趙得雄 吳夢圓 吳冰冰 孫衛(wèi)華 彭小敏 吳弘疆 海妤婷 王生蘭 周文浩,3 王慧君 陸 煒

高靈敏性、高特異性、高性價比的串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)目前已廣泛應(yīng)用于新生兒遺傳代謝病(IMD)篩查及臨床高?；純旱臋z測[1]，因其檢測范圍存在一定的局限性，近幾年迅速發(fā)展起來的二代測序技術(shù)正越來越廣泛地被應(yīng)用于IMD的臨床診斷中[2]。本課題組前期以高通量測序(NGS)作為金標(biāo)準(zhǔn)，以質(zhì)譜檢測作為待測標(biāo)準(zhǔn)，對2 000例疑似IMD的高危新生兒人群行IMD篩查，質(zhì)譜檢測+NGS較單純質(zhì)譜檢測可以更加快速且全面確診臨床表現(xiàn)疑似IMD的高危新生兒，盡早實施個體化治療，改善患兒預(yù)后。但基于普通新生兒人群，較大規(guī)模的質(zhì)譜檢測+NGS篩查IMD是否有更好的價值值得探討。有研究通過對青海省西寧地區(qū)388例高?；純盒醒蛸|(zhì)譜檢測，發(fā)現(xiàn)該地區(qū)IMD的陽性病明顯高于國內(nèi)其他地區(qū)[3]，本研究以青海省紅十字醫(yī)院為牽頭單位，以“基于高通量測序技術(shù)的新生兒出生缺陷篩查技術(shù)研究與示范”項目為研究背景，對青海地區(qū)普通新生兒人群行質(zhì)譜檢測并對高危新生兒人群行NGS篩查，為IMD等新生兒出生缺陷類疾病早篩查、早診療政策提供證據(jù)。

1 方法

1.1 研究設(shè)計 本文為橫斷面調(diào)查，對青海部分地區(qū)活產(chǎn)新生兒足跟血行串聯(lián)質(zhì)譜IMD篩查，對串聯(lián)質(zhì)譜篩查結(jié)果異常的新生兒人群，串聯(lián)質(zhì)譜篩查人群中具有特殊面容、結(jié)構(gòu)畸形新生兒和母親有不良孕產(chǎn)史的新生兒行NGS檢測，考察串聯(lián)質(zhì)譜+NGS篩查新生兒遺傳性疾病的作用和價值。

1.2 篩查時間 2018年1月8日至10月18日。

1.3 篩查現(xiàn)場 青海省紅十字醫(yī)院，青海省交通醫(yī)院，西寧市第二人民醫(yī)院，海南州貴德縣醫(yī)院，黃南州醫(yī)院，海東市民和縣人民醫(yī)院，民和縣第二人民醫(yī)院，民和縣中醫(yī)院。

1.4 篩查人群和血標(biāo)本采集 在征得新生兒父母知情同意后，①生后即刻采集新生兒臍靜脈血和可能采集到的父母靜脈血(1～2 mL，EDTA抗凝管中)，②生后72 h采集新生兒足跟血，滴于新生兒疾病篩查專用干血滴濾紙片，行串聯(lián)質(zhì)譜IMD篩查。青海省西寧市以外的篩查現(xiàn)場，由青海省紅十字醫(yī)院派員協(xié)助所在醫(yī)院采集臍靜脈血和足跟血，并低溫轉(zhuǎn)運標(biāo)本至青海省紅十字醫(yī)院。

1.5 篩查人群信息登記 ①一般信息：父母的年齡，民族，文化程度，職業(yè)，吸煙史，飲酒史，家族疾病史，近親結(jié)婚，晚近三代遺傳病史；母親孕次，分娩年齡，孕周，不良孕產(chǎn)史，分娩方式，孕期疾病(糖尿病、貧血、妊娠期高血壓、胎兒生長受限、感染)，孕期服藥史，先兆流產(chǎn)史，接觸放射線，接觸有毒物質(zhì)，孕期電腦使用情況，孕期和產(chǎn)后相關(guān)疾病及事件(情緒抑郁、焦慮、負(fù)性生活事件)。②新生兒信息：出生體重、身長、頭圍；產(chǎn)前和圍生期情況(羊水、頸部水囊瘤/NT增厚、心臟和腸管強回聲)，五官和四肢特征異常，皮膚異常表現(xiàn)，查體，實驗室和影像學(xué)檢查提示的心血管、神經(jīng)、消化、骨骼、泌尿和血液系統(tǒng)異常。

