張 萍 劉仁超 陸 煒 吳冰冰 王慧君 周文浩

Russel-Silver綜合征(RSS，OMIM#180860)也稱Silver-Russel綜合征(SRS)，是一組臨床和遺傳異質(zhì)性疾病，主要臨床表現(xiàn)為胎兒嚴(yán)重宮內(nèi)及出生后生長發(fā)育遲緩、身材矮小和特殊面容等[1-3]。RSS是表觀遺傳性疾病的典型代表，患兒中30%～60%有父源染色體11p15區(qū)H19差異甲基化區(qū)域(H19-DMR)也稱為印記中心區(qū)1(ICR1)低甲基化，5%～10%有7號染色體母源單親二倍體[UPD7(mat)],30%～40%病因不明[3-6]。RSS臨床診斷主要依靠臨床評分系統(tǒng)和分子基因檢測，分子遺傳學(xué)檢測明確H19-DMR低甲基化或UPD7(mat)可確診RSS。甲基化特異性多重鏈接探針擴(kuò)增技術(shù)(MS-MLPA)可以同時檢測11p15區(qū)域的甲基化水平和該區(qū)域的拷貝數(shù)變異(CNV)，且經(jīng)濟(jì)實(shí)用，在RSS的H19-DMR低甲基化檢測中最常用。本文回顧性分析復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)分子醫(yī)學(xué)中心近年來基于MS-MLPA技術(shù)確診的RSS患兒的臨床特征和基因型特點(diǎn)，并對表型-基因型的相關(guān)性進(jìn)行分析，以期為臨床早期分子診斷RSS提供借鑒。

1 方法

1.1 RSS的臨床診斷標(biāo)準(zhǔn) 符合以下2個臨床評分系統(tǒng)中的任何一個。Lai等標(biāo)準(zhǔn)[7]，滿足以下3/5條：①出生體重≤-2SD，②與同齡兒童相比身高≤-2SD，③顱面部典型特征，④四肢或身體或面部不對稱，⑤指彎曲。Azzi等標(biāo)準(zhǔn)[8]，滿足以下4/6條：①小于胎齡兒(SGA)，出生體重或出生身長≤-2SD，②出生后生長遲緩，與同齡兒童相比身高≤-2SD，③出生時相對大頭(頭圍≥1.5 SD，大于出生體重/身長SD值)，④身體不對稱，⑤喂養(yǎng)困難或BMI≤-2SD，⑥1～3歲時前額突出。

1.2 病例納入標(biāo)準(zhǔn) 2015年1月1日至2019年6月30日在我院分子醫(yī)學(xué)中心經(jīng)MS-MLPA確診的RSS連續(xù)病例。

1.3 MS-MLPA檢測 在取得患兒家長知情同意后，采集患兒外周靜脈血樣本。采用德國QIAGEN公司QIAamp DNA Blood Mini Kit (250)全血試劑盒及其標(biāo)準(zhǔn)DNA抽提方法提取基因組DNA(gDNA)，并測定其濃度(美國Thermofisher公司NanoDrop紫外分光光度儀)。用MS-MLPA試劑盒(SALSA MS-MLPA probemix ME030-C3 BWS/RSS，MRC，Holland)檢測患兒及正常對照人類(美國Agilent公司,貨號5190-3796)的11p15區(qū)域甲基化水平和該區(qū)域的CNV情況，按照試劑盒說明書操作，實(shí)驗(yàn)主要步驟包括DNA變性、雜交、鏈接、PCR擴(kuò)增和毛細(xì)管電泳分析(ABI3130)。該試劑盒涉及11p15區(qū)域2個甲基化差異性表達(dá)的區(qū)域H19-DMR和Kv-DMR(也稱為印記中心區(qū)2，ICR2)，包含檢測H19-DMR和Kv-DMR的探針各4個，待測區(qū)域均含有HhaⅠ酶識別位點(diǎn)。應(yīng)用GeneMarker軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行均一化處理及結(jié)果分析，在判斷基因CNV情況時將0.7～1.3的峰比值作為正常參考范圍；在判斷甲基化水平時將待測區(qū)域酶切后探針信號峰值較酶切前減少50%作為正常參考范圍。

