饒露蓓 劉來成 劉 曼 尹一兵 陳大鵬

實(shí)驗(yàn)室制定合適的參考區(qū)間(RI)才能為疾病診療提供可靠依據(jù)。實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)結(jié)果應(yīng)參照適合的RI進(jìn)行解釋。然而，目前許多兒科檢測(cè)項(xiàng)目沒有已知的適合年齡和性別的RI[1]。此外，大多數(shù)RI使用已過時(shí)的檢測(cè)方法獲得，可能不再適用于現(xiàn)有檢測(cè)系統(tǒng)[1]。實(shí)驗(yàn)室應(yīng)定期審查和調(diào)整RI，否則會(huì)影響檢測(cè)結(jié)果的準(zhǔn)確判讀。因此，有必要通過實(shí)驗(yàn)室現(xiàn)有檢測(cè)系統(tǒng)為當(dāng)?shù)亟】祪和⑦m合年齡和性別的RI。目前，我國干化學(xué)法檢測(cè)健康兒童肝功能指標(biāo)的參考區(qū)間尚無國家標(biāo)準(zhǔn)，本實(shí)驗(yàn)室既往采用試劑廠家提供的成人參考區(qū)間和《全國臨床檢驗(yàn)操作規(guī)程》(第4版)。基于以上情況，本課題組參照美國臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)(CLSI)C28-A3文件[2]，采用干化學(xué)法建立重慶地區(qū)3月齡至18歲健康兒童8項(xiàng)肝功能指標(biāo)的RI,為臨床提供參考。

1 方法

1.1 倫理和知情同意說明 “建立兒童臨床常規(guī)檢驗(yàn)指標(biāo)參考區(qū)間”方案經(jīng)重慶醫(yī)科大學(xué)附屬兒童醫(yī)院(我院)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)(批準(zhǔn)文號(hào)：CHCMV-IRB-104)。肝功能檢測(cè)項(xiàng)目為健康體檢的常規(guī)項(xiàng)目，檢測(cè)值用于本文分析未行知情同意告知。

1.2 參考個(gè)體來源及篩選

1.2.1 納入標(biāo)準(zhǔn) 同時(shí)滿足以下條件：①2014年12月1日至2018年12月31日于我院健康體檢的3月齡至18歲兒童，②經(jīng)體格檢查未見異常，③血常規(guī)和尿常規(guī)均未見異常，④有肝功能檢測(cè)值。

1.2.2 排除標(biāo)準(zhǔn) 由兒童家長(zhǎng)在體檢前完成健康問卷調(diào)查，內(nèi)容包括：年齡、性別、身高、體重、體溫、疾病史、用藥史、手術(shù)史、有無不良飲食習(xí)慣。根據(jù)調(diào)查問卷結(jié)果，排除具有以下任意一項(xiàng)的兒童：①罹患肝膽疾病、心血管疾病、血液病、神經(jīng)肌肉病、骨骼肌損傷、腎病、自身免疫性疾病、過敏性疾病、糖尿病、佝僂病、甲狀腺功能亢進(jìn)或低下、甲狀旁腺功能亢進(jìn)癥、肺栓塞、哮喘、反復(fù)呼吸道感染和腫瘤；②標(biāo)本采集和檢測(cè)前14 d內(nèi)有用藥史；③6個(gè)月內(nèi)有手術(shù)史；④營養(yǎng)不良和消化吸收不良(腹脹、腹痛、腹瀉、大便常規(guī)查見淀粉顆粒、脂肪滴)，消瘦，超重或肥胖(參照WHO標(biāo)準(zhǔn)[3, 4])，有不良飲食習(xí)慣(挑食、偏食、三餐不定)，嗜煙，酗酒。

1.3 分組 根據(jù)生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律[5]和CLSI C28-A3文件[2]，按年齡分為3月齡至1歲、～3歲、～6歲、～12歲和～18歲組。

1.4 樣本量 按照CLSI C28-A3文件[2]關(guān)于用非參數(shù)方法建立RI的要求，至少需要120例健康兒童，若進(jìn)行分組則每組至少120例。