1.6 篩查高危人群的遴選 復(fù)旦大學(xué)附屬兒科醫(yī)院(我院)兒科研究所分子醫(yī)學(xué)中心從篩查人群信息登記表中遴選特殊面容、結(jié)構(gòu)畸形的新生兒，母親有不良孕產(chǎn)史、家族疾病史、近親結(jié)婚、晚近三代遺傳病史的新生兒作為NGS檢測對象。

1.7 新生遺傳代謝病串聯(lián)質(zhì)譜篩查及異常判斷 足跟采血干血滴濾紙片標(biāo)本均統(tǒng)一在我院兒科研究所質(zhì)譜室行血氨基酸和肉堿譜分析和判斷。應(yīng)用Waters公司Acquity UPLC H-class xevo TQD串聯(lián)四極桿液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，篩查指標(biāo)共52個，包括18種氨基酸、游離肉堿、25種酰基肉堿及8種氨基酸或?；鈮A相互間比值。串聯(lián)質(zhì)譜篩查病種共49種，包括氨基酸代謝病、脂肪酸代謝病和有機酸代謝病[4]。由質(zhì)譜室專業(yè)技術(shù)人員根據(jù)血中特異性氨基酸或?；鈮A以及相關(guān)參數(shù)比值的異常程度[5-7]并結(jié)合篩查人群信息登記表的信息綜合判斷，將質(zhì)譜檢測異常結(jié)果分為IMD可能和提示繼發(fā)性改變可能。鑒于串聯(lián)質(zhì)譜篩查非嚴(yán)格的定量判斷，IMD可能是指：疾病特異性的代謝標(biāo)志物高于正常范圍2倍以上，或低于正常范圍1倍左右，需要召回復(fù)查并隨訪監(jiān)測。繼發(fā)性改變是指：檢測值略高于或低于正常范圍，或者代謝譜的改變不符合疾病特征性，考慮由早產(chǎn)兒肝酶活性低、出生后的應(yīng)激狀態(tài)、進(jìn)食奶量等因素引起的繼發(fā)性改變。

1.8 基于NGS的新生兒基因Panel檢測 我院分子醫(yī)學(xué)中心根據(jù)采集的臍靜脈血抽提基因組DNA行NGS檢測。

1.8.1 檢測方法 抽提自愿受檢者臍靜脈血基因組DNA，使用Agilent ClearSeq Inherited Disease試劑盒(包含2 742個已知致病基因)進(jìn)行外顯子捕獲，采用Illumina HiSeq平臺進(jìn)行測序，目標(biāo)區(qū)域平均測序深度180-200X，其中目標(biāo)序列的98%深度>20X。

1.8.2 基因變異分析及結(jié)果解讀 采用我院高通量測序數(shù)據(jù)分析流程(復(fù)旦流程2.0)篩選遺傳疾病候選變異[8]，原始圖像文件經(jīng)堿基識別(base calling)、去除接頭以及低質(zhì)量的讀序后，采用Burrows-Wheeler Aligner(BWA)軟件將其定位到人類基因組的參考序列上，去除冗余信息后用GATK檢測變異。通過ANNOVAR和VEP(Variant Effect Predictor)等軟件從不同層面對變異進(jìn)行注釋。參閱ACMG對變異的分類標(biāo)準(zhǔn)以及基因是否在ClinVar/OMIM/HGMD中被報道為致病基因，同時采用多種工具預(yù)測錯義變異的功能以及非編碼調(diào)控序列的注釋等?？截悢?shù)變異分析則從同一測序批次的BAM文件開始，經(jīng)過外顯子覆蓋深度的計算、質(zhì)控篩選、CANOES計算CNVs評分并提供候選CNVs，再從基因和區(qū)域水平對CNVs進(jìn)行注釋和篩選[9]。結(jié)合突變頻率、類型，使用明碼開發(fā)驗證過的臨床序列分析軟件(CSA)評估變異，依據(jù)美國醫(yī)學(xué)遺傳學(xué)與基因組學(xué)學(xué)會(ACMG)發(fā)布的《序列變異解讀標(biāo)準(zhǔn)和指南》對變異進(jìn)行分類，再進(jìn)一步結(jié)合相關(guān)疾病的遺傳模式綜合判斷陽性病例[10]，采用Sanger測序驗證陽性變異。

