方曉燕 沈 劍 沈 茜 畢允力 湯小山 劉佳璐 張致慶 翟亦暉 陳 徑 李國民 吳冰冰 錢琰琰 徐 虹 饒 佳

WT1(wilms tumor suppressor gene 1)是一種腫瘤抑制基因，在泌尿生殖系統(tǒng)的發(fā)育和Wilms腫瘤的發(fā)生發(fā)展中具有重要的意義[1,2]。WT1基因突變可以常染色體顯性遺傳，引發(fā)一系列腎小球疾病，包括Denys-Drash綜合征(DDS)、Fraiser綜合征(FS)和孤立型腎病綜合征(INS)[1～4]。越來越多的研究顯示基因分子診斷對WT1突變導(dǎo)致的Wilms腫瘤、腎病分型和預(yù)后有著重要的指導(dǎo)意義。

目前中國尚缺乏對WT1基因突變導(dǎo)致Wilms腫瘤和腎病的中國人群的基因型突變譜的大樣本報道，在一些病例報道中亦缺乏長時間隨訪的資料，尤其是對WT1基因突變的腎病患者長期隨訪中發(fā)生腫瘤的風(fēng)險及Wilms腫瘤術(shù)后發(fā)生慢性腎臟疾病(CKD)的預(yù)測和隨訪缺乏臨床證據(jù)。本研究回顧性收集上海市腎臟發(fā)育與兒童腎臟病研究中心(中心)WT1基因突變患兒的臨床癥狀和體征，分析在Wilms腫瘤合并CKD患兒中WT1基因檢測對診斷和長期預(yù)后的影響。

1 方法

1.1 研究設(shè)計(jì) 以明確WT1基因突變?yōu)闀r間節(jié)點(diǎn)，以進(jìn)展為終末期腎衰竭(ESRD)為終點(diǎn)事件，探討基因檢測時間節(jié)點(diǎn)前與后進(jìn)展為ESRD對臨床診斷分型和延緩進(jìn)入ESRD病程的意義。

1.2 納入標(biāo)準(zhǔn) 中心兒童腎臟病基因檢測數(shù)據(jù)庫中2001年1月1日至2018年12月31日明確WT1基因突變后臨床隨訪>3個月且年齡<18歲的患兒，或Wilms腫瘤合并CKD 2～5期[7]、或SRNS、或有蛋白尿。

1.3 排除標(biāo)準(zhǔn) 已證實(shí)的繼發(fā)性腎病綜合征(NS)，如各類病原體(HBV、HCV、HIV、梅毒)感染所引起的NS，如過敏性紫癜、系統(tǒng)性紅斑狼瘡、血管炎等系統(tǒng)性疾病引起的NS。

1.4 分組 明確WT1基因突變前和后進(jìn)展為ESRD分別為早診斷組和晚診斷組。

1.5 隨訪治療方案 ①確診WT1基因突變之后，臨床上減停就診前已應(yīng)用的激素或免疫抑制劑及其他有損害風(fēng)險藥物，予口服血管緊張素轉(zhuǎn)化酶Ⅱ抑制劑為主的支持治療；②Wilms腫瘤患兒根據(jù)腎功能調(diào)整化療方案[4]；③每年隨訪腹部超聲篩查Wilms腫瘤的發(fā)生。

1.6 臨床資料的采集 符合本文納入和排除標(biāo)準(zhǔn)的病例進(jìn)一步查詢醫(yī)院電子病案系統(tǒng)，采集發(fā)病年齡、首發(fā)癥狀、性別(包括染色體分析及表型性別)、出生史、母親妊娠史、家族史、腎組織病理學(xué)改變、基因型的確定、激素治療效應(yīng)、是否進(jìn)展為ESRD、從發(fā)病至進(jìn)展為ESRD的病程或至隨訪終點(diǎn)(2018年12月12日)的病程、是否腎移植、腎外癥狀等臨床資料。

1.7 基因檢測

1.7.1 知情同意 行基因檢測前獲得患兒家長書面知情同意，對在患兒中發(fā)現(xiàn)的突變位點(diǎn)，得到監(jiān)護(hù)人同意情況下在其家系中驗(yàn)證。