1.5 標(biāo)本采集和檢測(cè) 于清晨空腹安靜狀態(tài)下，采集3 mL靜脈血于促凝膠管中，60 min內(nèi)送至我院檢驗(yàn)科。以 4 000 r·min-1離心8 min，剔除溶血、黃疸或脂血等不合格標(biāo)本后，4 h內(nèi)采用美國強(qiáng)生公司VITROS 5600干化學(xué)分析儀完成8項(xiàng)肝功能指標(biāo)檢測(cè)。使用儀器配套校準(zhǔn)品、質(zhì)控品和試劑。血清總膽紅素(TB)、總蛋白(TP)和清蛋白(ALB)采用比色法；丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、堿性磷酸酶(ALP)、γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(GGT)和乳酸脫氫酶(LDH)采用速率法。

1.6 數(shù)據(jù)分析 采用SPSS 23.0軟件，根據(jù)CLSI C28-A3文件[2]于2019年1月1日至2月1日進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.6.1 離群值的判斷 首先通過散點(diǎn)圖和箱式圖識(shí)別疑似離群值，然后根據(jù)Dixon法判斷，若疑似離群值(極值)和相鄰值的絕對(duì)差值≥全距的1/3，則該值被判定為離群值，需剔除該離群值所在標(biāo)本的8項(xiàng)肝功能檢測(cè)結(jié)果。

1.7 RI的驗(yàn)證 按照本研究納入和排除標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)年齡和性別的分組情況，于2019年2月1日至2019年4月30日每組重新納入20名參考個(gè)體(若某年齡段的RI按性別進(jìn)行了劃分，則該年齡段需重新納入男、女各20名)，采集靜脈血，血標(biāo)本的采集、運(yùn)送和檢測(cè)與上述建立RI的過程一致。將驗(yàn)證人群所得測(cè)定值與相應(yīng)年齡組建立的RI進(jìn)行比對(duì)，若落在RI內(nèi)的測(cè)定值個(gè)數(shù)的百分率≥90%，則該RI可以直接使用；若落在RI內(nèi)的測(cè)定值個(gè)數(shù)的百分率<90%，則按照以上標(biāo)準(zhǔn)重新納入20名，重復(fù)上述操作,若落在RI內(nèi)的測(cè)定值個(gè)數(shù)百分率≥90%則RI可以使用；若落在RI內(nèi)的測(cè)定值個(gè)數(shù)百分率仍<90%，則需重新檢查測(cè)定程序，考慮是否存在人群差異、是否需要重新建立RI。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 符合本文納入和排除標(biāo)準(zhǔn)3 758份血樣本，剔除35份溶血、黃疸或脂血不合格標(biāo)本?！?歲組ALP、～12歲組ALT和～18歲組AST的檢測(cè)結(jié)果各有1個(gè)離群值，剔除這3個(gè)離群值所在標(biāo)本的所有檢測(cè)結(jié)果，3 720份標(biāo)本檢測(cè)結(jié)果進(jìn)入統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。3月齡至1歲組241份(男120份)，～3歲組251份(男131份)，～6歲組938份(男524份)，～12歲組1 671份(男988份)，～18歲組619份(男379份)。

2.2 8項(xiàng)肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果 表1顯示，除3月齡至1歲組總ALT、女童ALB、ALT、LDH和男童ALT、AST，～3歲組總ALT和LDH、女童ALB、ALT、AST、LDH和男童ALT,～6歲組女童LDH，～12歲組女童ALB和～18歲組ALB呈正態(tài)分布外，其余各組檢測(cè)結(jié)果均呈偏態(tài)分布。～3歲組TP和ALT，～6歲組TP和AST,～12歲組TB、ALT、AST、GGT和LDH，～18歲組TB、ALB、ALT、AST、ALP、GGT和LDH男女檢測(cè)結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。～18歲組除TP外，其他7項(xiàng)肝功能指標(biāo)中位數(shù)均為男高于女，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。不同年齡段兩兩比較，除3月齡至1歲與～3歲組LDH、3月齡至1歲與～6歲組ALB和ALP、3月齡至1歲與～12歲組GGT、3月齡至1歲與～18歲組GGT、～3歲與～6歲組ALP、～6歲與～12歲組TB、～6歲與～18歲組ALT、～12歲與～18歲組ALP差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外(P均>0.05),其余各組兩兩比較差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)。

表1 3月齡至18歲健康兒童肝功能指標(biāo)各年齡組男女檢測(cè)結(jié)果或M(P25,P75)]