1.9 數(shù)據(jù)統(tǒng)計方法 采用SPSS 21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，計量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差描述。組間比較，當(dāng)方差齊時采用單因素方差分析(one-way ANOVA)，方差不齊的樣本采用非參數(shù)Kruskal-Wallis檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 一般情況 研究期間共收集青海地區(qū)新生兒干血滴濾紙片4 016份(例)，男性2 125例(51.6%)，女性1 991例；漢族2 332例(58.1%)，藏族755例(18.8%)，回族659例(16.4%)，其他民族270例(6.7%)。4 016例來自青海8個市和州，其中西寧市2 180例(54.3%)，海東市1 073例(26.7%)，海北州121例(3%)，黃南州102例(2.5%)，海南州290例(7.2%)，果洛州48例(1.2%)，玉樹州92例(2.3%)、海西州110例(2.7%)。

2.2 串聯(lián)質(zhì)譜檢測結(jié)果 4 016例新生兒中串聯(lián)質(zhì)譜篩查提示代謝異常共59例(1.47%)；①提示IMD可能5例(0.12%)：氨基酸代謝病可能2例(均為苯丙氨酸、苯丙氨酸/酪氨酸均顯著高于正常參考范圍)，有機酸代謝病可能1例(異戊酰肉堿，異戊酰肉堿/乙酰肉堿均高于正常參考范圍)，脂肪酸代謝病可能2例(游離肉堿明顯低于正常參考范圍)；②提示繼發(fā)性改變可能54例(1.35%)：丙氨酸、甘氨酸、苯丙氨酸、丁酰肉堿多種氨基酸均高于正常參考范圍2例，丙氨酸、甘氨酸高于正常參考范圍各1例，瓜氨酸高于正常參考范圍5例，酪氨酸高于正常參考范圍8例，游離肉堿低于正常參考范圍12例，丙酰肉堿及丙酰肉堿/乙酰肉堿高于正常參考范圍5例，丁酰肉堿高于正常參考范圍8例，羥戊酰肉堿高于正常參考范圍2例，癸酰肉堿高于正常參考范圍2例，肉豆蔻烯酰肉堿高于正常參考范圍1例，棕櫚酰肉堿、棕櫚烯酰肉堿、硬酯酰肉堿、硬酯烯酰肉堿均高于正常參考范圍7例。

2.3 NGS檢測

2.3.1 質(zhì)譜篩查提示代謝異常人群 本文2.2部分的59例新生兒。

2.3.2 高危人群 4 016例串聯(lián)質(zhì)譜篩查人群中通過篩查人群信息登記遴選出709例高危新生兒，①母親因素：羊水過多11例、羊水過少95例、妊娠合并貧血84例、瘢痕子宮30例、胎膜早破61例、先天性心臟病3例、胎兒生長受限43例、血小板減少19例、乙肝27例、妊娠期糖尿病91例、妊娠期高血壓47例、甲狀腺功能異常115例、膽汁淤積25例；不良孕產(chǎn)史：流產(chǎn)126例、死胎39例、異位妊娠5例、宮外孕5例；有遺傳病家族史19例。②新生兒因素：早產(chǎn)兒63例，先天性心臟病等心血管異常13例，指趾或其他畸形12例，五官異常8例，皮膚異常3例，消化系統(tǒng)異常1例，多囊腎等泌尿系統(tǒng)異常19例，貧血等血液系統(tǒng)異常2例。

