安 然,馬風(fēng)云,崔浩然,秦光華,黃雅麗,田 琪

1 山東農(nóng)業(yè)大學(xué)林學(xué)院,山東農(nóng)業(yè)大學(xué)生態(tài)與環(huán)境實驗室,泰安 271018 2 黃河下游森林培育國家林業(yè)局重點實驗室,泰安 271018 3 山東省泰山森林生態(tài)系統(tǒng)國家定位觀測研究站，泰安 271018 4 山東省林業(yè)科學(xué)研究院，濟南 250014

在森林生態(tài)系統(tǒng)中,土壤細菌是土壤的重要組成部分,參與土壤中發(fā)生的多個生態(tài)過程,在推動和確保生態(tài)系統(tǒng)物質(zhì)循環(huán)、能量流動以及信息傳遞[1-2]等生態(tài)過程中發(fā)揮著極為重要的作用。良好的土壤細菌結(jié)構(gòu)能夠改善土壤理化性質(zhì),提高土壤肥力,從而促進林分的生長[3]。土壤細菌群落多樣性是評價土壤質(zhì)量的一項重要指標。土壤中細菌多樣性越高,越有利于土壤恢復(fù)力和抗壓力的提高[4]。土壤細菌的種類和分布不僅受土壤理化性質(zhì)的影響,也受植物種類的影響[5-6]。很多研究表明,土壤細菌群落多樣性與植物群落多樣性呈正相關(guān),植物群落物種多樣性能夠顯著影響土壤細菌多樣性及其群落結(jié)構(gòu)和功能[7]。

黃河三角洲地區(qū)是我國典型的鹽堿地區(qū)域,土壤鹽分含量高,導(dǎo)致適合在這里栽培的喬木樹種較少,其中刺槐(Robiniapseudoacacia)和臭椿(Ailanthusaltissima)是較為耐鹽堿的樹種,以往該地區(qū)主要大面積栽培單一樹種的純林,尤其是刺槐純林,由各種耐鹽樹種組成的混交林則很少。而單一樹種構(gòu)成的純林有很多缺陷,很多地方營造的純林極早的出現(xiàn)了退化,因此營造混交林并對其進行研究將是該地區(qū)今后造林的發(fā)展方向。據(jù)不完全統(tǒng)計,在黃河三角洲河口區(qū)墾利縣(試驗所在地)刺槐臭椿混交林栽培總面積在0.2 km2左右。很多學(xué)者已經(jīng)對該地區(qū)建立的混交林進行了研究,對黃河三角洲人工刺槐混交林細根分布進行研究時發(fā)現(xiàn)刺槐臭椿混交林可提高人工林細根生物量(白世紅等[8])。侯本棟等[9]研究表明在黃河三角洲鹽堿區(qū)混交林有機質(zhì)、速效氮含量均高于刺槐純林,同時顯著改善了土壤中主要土壤酶活性。由于傳統(tǒng)研究方法技術(shù)的限制[10],很難完整的對土壤細菌群落的結(jié)構(gòu)和多樣性進行分析。近幾年發(fā)展的第二代高通量測序技術(shù)可更全面更準確地描述各種土壤細菌群落信息[11]。但目前利用該技術(shù)對刺槐和臭椿混交林土壤細菌的研究還較少。鑒于此,本文選取刺槐臭椿混交林作為研究對象,以相應(yīng)的2種純林為對照,比較兩種純林及混交林中土壤細菌群落結(jié)構(gòu)及多樣性的差異,這對于該地土壤及植被的恢復(fù)具有重要的指導(dǎo)意義,同時可為黃河三角洲鹽堿地混交林的營造及管理提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地概況

研究地點位于山東省東營市河口區(qū)(118°53′27″—118°55′41″E,37°59′14″—37°88′23″N),該地區(qū)屬暖溫帶半濕潤區(qū)大陸性季風(fēng)氣候,年均氣溫12.94 ℃,無霜期201 d,年均降水量500—600 mm,7—8月降水量約占全年降水量的50%,且多暴雨,易形成旱澇災(zāi)害;年均蒸發(fā)量為1962.1 mm。土壤為沖積性黃土母質(zhì)在海浸母質(zhì)上沉淀而成,層次變化復(fù)雜(劉云等[12])。天然植被以鹽生、濕生的禾本科植物為主,主要造林樹種有刺槐(Robiniapseudoacacia)、國槐(Sophorajaponica)、苦楝(Meliaazedarach)、楊樹(Populuseuramericana))、白蠟(Fraxinuschinensis)、檉柳(Tamarixchinensis)等。

1.2 林型選擇及采集方法

2016年11月在刺槐純林、臭椿純林、刺槐臭椿混交林3種林型中分別設(shè)置面積為20 m ×20 m 標準樣地各3塊,在每個樣地按S型設(shè)置5個樣點,在每個采樣點采集0—20 cm土層的原狀土,將相同標準地各個樣點土樣混合均勻,每個土樣采集大約500 g左右。所得樣品分為2份,裝入無菌自封袋,于冰盒中帶回實驗室。其中1份自然風(fēng)干后過2 mm篩后用于土壤理化性質(zhì)的測定;另一份鮮樣保存在-80 ℃冰箱中,用于土壤微生物特性的測定[13]。