1.7.2 測序及分析 基因檢測先后在北京智因東方轉(zhuǎn)化醫(yī)學(xué)研究中心/北京全譜醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)實(shí)驗(yàn)室和復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院分子診斷中心進(jìn)行。用EDTA抗凝管采集外周血2 mL，采用QIAGEN公司(德國)的血液基因組DNA提取試劑盒抽提外周血基因組DNA，分別采用Sanger測序、Snapshop技術(shù)及WES技術(shù)行基因分型。直接測序應(yīng)用基因組DNA分別擴(kuò)增候選基因外顯子及其側(cè)翼序列，擴(kuò)增引物參照已報道的文獻(xiàn)[3]，使用ABI3730DNA分析儀(美國ABI公司)行雙向直接測序分析。WES采用外顯子捕獲的方法對4 000種人類單基因病的相關(guān)致病基因進(jìn)行高通量測序，利用生物信息學(xué)對測序結(jié)果進(jìn)行分析，用Sanger法對高通量測序結(jié)果進(jìn)行家系驗(yàn)證。依據(jù)WT1測序結(jié)果分析，由第9內(nèi)含子區(qū)域上的剪切供體位點(diǎn)突變誘發(fā)，從而導(dǎo)致第9外顯子編碼的賴氨酸-蘇氨酸-絲氨酸(簡稱KTS)組成的三肽片段插入或缺失，形成+KTS/KTS兩種蛋白亞型，據(jù)此定義KTS突變。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 分類資料應(yīng)用Fisher確切概率法(病例數(shù)不滿足卡方檢驗(yàn)要求)，定量資料應(yīng)用Mann-whitney檢驗(yàn)；應(yīng)用Prism 8軟件作圖。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，確診為WT1基因突變致蛋白尿、或NS、或Wilms腫瘤合并CKD患兒22例患兒進(jìn)入本文分析。表1顯示，早診斷組和晚診斷組各11例，兩組在生物學(xué)性別、起病月齡、臨床分型(DDS/FS/NS)、WT1基因突變型(錯義突變/KTS突變/剪切位點(diǎn)突變)、Wilms腫瘤發(fā)生和臨床應(yīng)用化療的病例數(shù)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。早診斷組和晚診斷組在WT1基因確診前分別有2例(18.2%)和8例(72.7%)使用激素或免疫抑制劑治療，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2.2WT1基因突變分析 表2顯示，在22例患兒中發(fā)現(xiàn)了WT1基因12種不同的單一雜合突變，所有的突變均位于第8～9外顯子/內(nèi)含子。3例患兒中分別檢測到位于第9內(nèi)含子剪切位點(diǎn)的KTS突變[3](NM_024426.4: c.1432+4C>T; c.1432+5G>A)，其中早診斷組1例，晚診斷組2例。

表1 WT1基因突變相關(guān)慢性腎臟疾病患者中早診斷組與晚診斷組的臨床特征

注 DDS:Denys-Drash綜合征,ESRD:終末期腎衰竭,FS:Fraiser綜合征,NS:孤立型腎病綜合征；1)生物學(xué)性別；2)Fisher exact test檢驗(yàn)； 3)中位數(shù)(P25，P75)；4)Mann-whitney檢驗(yàn)

表2 22例WT1基因突變合并慢性腎臟疾病患兒的基因型和表型

注 CKD:慢性腎臟疾病；DDS:Denys-Drash綜合征；DMS:彌漫性系膜硬化性腎小球腎炎；ESRD:終末期腎衰竭；FS:Fraiser綜合征；FSGS:局灶節(jié)段性硬化腎小球腎炎；M：男；F:女；NS:腎病綜合征；PD:腹膜透析；SRNS:激素耐藥性腎病綜合征；VUR:膀胱輸尿管返流12例患兒中分別診斷了已報道的位于第9外顯子上的錯義突變(NP_077744.3: p.R458X，p.R462W和p.D464N)[3]；同時發(fā)現(xiàn)了8個新發(fā)突變(NM_024426.4: c.1339+1G>A, c.1339+5G>A, c.1339+1G>A, c.1432+6T>C, p.C453Y，p.S463F， p.H465Q， p.H473R)。位于第8內(nèi)含子的兩個剪切位點(diǎn)突變(c.1339+1G>A和c.1339+5G>A)及位于第9內(nèi)含子的剪切位點(diǎn)突變(c.1432+6T>C)，經(jīng)計(jì)算機(jī)軟件分析工具Human Splicing finder預(yù)測為顯著可能的剪切位點(diǎn)。

2.3 臨床表型特征分析 10例患兒表型為DDS，3例為FS，9例為INS，至隨訪終點(diǎn)尚未發(fā)現(xiàn)Wilms瘤的復(fù)發(fā)；3種臨床分型在早診斷組和晚診斷組中比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)核型分析判斷9例為男性，其中3例核型判定為46XY，而表型呈現(xiàn)女性外生殖器的假兩性畸形；2例核型判斷為46XX，而表型呈現(xiàn)男性外生殖器的假兩性畸形。假兩性畸形在早診斷組中4例，晚診斷組中1例。9例進(jìn)行了腎穿刺病理檢查，其中5例為彌漫性系膜硬化性腎小球腎炎(DMS)，5例為局灶性節(jié)段性腎小球硬化(FSGS)，1例為彌漫硬化性腎炎(表2)。