2.4 NGS檢測結(jié)果

2.4.1 IMD 5例IMD可能NGS，確診為IMD 3例，IMD陽性率1∶1 339(0.075%)，表1中，例1和2為高苯丙氨酸血癥，例3為原發(fā)性肉堿缺乏癥；2例NGS未明確質(zhì)譜檢測到的肉堿異常結(jié)果，結(jié)合臨床及隨訪復(fù)查結(jié)果考慮為假陽性；54例提示繼發(fā)性改變可能，NGS檢測均未發(fā)現(xiàn)質(zhì)譜篩查疾病譜范圍內(nèi)IMD，提示質(zhì)譜篩查未發(fā)現(xiàn)假陰性情況。

2.4.2 基因變異分析 54例提示繼發(fā)性改變NGS檢測到致病/可疑致病變異1例(例4)；709例高危兒NGS檢測到致病/可疑致病變異4例(例5～8)。例4～8均非串聯(lián)質(zhì)譜所能篩查的49種病種。

2.4.3 拷貝數(shù)變異 表1顯示，768例行拷貝數(shù)變異分析，6例評級為致病變異。質(zhì)譜篩查提示繼發(fā)性改變，NGS檢測到致病1例(例9)，質(zhì)譜篩查陰性NGS檢測到致病/可疑致病變異5例(例10～14)。上述疾病均非串聯(lián)質(zhì)譜所能篩查的49種病種。

2.5 青海地區(qū)漢、藏、回族質(zhì)譜檢測血代謝物水平

2.5.1 血氨基酸水平 表3顯示，漢藏回民族丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、絲氨酸、色氨酸、亮/異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸和精氨酸水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，漢與回族丙氨酸、絲氨酸、亮/異亮氨酸、纈氨酸、苯丙氨酸、瓜氨酸、谷氨酸、脯氨酸、酪氨酸差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016)，丙氨酸、天冬氨酸、甘氨酸、色氨酸、亮/異亮氨酸，纈氨酸以及脯氨酸和酪氨酸與藏族之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016)，藏族新生兒亮/異亮氨酸與精氨酸水平與回族之間差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016)。

2.5.2 血肉堿水平 血肉堿濃度中，漢族新生兒游離肉堿C0與藏族差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016)，與回族差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016)，藏族新生兒與回族差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P>0.016)；酰基肉堿中，漢、藏、回民族乙酰肉堿、丙酰肉堿、C3/C2、漢族新生兒乙酰肉堿C2,丙酰肉堿C3,C3/C2、丙二酰肉堿C3DC、丁酰肉堿C4、丁二酰肉堿C4DC、異戊酰肉堿C5、羥戊酰肉堿C5-OH、C5/C2、C5/C3、己酰肉堿C6、癸烯酰肉堿C10∶1、月桂酰肉堿C12、肉豆蔻酰肉堿C14、肉豆蔻烯酰肉堿C14∶1、棕櫚酰肉堿C16、棕櫚烯酰肉堿C16∶1、硬酯酰肉堿C18、硬酯烯酰肉堿C18∶1及C0/(C16+C18)水平差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)。兩兩比較顯示，漢族與回族丙二酰肉堿C3DC、羥戊酰肉堿C5-OH、C5/C2、C5/C3、癸烯酰肉堿C10∶1、肉豆蔻酰肉堿C14、硬酯烯酰肉堿C18∶1及C0/(C16+C18)差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016)，與藏族乙酰肉堿C2,丙酰肉堿C3,C3/C2、丁酰肉堿C4、丁二酰肉堿C4DC、羥戊酰肉堿C5-OH、C5/C2、己酰肉堿C6、肉豆蔻酰肉堿C14、棕櫚酰肉堿C16、棕櫚烯酰肉堿C16∶1、硬酯酰肉堿C18、硬酯烯酰肉堿C18∶1差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016)，而藏族新生兒乙酰肉堿C2,丙酰肉堿C3，C3/C2、丙二酰肉堿C3DC、丁酰肉堿C4、C5/C3、己酰肉堿C6、月桂酰肉堿C12、肉豆蔻烯酰肉堿C14∶1、棕櫚烯酰肉堿C16∶1與回族差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.016)。