注 1)，2)和3)是指同一檢測(cè)指標(biāo)不同年齡段差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，Kruskal-WallisH檢驗(yàn)，P>0.05；TB：總膽紅素(μmol·L-1)；TP：總蛋白(g·L-1)；ALB：清蛋白(g·L-1)；ALT：丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(U·L-1)；AST：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(U·L-1)；ALP：堿性磷酸酶(U·L-1)；GGT：γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(U·L-1)；LDH：乳酸脫氫酶(U·L-1)

2.4 8項(xiàng)肝功能指標(biāo)的年齡變化趨勢(shì) 各項(xiàng)指標(biāo)與年齡Spearman相關(guān)性分析顯示，ALT、AST和LDH檢測(cè)結(jié)果均與年齡呈負(fù)相關(guān)(ALT:r=-0.108，P=0.000; AST:r=-0.644，P=0.000; LDH:r=-0.524，P=0.000)。TB、TP、ALB、ALP和GGT檢測(cè)結(jié)果均與年齡呈正相關(guān)(TB:r=0.217，P=0.000;TP:r=0.524，P=0.000;ALB:r=0.282，P=0.000;ALP:r=0.170，P=0.000；GGT:r=0.181，P=0.000)。

2.5 各年齡組8項(xiàng)肝功能指標(biāo)的RI 表2顯示，除～18歲組ALT、AST、ALP、GGT和LDH檢測(cè)Z>Z*，男女?dāng)?shù)據(jù)不可合并外，其他各年齡段男女?dāng)?shù)據(jù)均可合并。男女?dāng)?shù)據(jù)合并后，比較相鄰年齡段數(shù)據(jù)是否可以合并，發(fā)現(xiàn)5個(gè)年齡組ALB，～3歲、～6歲、～12歲和～18歲組TB，3月齡至1歲、～3歲、～6歲和～12歲組ALP，～3歲、～6歲和～12歲組ALT和GGT，3月齡至1歲和～3歲組ALB和LDH檢測(cè)值為Z

2.6 RI的驗(yàn)證結(jié)果 8項(xiàng)肝功能指標(biāo)檢測(cè)結(jié)果落在RI內(nèi)百分率結(jié)果顯示，TB：3月齡至1歲組90%，～18歲組100%；TP：3月齡至3歲組95%，～6歲組100%，～12歲組95%，～18歲組95%；ALB：3月齡至18歲組95%；ALT：3月齡至1歲組100%，～12歲組100%，～18歲組男女均為100%；AST：3月齡至1歲組90%，～3歲組95%，～6歲組95%，～12歲組95%，～18歲組男女均為100%；ALP：3月齡至12歲組100%，～18歲組男100%、女95%；GGT：3月齡至1歲組95%，～12歲組95%，～18歲組男95%、女100%；LDH：3月齡至3歲組90%，～6歲組90%，～12歲組95%，～18歲組男女均為95%。

表2 不同年齡段8項(xiàng)肝功指標(biāo)參考區(qū)間(P2.5, P97.5)

注 TB：總膽紅素(μmol·L-1)；TP：總蛋白(g·L-1)；ALB：清蛋白(g·L-1)；ALT：丙氨酸轉(zhuǎn)移酶(U·L-1)；AST：天冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(U·L-1)；ALP：堿性磷酸酶(U·L-1)；GGT：γ谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶(U·L-1)；LDH：乳酸脫氫酶(U·L-1)

3 討論

制定適合健康兒童生理發(fā)育的RI，面臨多重挑戰(zhàn)。首先，通過招募完全健康兒童來確定RI是十分困難的，尤其是新生兒和嬰兒難以獲得足夠的血液樣本。其次，兒童生理不斷發(fā)展變化，必須為每個(gè)檢測(cè)項(xiàng)目獲得多個(gè)年齡段特定的RI，但目前尚不清楚如何對(duì)年齡進(jìn)行合理劃分。鑒于這些挑戰(zhàn)，嘗試?yán)冕t(yī)院體檢健康兒童的剩余樣本和LIS數(shù)據(jù)以確定RI的方法被多項(xiàng)研究證實(shí)可靠[7, 8]。本研究選擇重慶地區(qū)至我院體檢的健康兒童作為參考群體，根據(jù)生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律初步劃分年齡段，在抽樣時(shí)，根據(jù)CLSI C28-A3文件[2]推薦的樣本量，嘗試確保每個(gè)年齡組男女至少有120個(gè)樣本。隨后，評(píng)估不同性別和年齡組間是否可以合并，以獲得更準(zhǔn)確的RI。