2.4 腎功能進(jìn)展惡化及透析移植隨訪情況分析 圖1顯示，22例患兒在隨訪終點(diǎn)進(jìn)入ESRD有15例，其進(jìn)展為ESRD的病程1～65個月。早診斷組至隨訪終點(diǎn)4例進(jìn)入ESRD，4例進(jìn)入CKD 4期，1例進(jìn)入CKD 3期，2例進(jìn)入CKD 2期；2例成功完成了腎移植。晚診斷組中11例進(jìn)展至ESRD,均進(jìn)行腹膜透析治療，其中2例成功完成了腎移植。應(yīng)用生存曲線分析比較發(fā)現(xiàn)(圖2)，早診斷組進(jìn)展至ESRD病程的中位數(shù)為60.0個月，晚診斷組進(jìn)展至ESRD病程的中位數(shù)為9.0個月，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011)。

在晚診斷組中，2例首發(fā)單純Wilms瘤患兒在單側(cè)腎切除術(shù)及化療后，隨訪發(fā)現(xiàn)蛋白尿，腎功能已進(jìn)展為ESRD；1例生后即存在尿道下裂發(fā)育缺陷，1歲齡發(fā)現(xiàn)NS，在1個月內(nèi)進(jìn)展為ESRD，后完善基因檢測明確WT1致病突變，確診DDS。在早診斷組中，3例NS后蛋白尿起病，病初就診后發(fā)現(xiàn)Wilms瘤，行單側(cè)腎臟切除術(shù)及化療，隨訪中均進(jìn)入ESRD。早診斷組1例患兒在1歲齡以蛋白尿起病無合并其他腎外癥狀，腎穿刺病理發(fā)現(xiàn)腫瘤細(xì)胞浸潤，診斷Wilms瘤，后隨訪中因肺部感染，心功能衰竭死亡。4例進(jìn)行了腎移植，1例在移植前預(yù)防性行雙腎切除術(shù)，4例移植手術(shù)同期進(jìn)行了殘余腎的切除，并完善病理未發(fā)現(xiàn)腫瘤復(fù)發(fā)。4例均未發(fā)生排斥反應(yīng)或移植腎失功，其中1例親體腎移植在隨訪8年發(fā)現(xiàn)了肝臟的淋巴瘤病灶，化療緩解中，其余3例移植后至本次研究隨訪終點(diǎn)未發(fā)生腫瘤復(fù)發(fā)或新生腫瘤。

圖1WT1基因突變相關(guān)慢性腎臟疾病患者中早診斷組與晚診斷組的臨床進(jìn)程

注 ESRD：終末期腎衰竭；PD：腹膜透析；Tx：腎移植。早診斷組(虛線以上部分)至隨訪終點(diǎn)，進(jìn)展為CKD 2期、3期和4期分別為2、1和4例，4例進(jìn)展為ESRD(CKD 5期)，后行腹膜透析(PD)治療，有2例成功完成了腎移植(Tx)。晚診斷組(虛線以下部分)均行PD治療，2例成功完成了Tx

圖2WT1基因突變早診斷組和晚診斷組進(jìn)展至ESRD病程間隔的Kaplan-Meier生存曲線分析

注 早診斷組與晚診斷組患兒比較進(jìn)展為ESRD的病程間隔(月)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P=0.011);晚診斷組進(jìn)入ESRD病程更短，Hazard Ratio(Logrank) 0.42(95%CI, 0.17～1.0)

3 討論

WT1基因首先在腎母細(xì)胞瘤(又稱Wilms瘤)中作為抑癌基因被克隆鑒定，作為首個被發(fā)現(xiàn)證實(shí)的兒童NS的致病基因，開啟了人們對腎病的遺傳分子學(xué)研究。WT1基因位于染色體11p13，編碼蛋白包括鋅指蛋白DNA結(jié)合區(qū)參與轉(zhuǎn)錄后調(diào)控及RNA識別。單純Wilms腫瘤患者致病突變集中在WT1基因的N端第1-5外顯子區(qū)域，NS合并性腺發(fā)育障礙或Wilms瘤患者的致病突變報道集中在C端第6-9外顯子區(qū)域[8]。WT1基因作為最常見的先天性NS的致病基因之一，約7%兒童NS篩檢出WT1致病突變，在不同地區(qū)報道的明確致病基因的兒童NS中比例17%～50%[3,4,6]。在兒童NS中行WT1基因的檢測有助于明確臨床分型及判斷預(yù)后。本研究依據(jù)WT1基因突變診斷明確時間節(jié)點(diǎn)與進(jìn)展為ESRD終點(diǎn)事件的先后，從臨床發(fā)病年齡、腎臟病理、進(jìn)展至ESRD病程間隔時間、核型及基因型分析、腎外癥狀及長期隨訪情況等，全面比較了早診斷組與晚診斷組的臨床特征及預(yù)后，提示在ESRD之前明確WT1基因突變型對長期延緩腎功能惡化的臨床意義。