1.4 資料截取 從醫(yī)院病歷系統(tǒng)中截取患兒的年齡、性別，初診原因，胎兒期發(fā)育情況，出生情況，就診時身高、體重，面部特征，有無肢體不對稱或其他發(fā)育異常，生長激素水平，骨齡等。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 經(jīng)MS-MLPA檢測確診的19例RSS患兒進(jìn)入本文分析(表1)，女8例，男11例，中位確診年齡3.3歲(3個月至10歲)。就診原因：身材矮小9例，生長發(fā)育遲緩5例，生長發(fā)育遲緩合并身材矮小3例，肢體不對稱2例。3例(例13、16和17)孕期B超記錄均提示胎兒發(fā)育遲緩。出生時18例評估為SGA；1例足月出生，體重正常。就診時，除例1無身長和體重記錄外，余18例身高和體重均分別低于同齡兒童身高P3和P10。8例行骨骼X線檢查，7例提示骨齡落后，平均落后骨齡為2.3(1.5～3)歲；例2骨齡提前1.5歲。前額突出9例，三角臉7例，手指短或內(nèi)側(cè)彎曲6例，小下頜5例。其他表現(xiàn)包括眼距寬、低耳位、高腭弓、牙齒突出、胸廓畸形、脊柱側(cè)凸和房間隔缺損等。肢體不對稱6例，其中4例為肢體長度和粗細(xì)存在差異，2例僅表現(xiàn)為肢體粗細(xì)不對稱。9例患兒初診時檢測了生長激素(GH)水平，均為GH缺乏。

2.2 MS-MLPA檢測結(jié)果 表1顯示，3例(例2、3和19)為11p15區(qū)域重復(fù)合并H19-DMR低甲基化和Kv-DMR高甲基化，余16例為H19-DMR低甲基化(其中例1 Kv-DMR也呈低甲基化)。圖1為患兒MS-MLPA檢測結(jié)果判斷圖。

2.3 表型-基因型相關(guān)性分析 3例攜帶11p15區(qū)域重復(fù)合并H19-DMR低甲基化和Kv-DMR高甲基化，考慮為母源11p15區(qū)域片段重復(fù)；3例均有SGA、出生后生長發(fā)育遲緩、身材矮小和低體重，前額突出和三角臉各1例。16例檢測到H19-DMR低甲基化，但未檢測到CNV，為父源H19-DMR甲基化丟失所致；出生后生長發(fā)育遲緩、身材矮小和低體重16例，SGA 15例，前額突出8例，三角臉、肢體不對稱、手指短或內(nèi)側(cè)彎曲和小下頜各6例。

3 討論

目前全世界報(bào)道RSS病例約400例[1]，國內(nèi)多為個案報(bào)告，樣本量大于10例的報(bào)道僅見鞏純秀等在2013至2014年基于臨床評分系統(tǒng)診斷的RSS，其中8例確診存在11p15印記缺陷[9,10]。

經(jīng)MS-MLPA確診H19-DMR低甲基化的RSS大宗病例系列報(bào)告，本文19例、日本[11]43例、英國和荷蘭[12]44例，3個中心的RSS患兒出生體重≤-2SD分別為94.7%、100%和81.8%；身材矮小(≤-2SD)的發(fā)生率分別為100%(18/18)、82.5%(29/35)和56.8%，前額突出分別為47.4%、83.8%(31/37)和59.1%；三角臉分別為36.8%、97.7%和