1.3 土壤理化性質(zhì)測定

土壤理化性質(zhì)的測定采用常規(guī)分析法：含水量使用便攜式土壤水分測定儀測定(TZS-IW);土壤pH采用電位法(Starter 2C);有機質(zhì)(soil organic matter, SOM)采用容量法(外加熱法)重鉻酸鉀氧化-油浴加熱法測定;堿解氮(available nitrogen, AN)采用堿解擴散法;有效磷(available phosphorous, AP)采用氟化銨-鹽酸法測定;速效鉀(available K, AK)采用火焰光度計法,全氮(total nitrogen，TN)采用凱氏定氮法;全磷(total phosphorus，TP)采用NaOH熔融-鉬銻抗比色法[14-15]。

1.4 土壤細菌DNA提取、處理及上機流程

采用CTAB方法對樣本的總DNA進行提取[16]。用Qubit2.0檢測DNA濃度,瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA完整性。每個樣品3個重復(fù),將同一樣品的土壤DNA混合,作為每份土壤樣品的總DNA。使用帶Barcode的特異引物Phusion? High-Fidelity PCR Master Mix with GC Buffer(New England Biolabs,USA)以及高效和高保真的酶進行細菌PCR擴增,以確保擴增效率和準確性。引物對應(yīng)區(qū)域為：16S V4區(qū)引物為515F-806R。PCR產(chǎn)物使用2%濃度的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測;根據(jù)PCR產(chǎn)物濃度進行等濃度混樣,充分混勻后使用2%的瓊脂糖凝膠電泳檢測PCR產(chǎn)物,采用膠回收試劑盒GeneJET(Thermo Scientific, USA)對DNA進行回收?；厥债a(chǎn)物用Qubit 2.0定量,根據(jù)測得的DNA濃度,將所有樣品按照1∶1的比例進行混合,該混合樣品可用于后續(xù)的測序,從而省去建庫過程。

試驗上機流程主要包括：PCR擴增、等量混樣以及產(chǎn)物純化。以上流程由北京諾禾致源生物信息科技有限公司提供,測序儀器為Illlumina公司Miseq,測序所得結(jié)果截掉質(zhì)量低的數(shù)據(jù),以提高后續(xù)序列融合比率。通過Flash軟件融合雙末端序列,使其形成一條序列。采用 prinseq軟件對各個樣品進行去引物序列、短片段、低復(fù)雜度序列、低質(zhì)量序列。

1.5 物種注釋與豐度計算

利用Uparse[17]軟件對所有樣品的全部有效序列(Effective tags)進行聚類,默認以97%的一致性(Identity)將序列聚類成為OTUs(Operational taxonomic units),同時選取OTUs的代表性序列,依據(jù)其算法原則,篩選OTUs中出現(xiàn)頻率數(shù)最高的序列作為OTUs的代表序列。將這些代表性序列集合用RDP Classifier[18]與GreenGene數(shù)據(jù)庫[19]進行物種注釋分析(設(shè)定閾值為0.8—1),研究OTUs之間的系統(tǒng)發(fā)生關(guān)系,獲得分類學(xué)信息用Mothur軟件包以97%為劃定閾值對16S rRNA基因序列劃分操作分類單元(OTU),并構(gòu)建稀釋曲線。利用QIIME軟件計算樣品包括Chao 1指數(shù)和Shannon指數(shù)的Alpha多樣性值[20]。

1.6 數(shù)據(jù)分析

利用QIMIE(Version 1.50)軟件對樣品的Alpha多樣性進行計算,包括Observed species指數(shù)、Chao1指數(shù)和Shannon指數(shù),利用SPSS 22.0進行單因素方差分析(Duncan)及相關(guān)性分析(Pearson)。采用R語言進行統(tǒng)計分析和作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 土壤理化性質(zhì)分析

由表1可知,刺槐臭椿混交林土壤含水量顯著高于純林,且兩純林土壤之間差異顯著(P< 0.05)?；旖涣滞寥篮糠謩e是臭椿純林、刺槐純林的137%、252%。臭椿刺槐混交林土壤pH值、全磷含量、堿解氮含量與兩純林相比無顯著差異?；旖涣钟袡C質(zhì)、全氮含量和速效鉀含量顯著高于刺槐純林(P<0.05)但與臭椿純林相比無顯著差異?；旖涣滞寥烙行Я缀渴浅舸患兞值?.05倍,其差異達5%顯著水平,但與刺槐純林之間無顯著性差異?；旖涣滞寥烙行Я姿傩р浐匡@著高于刺槐純林(P< 0.05),但與臭椿純林之間無顯著性差異。

表1 不同林分土壤理化性質(zhì)