本研究中早診斷組患兒，在起病初期發(fā)現(xiàn)蛋白尿合并Wilms腫瘤或假兩性畸形等其他腎外癥狀，臨床上懷疑WT1基因相關(guān)綜合征，及早完善了基因檢測。晚診斷組患兒，病初僅發(fā)現(xiàn)Wilms瘤，或僅蛋白尿起病，未發(fā)現(xiàn)其他腎外癥狀，在進(jìn)展至ESRD后完善了基因檢測，晚診斷組比早診斷組患兒有更快進(jìn)展為ESRD趨勢。盡管臨床分型包括DDS、FS及INS在早診斷組和晚診斷組分布比例差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但本研究中尚缺乏對早診斷和晚診斷的影響因素進(jìn)行進(jìn)一步分析。許多患兒由于缺乏腎病起病之前的尿檢篩查，不能排除生后即有蛋白尿而未能及早診斷，以至腎功能迅速惡化。在晚診斷組中蛋白尿或NS起病患兒，往往在未明確基因診斷之前先后應(yīng)用了較長療程的激素及免疫抑制劑，藥物對腎小管間質(zhì)的損害有可能參與了腎功能的加速惡化。來自歐洲的腎臟病登記數(shù)據(jù)庫顯示，診斷WT1第8或第9外顯子及內(nèi)含子區(qū)域的致病突變的42例患者，40.5%合并Wilms瘤，83.3%進(jìn)展至ESRD[9]。因此，臨床發(fā)現(xiàn)Wilms瘤患者須及早明確WT1基因的分子診斷，對判斷預(yù)后及合理制定治療方案，保護(hù)殘存腎功能具有重要意義。

在晚診斷組中，2例首發(fā)癥狀為Wilms腫瘤而無蛋白尿起病，經(jīng)單純腎切除術(shù)及化療后，分別在發(fā)現(xiàn)腫瘤后隨訪2.5年及隨訪4.1年發(fā)現(xiàn)蛋白尿，進(jìn)展為ESRD。提示臨床醫(yī)生在Wilms瘤患者隨訪中重視尿液檢查；同時早期明確基因診斷，如明確WT1基因第8或9外顯子及內(nèi)含子突變，則須考慮診斷WT1相關(guān)綜合征DDS或FS，術(shù)后及化療后必須重視腎功能的保護(hù)和隨訪。1例生后發(fā)現(xiàn)尿道下裂，首次就診發(fā)現(xiàn)NS，腎功能急進(jìn)惡化，病程1個月進(jìn)入ESRD，轉(zhuǎn)入中心行腹膜透析治療后明確了WT1基因診斷。提示尿道下裂出生缺陷在診斷多系統(tǒng)疾病的鑒別中需要引起重視。

WT1基因突變?yōu)殡s合胚系突變，盡管大部分DDS或FS男性患兒存在嚴(yán)重的生殖器官發(fā)育異常伴條索狀性腺和不育，但多數(shù)DDS或FS女性患兒具有正常的生殖器官，對患兒長期性腺功能的評估隨訪及心理評估尚需進(jìn)一步加強(qiáng)[10]。本研究中5例假兩性畸形患兒均合并尿道下裂，其中3例合并隱睪，2例合并卵巢發(fā)育缺陷。因此，對外生殖器發(fā)育缺陷的患兒應(yīng)及早進(jìn)行基因檢測，同時重視尿液檢查的隨訪。對攜帶WT1基因突變患者的核型分析及性腺功能科學(xué)評估對患兒的長期生活質(zhì)量的提高意義重大。

綜上所述，針對兒童Wilms腫瘤、NS或蛋白尿、先天性外生殖器發(fā)育缺陷患兒中，在腎功能進(jìn)展惡化之前及早明確WT1基因突變分析，不僅有助于臨床診斷分型，還能顯著延緩進(jìn)入ESRD病程。