本研究對(duì)血清膽紅素的檢測(cè)結(jié)果顯示，～12歲和～18歲組TB的男女檢測(cè)結(jié)果差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P均<0.05)，推測(cè)隨著年齡的增長(zhǎng)，TB在男女間的生理差異可能逐漸增加。但與國內(nèi)研究[9-11]報(bào)道的同年齡段男女差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的結(jié)果有所不同?？赡苁歉餮芯繀⒖紓€(gè)體的具體納入和排除標(biāo)準(zhǔn)不同所致：①納入的具體年齡不同；②排除的疾病種類不完全相同。TB隨年齡增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，不同的研究存在差異，曹科等[10]報(bào)道隨年齡增長(zhǎng)不斷上升，Liu等[11]報(bào)道不同年齡段有一定的波動(dòng)，TB在生命早期較高，1歲左右降至最低濃度，之后隨著年齡增長(zhǎng)逐漸增加。本研究結(jié)果顯示，TB總體呈上升趨勢(shì)(呈弱正相關(guān)，r=0.217，P=0.000)。這可能與各研究的樣本量和年齡分布存在差異有關(guān)。本研究建立的3月齡至18歲健康兒童TB的RI與中國其他地區(qū)的研究比較，與成都[12]基本一致，但低于深圳[10]和鄭州[11]的檢測(cè)結(jié)果，可能是飲食、地區(qū)和環(huán)境等差異所致。

血清蛋白檢測(cè)結(jié)果顯示，隨著年齡增長(zhǎng)，TP和ALB水平逐漸增加，不同年齡段檢測(cè)結(jié)果差異明顯，但同年齡段男女差異不明顯，與國內(nèi)其他地區(qū)[9-11, 13]研究結(jié)果基本一致。

5項(xiàng)血清酶檢測(cè)結(jié)果顯示，除3月齡至1歲組5項(xiàng)血清酶指標(biāo),～3歲組AST、ALP、GGT、LDH,～6歲組ALT、ALP、GGT、LDH和～12歲組ALP的檢測(cè)結(jié)果男女差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義外，其他年齡段男女差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,且均為男高于女，隨著年齡增加差異增大，與國內(nèi)外研究[14-16]結(jié)果一致。但同地區(qū)有研究報(bào)道學(xué)齡前期AST、學(xué)齡期AST和LDH男女檢測(cè)結(jié)果差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[9]，可能是該研究統(tǒng)計(jì)資料呈正態(tài)分布，而本研究呈偏態(tài)分布的統(tǒng)計(jì)學(xué)差異所致。本研究相關(guān)性分析結(jié)果顯示，ALT、AST和LDH檢測(cè)結(jié)果均與年齡呈負(fù)相關(guān)，與中國深圳[14, 17]、北京[18]和國外[16]報(bào)道一致。但ALP和GGT隨年齡增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，不同研究結(jié)果不同，本研究顯示ALP和GGT均與年齡呈正相關(guān)(ALP:r=0.170，P=0.000；GGT:r=0.181，P=0.000)，與Wanjian等[19]和Bussler等[16]報(bào)道一致。但Liu等[11]報(bào)道GGT隨著年齡增長(zhǎng)逐漸下降，羅小娟等[14]報(bào)道ALP與年齡呈負(fù)相關(guān)(ALP：r=-0.082，P=0.000)，Higgins等[20]發(fā)現(xiàn)ALP僅與青春期呈負(fù)相關(guān)。推測(cè)GGT和ALP隨年齡變化波動(dòng)較大，而不同研究的年齡段劃分存在差異，調(diào)查其適合年齡的RI需要進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，進(jìn)行更細(xì)致的分組。鄭州地區(qū)調(diào)查了63 086例0～16歲健康兒童，發(fā)現(xiàn)GGT和ALP的RI需要進(jìn)行8～9個(gè)年齡段的劃分[11]。