表1 19例RSS患兒的臨床特征和MS-MLPA檢測結(jié)果

注 SGA：小于胎齡兒；-：未做或不適用；1)：出生時；2)：生長激素參考范圍：1.0～48.8 ng·mL-1；3：H19-DMR低甲基化:4：Kv-DMR高甲基化:5：11p15區(qū)域重復(fù):6：Kv-DMR低甲基化59.1%；身體不對稱分別為31.6%、81.1%(30/37)和68.2%；手指短或內(nèi)側(cè)彎曲分別為31.6%、78.4%(29/37)和75%；小下頜分別為26.3%、未統(tǒng)計(jì)和63.6%。均滿足Lai等[12]中的3/5條標(biāo)準(zhǔn)或Azzi等[13]4/6條標(biāo)準(zhǔn)。

2017年第一個關(guān)于RSS診斷和管理的專家共識[3]發(fā)布，指出RSS的診斷需要臨床評分系統(tǒng)和分子基因檢測相結(jié)合，但分子基因檢測結(jié)果可作為確診依據(jù)。MS-MLPA是檢測甲基化水平較經(jīng)典的方法。該技術(shù)可通過HhaⅠ酶識別甲基化位點(diǎn)，通過比較酶切前后探針信號的比值可同時進(jìn)行11p15區(qū)域基因CNV和甲基化水平的檢測，并且具有成本效益，經(jīng)濟(jì)實(shí)用，可廣泛應(yīng)用于臨床。同時，由于11p15區(qū)域H19-DMR低甲基化為RSS的主要病因(30%～60%)。因此，對臨床懷疑RSS的患兒進(jìn)行MS-MLPA檢測是首選。本文通過MS-MLPA確診了19例RSS患兒。但是，MS-MLPA也有局限性(探針數(shù)目和檢測位點(diǎn)相對固定)，該方法不能檢測探針結(jié)合位點(diǎn)之外的其他位點(diǎn)的甲基化水平，缺乏靈活性，對于MS-MLPA檢測陰性的患兒也應(yīng)考慮進(jìn)一步進(jìn)行甲基化芯片、基因組CNV或候選基因變異等相關(guān)檢測，以免漏診。本文所涉及的患兒僅針對11p15區(qū)域甲基化水平和該區(qū)域的CNV情況進(jìn)行了檢測，未明確基因診斷的患兒尚需進(jìn)一步的分子遺傳學(xué)研究。

目前已報(bào)道多種染色體異常與RSS相關(guān)，包括染色體1、2、7、8、11、12、13、14、15、16、17、18、20、21、22和X[13,14]。本文19例RSS患兒均為H19-DMR低甲基化，其中3例攜帶11p15區(qū)域片段重復(fù)和Kv-DMR高甲基化，考慮為母源11p15區(qū)域重復(fù)導(dǎo)致。這是由于11p15印記區(qū)域包括H19-DMR(由H19/IGF2基因構(gòu)成，父源為甲基化狀態(tài))和Kv-DMR(由KCNQ1OT1/CDKN1C基因構(gòu)成，母源為甲基化狀態(tài))。IGF2基因是胰島素樣成長因子2，編碼胚胎生長因子，只有在H19-DMR處于甲基化狀態(tài)時才表達(dá)。CDKN1C基因編碼一種細(xì)胞增殖的負(fù)調(diào)節(jié)因子-細(xì)胞周期依賴性激酶抑制劑1C(CHKN1C蛋白)，是一種抑癌基因，在Kv-DMR處于甲基化狀態(tài)時CDKN1C基因表達(dá)。正常情況下IGF2和CDKN1C基因各有一個拷貝表達(dá)。當(dāng)母源11p15區(qū)域片段重復(fù)時，患者有2拷貝的母源非甲基化和1拷貝的父源甲基化H19-DMR，導(dǎo)致了H19-DMR甲基化相對降低，但此時IGF2基因表達(dá)正常。相反，患者遺傳了2拷貝的母源甲基化和1拷貝的父源非甲基化Kv-DMR，導(dǎo)致了Kv-DMR甲基化相對升高，此時CDKN1C基因表達(dá)增加。CDKN1C基因過表達(dá)可能是患者出現(xiàn)RSS表型的原因[15-17]。攜帶與不攜帶11p15區(qū)域重復(fù)的RSS患兒，雖然為兩種不同發(fā)病機(jī)制(父源H19-DMR甲基化丟失和母源11p15區(qū)域重復(fù))，但在RSS主要臨床表現(xiàn)差別不大。例1為H19-DMR和Kv-DMR均低甲基化，H19-DMR低甲基化導(dǎo)致了RSS表型的出現(xiàn)，而Kv-DMR低甲基化可導(dǎo)致抑癌基因CDKN1C基因表達(dá)下調(diào)，腫瘤發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)相對增高[18]，后續(xù)應(yīng)對患兒進(jìn)行腫瘤相關(guān)監(jiān)測。

