性別未知3例。46例患者有具體發(fā)病年齡記載，其中45例于生后1周內(nèi)發(fā)病，確診年齡為0～26歲；明確近親婚配者62例(83.8%)。臨床特點：腹瀉74例(100%)，脫水66例(89.2%)，高鈉血癥11例(14.9%)，代謝性酸中毒10例(13.5%)，腎損害(尿糖陽性、腎鈣質(zhì)沉著、腎衰竭)24例(32.4%)。治療：Galactomin 19喂養(yǎng)16例，RCF配方奶喂養(yǎng)5例，52例改為去碳水化合物飲食，僅1例未予特殊處理。預(yù)后：存活65例(87.8%)，1例(1.4%)因持續(xù)腎功能異常、腦積水等繼發(fā)癥狀死亡，未提供信息8例(10.8%)；隨訪能耐受少量碳水化合物飲食34例(46.6%)，腎鈣質(zhì)沉著5例(6.8%)。66例(89.2%)攜帶純合變異(錯義變異62例，終止變異2例，缺失變異2例)，7例(9.6%)攜帶復(fù)合雜合變異，1例(1.4%)存在包含SLC5A1基因的大片段雜合性缺失。

4 討論

腹瀉是新生兒期較為常見的消化道癥狀。病因復(fù)雜，可由多種因素和病原所導(dǎo)致。近年來隨著臨床遺傳學(xué)的進展，逐漸認識到遺傳相關(guān)疾病可以在新生兒期出現(xiàn)反復(fù)腹瀉，如免疫缺陷病及代謝性疾病等，其中較為常見的為IL10RA缺陷[2]。葡萄糖/半乳糖吸收不良癥(GGM, OMIM 606824)是一種罕見的代謝性疾病，由于葡萄糖和半乳糖吸收不良引發(fā)嚴重的水樣腹瀉和高滲性脫水，嚴重者甚至死亡[3]。其致病基因為SLC5A1，定位于染色體22q12.3，迄今已報道了50余種不同的基因突變，不過仍缺乏明確的基因型-表型相關(guān)性研究。

GGM是由于小腸黏膜刷狀緣表面鈉依賴的葡萄糖轉(zhuǎn)運體1結(jié)構(gòu)和功能缺陷造成的，葡萄糖和半乳糖無法在腸道正常吸收，堆積在腸腔內(nèi)產(chǎn)生大量乳酸，導(dǎo)致酸性水樣便，繼而引起高鈉血癥、高滲性脫水、代謝性酸中毒和營養(yǎng)不良，若不及時治療可能死于低血容量休克[4]。患兒還可能出現(xiàn)腹脹、嘔吐、腸鳴音亢進、高氯血癥、高鈣血癥、腎性糖尿和腎鈣質(zhì)沉著癥等其他癥狀。該病最早由Lindquist等[5]于1962年發(fā)現(xiàn)并報道，迄今全球范圍內(nèi)已報道的病例300多例。目前仍缺乏相應(yīng)的流行病學(xué)資料，不同人群的發(fā)病率存在差異，研究表明該病在阿米什和阿拉伯等近親結(jié)婚率高的地區(qū)高發(fā)[6, 7]，表明GGM呈常染色體隱性遺傳模式。本文2例患兒開奶后很快出現(xiàn)稀水樣便，伴高鈉血癥、脫水，例1尤為典型。例1入院時可見營養(yǎng)不良貌，體重僅2 320 g，比出生時減少了26%，血氣分析提示合并有低鉀血癥、高氯血癥、代謝性酸中毒等，予禁食并及時予補液、糾酸等支持治療，電解質(zhì)紊亂明顯改善，先后嘗試以蛋白深度水解無乳糖配方奶及氨基酸特殊配方奶喂養(yǎng)，但是隨著奶量增加大便次數(shù)逐漸增多，血鈉亦有上升趨勢。糞便有酸臭味，多次查pH值偏低，提示腸內(nèi)產(chǎn)酸物質(zhì)增加?；純翰〕讨蟹磸?fù)低熱，但CRP一直在正常范圍內(nèi)，可能為糖吸收障礙的不良反應(yīng)。例2因腹瀉就診，換無乳糖配方奶喂養(yǎng)后大便次數(shù)仍較多，且哥哥幼時有相似的臨床表現(xiàn)，添加輔食后有所好轉(zhuǎn)。