本研究結(jié)果顯示，除ALB外的其他肝功能指標(biāo)均需要按年齡劃分?！?8歲組5項(xiàng)血清酶指標(biāo)也需要按性別作進(jìn)一步劃分，與國內(nèi)報(bào)道[11, 14]一致，青春期的男女差異可能是脂肪-肌肉分布、性激素和代謝過程之間的相互作用(如胰島素抵抗)不同所致[21, 22]。本研究結(jié)果顯示，年齡差異較性別差異顯著，提示后續(xù)進(jìn)行大樣本的RI調(diào)查，需主要根據(jù)年齡進(jìn)行劃分。雖然RI需要根據(jù)統(tǒng)計(jì)分析結(jié)果進(jìn)行細(xì)分，但尚不清楚這些統(tǒng)計(jì)差異是否具有臨床意義。

本研究所使用的干化學(xué)法是采用美國強(qiáng)生VITROS 5600干化學(xué)分析儀,通過測(cè)定干片顏色變化確定化合物濃度,具有簡(jiǎn)便、快速、準(zhǔn)確、干擾因素少及試劑保存時(shí)間長(zhǎng)等特點(diǎn),適用于兒科生化指標(biāo)的檢測(cè)和RI的調(diào)查[23]。與使用相同檢測(cè)系統(tǒng)的研究結(jié)果比較，RI范圍窄于成都地區(qū)[12]，推測(cè)可能是后者的研究樣本量較少所致[5]。本研究結(jié)果與同地區(qū)通過濕化學(xué)法建立的學(xué)齡前期和學(xué)齡期健康兒童肝功能指標(biāo)的RI存在差異[9]，可能是檢測(cè)儀器、試劑、方法和原理的不同所致。因此，有必要針對(duì)不同檢測(cè)系統(tǒng)建立各自的RI。國外有研究計(jì)劃通過同一標(biāo)本多系統(tǒng)檢測(cè)比較不同檢測(cè)系統(tǒng)的結(jié)果差異[24]，但其尚未得出研究結(jié)論。本研究所使用的試劑盒提供的成人RI：TB 3～22 μmol·L-1，TP 63～82 g·L-1，ALB 35～50 g·L-1，ALT：男21～72 U·L-1、女9～52 U·L-1，AST：男17～59 U·L-1、女14～36 U·L-1，ALP 38～126 U·L-1，GGT：男15～73 U·L-1、女12～43 U·L-1，LDH 313～618 g·L-1。與本研究干化學(xué)法建立的3月齡至18歲健康兒童肝功能指標(biāo)的RI比較，血清TB、ALT、ALP、GGT和LDH檢測(cè)結(jié)果與成人差異較明顯，兒童ALP水平明顯高于成人[9, 15, 19, 25]，可能是兒童骨骼生長(zhǎng)迅速，骨髓中成骨細(xì)胞分泌旺盛，產(chǎn)生大量ALP造成[25]。

本研究的不足與局限性：①8項(xiàng)肝功能指標(biāo)的年齡分組是根據(jù)生長(zhǎng)發(fā)育規(guī)律統(tǒng)一劃分的，應(yīng)按照各指標(biāo)隨年齡變化的趨勢(shì)作相應(yīng)的劃分，本研究樣本量不夠大，尚需納入更多的參考個(gè)體，將各指標(biāo)的年齡分組細(xì)化并深入研究隨年齡增長(zhǎng)的變化趨勢(shì)，以建立各年齡段準(zhǔn)確的RI；②未納入0～3月齡健康兒童，使得兒科RI的完整性受限。應(yīng)根據(jù)臨床需要，納入該年齡段人群并合理分組；③統(tǒng)計(jì)資料呈偏態(tài)和正態(tài)混合分布，需考慮納入更多樣本量，也可能需要重新評(píng)估參考人群的納入和排除標(biāo)準(zhǔn)[5]。

綜上，本研究基于干化學(xué)法建立了3月齡至18歲健康兒童不同年齡和性別的8項(xiàng)肝功能指標(biāo)RI，根據(jù)CLSI C28-A3文件[2]的建議，經(jīng)過進(jìn)一步驗(yàn)證和轉(zhuǎn)移后，可為其他實(shí)驗(yàn)室建立準(zhǔn)確適用的生物RI提供依據(jù)和借鑒。