3 討論

新生兒疾病篩查是提高人口素質(zhì)，降低出生缺陷、減少殘疾兒童發(fā)生的一項重要措施，也是集健康教育、實驗檢測、診斷、治療、隨訪為一體的一項龐大的系統(tǒng)工程。青海位于青藏高原東北部，平均海拔>3 000 m(西寧市境內(nèi)最高海拔4 394 m,市區(qū)中心海拔2 261 m)，紫外線強、氧分壓低(含氧量僅占平原的75%左右)。青海境內(nèi)有漢、藏、回等多民族聚居，不同民族飲食習(xí)慣、生活習(xí)性之間存在明顯差異。近親婚配、孕婦依從率較低及圍生期保健的缺乏均可影響新生兒死亡率及遺傳性疾病的發(fā)生率，2017年《青海省兒童健康狀況通報》顯示，青海地區(qū)新生兒死亡率顯著高于全國平均水平。青海省的新生兒篩查工作起步較晚，自2001年成立青海省新生兒篩查中心以來，新生兒篩查工作逐走步向規(guī)范化，篩查范圍逐漸擴大，篩查率逐漸提高。本研究樣本來自青海全省8個市州(以西寧市為主)，有別于其他地處平原、民族以漢族為主的地區(qū)，著眼于青海地區(qū)高海拔多民族的地域民族特色，在新生兒人群首次開展串聯(lián)質(zhì)譜IMD篩查并對高危新生兒人群行NGS篩查，進(jìn)一步對漢、藏和回民族血中氨基酸及肉堿代謝物水平差異做統(tǒng)計分析，為了解高海拔地區(qū)新生兒IMD發(fā)病率情況、疾病譜特點及其他遺傳相關(guān)性出生缺陷類疾病的發(fā)生情況提供依據(jù)。

本研究中4 016例新生兒質(zhì)譜初篩陽性率為1.47%，與2018年徐州地區(qū)165 262例新生兒質(zhì)譜篩查陽性率2.0%和2017年陜西地區(qū)27 217例新生兒質(zhì)譜篩查陽性率1.69%相仿[11-12]。59例初篩陽性者經(jīng)數(shù)據(jù)評估后，其中5例提示IMD可能，結(jié)合NGS檢測結(jié)果，最終確診3例(2例為高苯丙氨酸血癥，1例為原發(fā)性肉堿缺乏癥)，陽性率為1/1 339，高于美國、加拿大、澳大利亞及西歐部分國家報道的篩查陽性率(1/2 000～1/5 000)[13]，也高于上海、浙江等報道的陽性率(1/3 528～1/7 371)[6,14]，但與2018年寧夏地區(qū)新生兒IMD串聯(lián)質(zhì)譜篩查報道的陽性率相仿(1/1 472)[15]。分析原因如下：①本研究中確診的3例IMD有2例為高苯丙氨酸血癥，而青海地區(qū)高苯丙氨酸血癥的發(fā)生率明顯高于全國的平均水平[16]；②本次研究統(tǒng)計年限相對較短，篩查數(shù)目較小，隨著樣本數(shù)目的擴充，IMD質(zhì)譜檢測陽性率可能會下降；③本研究使用的串聯(lián)質(zhì)譜血氨基酸及肉堿檢測的切值(cut-off值)，是我院質(zhì)譜室前期根據(jù)上海平原地區(qū)數(shù)萬例正常新生兒檢測值的0.5%～99.5%CI計算得出，而青海高海拔地區(qū)多民族聚居，兩者人群基線存在較大差異，而cut-off值設(shè)定標(biāo)準(zhǔn)的不同，可能會對篩查結(jié)果的判斷產(chǎn)生影響。