盡管GGM患兒通常生后2～5 d即出現(xiàn)腹瀉癥狀，但該病極為罕見，臨床表現(xiàn)也相當(dāng)復(fù)雜，給早期診斷帶來一定的困難。研究表明目前已診斷的病例平均確診年齡為4.5個月[8]?；純撼霈F(xiàn)長期水樣便、代謝性酸中毒、高鈉血癥和高滲性脫水，且常規(guī)治療無效時考慮GGM可能[9]。GGM的初步診斷基于以下標準：①出生后不久即腹瀉；②糞便特征：包括電解質(zhì)、pH降低、還原性物質(zhì)陽性和脂肪等；③無乳糖和氨基酸奶粉不能有效改善癥狀；④換不含葡萄糖和半乳糖的奶粉喂養(yǎng)時腹瀉明顯改善，換回原奶粉后再次腹瀉；⑤排除感染等疾病。常見的可引起慢性腹瀉的其他疾病有：分泌性腹瀉，如先天性氯化物腹瀉、先天性失鈉性腹瀉等；細菌和病毒感染；脂質(zhì)運輸障礙，如乳糜微粒潴留性疾病、低脂蛋白血癥和脂蛋白缺乏癥；胰腺功能不全，如囊性纖維化、Shwachman-Diamond綜合征、Johanson-Blizzard綜合征和先天性脂肪酶或腸激酶缺乏癥。確診則需依賴以下幾種手段：①氫呼氣試驗，口服葡萄糖或半乳糖(2 g·kg-1)后收集4 h內(nèi)呼氣中的氫氣，終濃度峰值超過基礎(chǔ)氫值20 ppm以上[10]，在嬰幼兒中難以實施；②單糖激發(fā)試驗：口服葡萄糖和半乳糖后血糖反應(yīng)曲線平坦，而口服果糖和木糖后血糖明顯上升[11]，結(jié)果受多種因素影響，可能出現(xiàn)假陽性或假陰性；③十二指腸組織活檢和雙糖酶活性檢測：結(jié)果較可靠，但具有侵入性；④遺傳學(xué)診斷：通過高通量測序或Sanger測序檢測到SLC5A1基因的純合或復(fù)合雜合突變有助于明確診斷，結(jié)果為陰性或僅檢測到單個雜合突變時，還應(yīng)考慮SLC5A1基因缺失/重復(fù)可能，該方法的應(yīng)用日趨廣泛。

GGM是一種罕見的常染色體隱性遺傳疾病，致病基因SLC5A1包含15個外顯子，編碼由664個氨基酸殘基組成的鈉/葡萄糖協(xié)同轉(zhuǎn)運蛋白[3]。該蛋白是含14個跨膜結(jié)構(gòu)域的跨膜蛋白，分布于小腸和近端腎小管，能促進葡萄糖、氨基酸、維生素及其他離子在小腸和腎的轉(zhuǎn)運[12]。SLC5A1蛋白合成減少或活性降低，均會導(dǎo)致細胞膜轉(zhuǎn)運葡萄糖和半乳糖功能異常，大量未消化的糖和電解質(zhì)進入結(jié)腸，引起滲透性腹瀉和嚴重脫水[4]。這種水樣便有時甚至被誤認為是多尿[13]。基因檢測還能有效地鑒別診斷先天性吸收不良性腹瀉(NEUROG3突變)、先天性乳糖酶缺陷(LCT突變)等疾病[14]。截至2019年5月30日，HGMD已收錄了SLC5A1基因的50余種突變，包括37個錯義突變，5個無義突變，3個剪接位點突變和11個插入/缺失突變，但目前仍缺乏明確的基因型-表型相關(guān)性研究。納入本文檢測到的3個可疑致病變異，分析結(jié)果表明這些變異分布于除exon7以外的所有外顯子，此外，與既往報道一致[20]，并未發(fā)現(xiàn)變異類型與性別、發(fā)病年齡和疾病嚴重程度之間存在明顯的關(guān)聯(lián)。文獻報道阿米什家系中33例患者攜帶相同純合突變，但其中3例僅表現(xiàn)為慢性腹瀉，因而一直未明確診斷[6]。來源不同家庭但攜帶相同變異的患者其病情嚴重程度也存在較大差異[15]。此外，錯義變異的雜合攜帶者嬰兒期也可能會有腹瀉和生長發(fā)育不佳[16]。SLC5A1基因突變產(chǎn)生截短蛋白，或使蛋白質(zhì)構(gòu)象發(fā)生改變，蛋白不能表達到細胞膜上，進而導(dǎo)致轉(zhuǎn)運功能缺陷[3, 17, 18]。本文例1檢測到的c.325dupG移碼變異導(dǎo)致氨基酸編碼提前終止，對蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)和功能等均有較大的影響，保守性分析發(fā)現(xiàn)另外3個變異位點在各物種間均具有極強的保守性。c.1107_1109delAGT是已收錄在HGMD數(shù)據(jù)庫的致病突變，該位點位于連接第8和第9個跨膜區(qū)的細胞外襻環(huán)處[19]。本文例2及其哥哥檢測到的c.781G>A(p.D261N)變異在ExAc數(shù)據(jù)庫僅有2條雜合記錄，天冬氨酸為帶負電的氨基酸，而天冬酰胺為極性中性，電荷的改變可能導(dǎo)致氨基酸之間的相互作用發(fā)生變化，改變蛋白質(zhì)的折疊和空間結(jié)構(gòu)，Polyphen-2預(yù)測為可能有害變異，SIFT和MutationTaster預(yù)測為有害變異；c.1298T>C(p.L433P)變異在公共數(shù)據(jù)庫和內(nèi)部數(shù)據(jù)庫均未見報道，軟件預(yù)測均為有害變異，亮氨酸和脯氨酸雖同為非極性疏水性氨基酸，但其等電點不一樣，突變后的氨基酸體積也較小，該位點位于跨膜區(qū)，變異后可能會影響蛋白質(zhì)與質(zhì)膜的接觸，降低蛋白活性。2例患兒雙親均為雜合攜帶者，無相關(guān)臨床表型，患兒為復(fù)合雜合突變，符合家系共分離。