圖1 RSS患兒MS-MLPA探針信號酶切前后結(jié)果判讀

注 A列為酶切前探針信號的峰值圖，B列為酶切后探針信號峰值圖。圖A-1和B-1顯示H19-DMR低甲基化且無CNV情況(例4～18)；圖A-2和B-2提示11p15區(qū)域重復(fù)合并H19-DMR低甲基化和Kv-DMR高甲基化(例2、3和19)；圖A-3和B-3提示H19-DMR和Kv-DMR均低甲基化，未檢測到CNV情況(例1)

對臨床懷疑RSS的患兒，早期進(jìn)行基因檢測，可以為實(shí)現(xiàn)疾病早診斷、早治療提供可能，改善患兒預(yù)后。大多數(shù)RSS患兒，尤其是5歲以下的患兒存在喂養(yǎng)困難，營養(yǎng)不良的問題，這些均增加了空腹低血糖和對神經(jīng)認(rèn)知損害的風(fēng)險(xiǎn)。據(jù)統(tǒng)計(jì)RSS患兒低血糖的發(fā)生率約為27%，而自發(fā)的夜間低血糖的發(fā)生更頻繁[3]。因此，對擬診RSS患兒早期進(jìn)行基因檢測，明確診斷，及早開始營養(yǎng)支持治療和預(yù)防低血糖的發(fā)生十分必要。身材矮小是RSS的一個重要特征，有文獻(xiàn)報(bào)道重組人GH替代治療可改善RSS患兒的最終身高。Toumba等[19]和Binder等[20]分別對RSS患兒進(jìn)行了長達(dá)10年和6年的GH跟蹤治療，發(fā)現(xiàn)患兒最終身高有了顯著改善，并且治療開始時身高越矮，終身高的改善越顯著，治療效果與治療時間相關(guān)。故明確診斷RSS，可以指導(dǎo)臨床對成長發(fā)育進(jìn)行監(jiān)測，盡早評估是否需進(jìn)行GH治療，改善患兒成年期身高。另外，運(yùn)動和語言發(fā)育遲緩在RSS患兒中比較常見，發(fā)生率分別為37%和40%[3]。因此，早期診斷可以實(shí)現(xiàn)對RSS患兒及早進(jìn)行發(fā)育評估，進(jìn)行及時適當(dāng)?shù)母深A(yù)與康復(fù)訓(xùn)練。對于肢體明顯畸形的患兒，可盡早評估是:否進(jìn)行手術(shù)矯形。

RSS多為散發(fā)病例，具有多重病因，一般不做產(chǎn)前診斷。但是，對于具有RSS陽性家族史的家庭，對先證者進(jìn)行基因檢測明確診斷可以為患兒家庭進(jìn)行遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷提供依據(jù)。若患兒母親再次生育時應(yīng)在孕期密切監(jiān)測胎兒是否有宮內(nèi)發(fā)育遲緩，肢體不對稱，相對大頭等表現(xiàn)，警惕該病的發(fā)生，必要時應(yīng)進(jìn)行產(chǎn)前診斷，實(shí)現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育。