表3 青海地區(qū)漢藏回新生兒血串聯(lián)質(zhì)譜篩查數(shù)據(jù)比較

續(xù)表1 C0/(C16+C18)9.035±3.8939.405±4.7009.518±4.5113)4.2230.015(C16+C18:1)/C20.276±0.0740.271±0.0760.290±0.3342.5490.180

注 1)：漢族與藏族比較P<0.016；2)：藏族與回族比較P<0.016；3)：漢族與回族比較P<0.016；Ala：丙氨酸；Asp：天冬氨酸；Phe：苯丙氨酸；Tyr：酪氨酸；Leu：亮氨酸；Val：纈氨酸；Met：甲硫氨酸；Cit：瓜氨酸；Arg：精氨酸；Orn：鳥氨酸；Gly：甘氨酸；GAA：胍基乙酸；Cr：肌酸；Pro：脯氨酸；Lys：賴氨酸；Xle：氧代脯氨；Tsp：色氨酸；Glu：谷氨酸；C0：游離肉堿；C2：乙酰肉堿；C3：丙酰肉堿；C3DC：丙二酰肉堿；C4：丁酰肉堿；C4DC：丁二酰肉堿；C4-OH：羥基丁酰肉堿；C5：異戊酰肉堿；C5DC：戊二酰肉堿；C5∶1：戊烯酰肉堿；C5-OH：羥戊酰肉堿；C6：己酰肉堿；C6DC：己二酰肉堿；C8：辛酰肉堿；C10：癸酰肉堿；C10∶1癸烯酰肉堿；C10∶2：癸二烯肉堿；C12：月桂酰肉堿；C14：肉豆蔻酰肉堿；C14∶1：肉豆蔻烯酰肉堿；C14-OH：羥十四酰肉堿；C16：棕櫚酰肉堿；C16∶1棕櫚烯酰肉堿；C16-OH：羥棕櫚酰肉堿；C18：硬酯酰肉堿；C18∶1：硬酯烯酰肉堿；C18-OH：羥硬酯酰肉堿

本研究也發(fā)現(xiàn)，青海地區(qū)漢、藏、回族新生兒的血氨基酸和肉堿水平存在差異，除精氨酸外，其余代謝指標(biāo)水平均表現(xiàn)為少數(shù)民族高于漢族，考慮與少數(shù)民族人群喜食牛、羊肉等飲食習(xí)慣有關(guān)。目前國內(nèi)有關(guān)串聯(lián)質(zhì)譜IMD篩查的cut-off值尚未建立統(tǒng)一的實驗室標(biāo)準(zhǔn)，不同地區(qū)人群的遺傳及環(huán)境背景存在差異，應(yīng)建立適合本地區(qū)人群的正常參考范圍，以最大程度的降低假陽性率、提高陽性預(yù)測值。

新生兒機體代謝譜的變化受到環(huán)境、飲食、藥物、生理狀態(tài)、代謝等因素的影響，因此串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)診斷需定期隨訪檢測代謝物的變化，并結(jié)合基因手段或尿氣相色譜質(zhì)譜等技術(shù)確診。基于NGS的新生兒基因Panel檢測技術(shù)，覆蓋面廣、不完全依賴于典型的臨床表現(xiàn)，可以避免新生兒喂養(yǎng)、代謝及疾病等狀況的干擾，通過明確致病基因，可以對疾病進(jìn)行分子分型。質(zhì)譜檢測+NGS較單純質(zhì)譜檢測可以更加快速全面確診臨床表現(xiàn)疑似IMD的高危新生兒，盡早實施個體化治療，改善患兒預(yù)后[4]。本研究中，NGS最終確診3例IMD。3例IMD在新生兒期均無明顯臨床癥狀，高苯丙氨酸血癥如果能在新生兒期開始通過飲食控制治療智能發(fā)育可接近正常人，而原發(fā)性肉堿缺乏癥若早期治療預(yù)后較好，可以逆轉(zhuǎn)大部分癥狀，能避免給患兒家庭及社會帶來不幸。