GGM的治療以飲食控制為主，應(yīng)避免攝入葡萄糖和半乳糖(包括含葡萄糖的口服補液溶液)，可以在飲食中添加果糖以補充能量和碳水化合物[20]。另外，應(yīng)在營養(yǎng)師的指導(dǎo)下適當(dāng)補充鈣和維生素D，減少營養(yǎng)不良風(fēng)險。目前國外在售的特殊配方奶主要有含果糖的Galactomin 19(紐迪希亞)和去碳水化合物RCF配方奶(雅培)。本文例1入院時體重較出生體重減少830 g(< P3)，結(jié)合臨床表現(xiàn)和實驗室檢查明確診斷后改用Galactomin 19配方奶喂養(yǎng)，并添加維生素D，腹瀉迅速緩解，體重快速增長到3 300 g。該病預(yù)后良好，只要及早干預(yù)，患兒的生長發(fā)育能逐漸趨于同齡兒。Xin等[6]發(fā)現(xiàn)部分患者成年后能很好地攝入含碳水化合物的常規(guī)飲食，盡管所需時間和改善程度因人而異，但潛在的機制尚不清楚。有學(xué)者提出隨著腸道菌群的建立，腸道對碳水化合物的耐受力有所改善[21]，也有學(xué)者發(fā)現(xiàn)嗜酸乳酸桿菌可能提高腸道對碳水化合物的耐受力[6]。在營養(yǎng)師的指導(dǎo)下，1歲后患兒可逐步添加低碳水化合物、高果糖含量的飲食，同時監(jiān)測其大便頻率、性狀以及其他胃腸道癥狀[20]。若能耐受，可嘗試添加高碳水化合物的水果和蔬菜。然而，也有一些人終身不耐受葡萄糖和半乳糖，甚至不能食用淀粉含量高的蔬菜，主要依賴脂肪、蛋白質(zhì)和果糖提供能量，因此需要密切關(guān)注其腎臟和心血管功能[22, 23]。已有文獻報道GGM患兒可能合并有高鈣血癥、腎鈣質(zhì)沉著癥或腎結(jié)石[24]，而成人中的研究表明高果糖飲食可能會對腎功能產(chǎn)生損害。本文例1住院期間查腎臟B超提示結(jié)晶可能，在今后的隨訪中更應(yīng)提高警惕。

GGM的罕見性和非特異性臨床表現(xiàn)使該病診斷較為困難，而早期診斷和有效管理能預(yù)防患兒死亡。分子遺傳學(xué)檢測已被證明是有效的明確診斷手段。本文通過高通量測序技術(shù)確診兩例GGM患兒，補充和豐富了SLC5A1基因的突變譜，為臨床干預(yù)和治療提供了充分的理論依據(jù)，也為未來提供遺傳咨詢，進行產(chǎn)前篩查、PGD或攜帶者檢測提供了基礎(chǔ)。