串聯(lián)質(zhì)譜檢測技術(shù)只能對數(shù)十種IMD進(jìn)行篩查，而目前已知IMD有數(shù)千種，大部分IMD不能通過質(zhì)譜技術(shù)進(jìn)行早期篩查。NGS不僅可以檢測到串聯(lián)質(zhì)譜篩查疾病譜以外的單基因遺傳病，而且通過算法優(yōu)化，還能分析由基因組拷貝數(shù)異常導(dǎo)致的疾病，為出生缺陷患兒早診斷、早干預(yù)、早治療提供臨床依據(jù)。本研究中，NGS除了確診了質(zhì)譜篩查陽性的3例IMD，另檢測到5例單基因突變及6例染色體拷貝數(shù)變異引起的遺傳病，涉及耳聾、多發(fā)畸形，精神發(fā)育遲緩等多種方面。以表1中SLC26A4基因復(fù)合雜合突變耳聾為例(例7)，該基因突變所致的聽力障礙可以表現(xiàn)為遲發(fā)性，在新生兒期聽力篩查正常。因此早期基因診斷對改善這部分患兒預(yù)后尤為重要，通過佩戴助聽器或植入人工耳蝸在1歲以內(nèi)最佳干預(yù)期給予患兒足夠的聲音刺激，能促進(jìn)其聽覺和語言中樞發(fā)育，使存在聽力障礙的兒童恢復(fù)部分聽力，或者做到聾而不啞，提高生活質(zhì)量。另一方面通過NGS明確致病基因，可對家族中其他成員是否發(fā)生同樣的病癥做出風(fēng)險評估，對于有再生育要求的夫婦可開展遺傳咨詢和產(chǎn)前診斷。

本研究串聯(lián)質(zhì)譜技術(shù)對正常新生兒進(jìn)行普篩，聯(lián)合NGS技術(shù)對篩查陽性及其他存在高危因素的新生兒進(jìn)行基因診斷的模式，該模式不僅可以從基因水平確診質(zhì)譜篩查提示的陽性病例，還可以診斷質(zhì)譜篩查陰性的其他新生兒遺傳病，在疾病癥狀表現(xiàn)之前或表現(xiàn)輕微時，得以早發(fā)現(xiàn)、早控制、早治療，對保障高海拔地區(qū)兒童健康、助力個性化治療具有非常重要的意義，是現(xiàn)階段在青海地區(qū)進(jìn)行新生兒篩查的可行模式。在下一階段工作中，可根據(jù)本研究中陽性患兒疾病譜特點，及其他遺傳病基因致病位點攜帶情況，設(shè)計針對青海人群的基因檢測小包，將檢測基因數(shù)目控制在100個左右，降低檢測成本，縮短報告周期，使NGS檢測能得到更好的推廣。另一方面還可利用該基因包對存在不良孕產(chǎn)史，或其他高危風(fēng)險的夫婦開展攜帶者篩查，針對檢測結(jié)果進(jìn)行遺傳咨詢，加強孕前保健和宣教，進(jìn)一步防止出生缺陷的發(fā)生，達(dá)到全面提高出生人口質(zhì)量的目的。

本文不足與局限：①本研究篩查現(xiàn)場主要為青海省紅十字醫(yī)院，雖然還有西寧市的另外2家醫(yī)院，海南州的3家，海東市的3家，雖然平均海拔3 000米以上，紫外線強、氧分壓低(含氧量僅占平原的75%左右)，但代表青海高海拔地區(qū)抽樣不均衡；②篩查人群信息登記可能受不同醫(yī)院信息采納和收集能力所限會存在信息采集偏倚，如產(chǎn)前和圍生期情況，查體、實驗室和影像學(xué)檢查等；③篩查高危人群的遴選是基于采集信息做出判斷可能存在篩查高危人群判斷偏倚；④本研究使用的串聯(lián)質(zhì)譜血氨基酸及肉堿檢測的切值(cut-off值)是根據(jù)上海平原地區(qū)數(shù)萬例正常新生兒檢測值的0.5%～99.5%的CI計算得出，以此作為青海高海拔地區(qū)遺傳代謝病篩查可能會更多出現(xiàn)假陽性病例。