同列不同小寫字母表示處理間差異顯著 (P<0.05);CC: 刺槐純林Robiniapseudoacacia;CH: 臭椿純林Ailanthusaltissima;FCC:Robiniapseudoacacia×Ailanthusaltissima; OM: Organic Matter；AP: Available Phosphorus；AK: Available Kalium；TN: Total Nitrogen；TP: Total Phosphorus；AN: Available Nitrogen

2.2 測序數(shù)據(jù)分析

圖1 細菌稀釋曲線分析Fig.1 Rarefaction curve analysis of OTUs

通過高通量測序,從臭椿純林、刺槐純林、刺槐臭椿混交林3種土壤樣品中分別獲得26316、31281、38657條原始序列(Raw Tags),過濾掉低質(zhì)量的序列后,有效序列(Effective Tags)條數(shù)分別為25949、30964、37911。采用隨機抽樣法,將這些序列在97%相似度上進行聚類,形成用于物種分類的OTU。由圖1可知,OTU數(shù)隨序列的增加而增加,不同林分之間的OTU數(shù)按下列順序遞減：刺槐臭椿混交林>刺槐純林>臭椿純林,且其差異均達5%顯著水平。3種林分細菌稀釋曲線隨OTU數(shù)增大基本趨于平緩,但未達到飽和。更多的測序數(shù)據(jù)對發(fā)現(xiàn)新的OTU貢獻率較小,表明測序數(shù)據(jù)合理。

2.3 門水平上土壤細菌群落結(jié)構(gòu)相對豐度分析

在門水平上,3種林分土壤共檢測出31門細菌,其中臭椿純林、刺槐純林、刺槐臭椿混交林土壤分別檢測出27、25、31門細菌。酸桿菌門(Acidobacteria)、變形菌門(Proteobacteria)、放線菌門(Actinobacteria)、硝化螺旋菌門(Nitrospirae)、綠彎菌門(Chloroflexi)、浮霉菌門(Planctomycetes)、芽單胞菌門(Gemmatimonadetes)、疣微菌門(Verrucomicrobia)8種細菌在3種林分土壤中相對豐度均超過1%。除這8種細菌以外,在刺槐臭椿混交林土壤中擬桿菌門(Bacteroidetes)的相對豐度也超過1%。其中臭椿純林土壤中變形菌門細菌相對豐度最高,比例為35.3%,其細菌相對豐度顯著高于其他兩種林分土壤中的豐度。臭椿純林、刺槐純林和混交林土壤中酸桿菌門細菌的豐度分別為20.4%、25.2%、27.6%,其中混交林土壤中酸桿菌門細菌相對豐度顯著高于臭椿純林(P< 0.05)。研究發(fā)現(xiàn)擬桿菌門相對豐度僅在臭椿刺槐混交林中超過1%,其豐度為1.02%,在其他兩種林分土壤豐度中分別為0.61%、0.81%。由圖2可知,臭椿純林、刺槐純林土壤有酸桿菌門、變形菌門、放線菌門、硝化螺旋菌門4種優(yōu)勢細菌群落(群落豐度>10% 為優(yōu)勢菌落),而臭椿刺槐混交林土壤則只有3種優(yōu)勢細菌(酸桿菌門、變形菌門、放線菌門);硝化螺旋菌門不是混交林土壤中的優(yōu)勢種,豐度僅為6.45%,其在刺槐純林和臭椿純林2種純林土壤中豐度分別為11.6%、11.9%。此外,刺槐臭椿混交林中還有兩個特有的門SBR1093和PAUC34f。

圖2 門水平土壤細菌群落結(jié)構(gòu)Fig.2 Soil bacterial community on the phylum level Acidobacteria：酸桿菌門,Proteobacteria：變形菌門,Actinobacteria：放線菌門,Nitrospirae：硝化螺旋菌門,Chloroflexi：綠彎菌門,Planctomycetes：浮霉菌門,Gemmatimonadetes：芽單胞菌門,Verrucomicrobia：疣微菌門,Bacteroidetes：擬桿菌門,Armatimonadetes：裝甲菌門,Cyanobacteria：藍細菌門,Crenarchaeota：泉古菌門,Euryarchaeota：古生菌門,Firmicutes：厚壁菌門,Chlorobi：綠菌門,Elusimicrobia：迷蹤菌門,Fibrobacteres：纖維桿菌門,Fusobacteria：梭桿菌門,Caldithrix：藍藻門,Tenericutes：柔膜菌門,(WS3,TM7,WYO,BRC1,NKB19,Thermi,SBR1093,GAL15,OP3,WS2,OD1,TM6,PAUC34f,NC10,WPS-2)未定菌,Others：其他

2.4 細菌多樣性指數(shù)

刺槐臭椿混交林的物種數(shù)、Chao1指數(shù)、Shannon指數(shù)分別為1910.0、2419.0、9.1(表2),其中刺槐臭椿混交林的物種數(shù)顯著高于刺槐純林和臭椿純林,且物種數(shù)在2種純林種也表現(xiàn)出顯著差異(P< 0.05)。刺槐純林的Chao1指數(shù)為2526.6,顯著高于臭椿純林和刺槐臭椿混交林(P< 0.05),但Chao1指數(shù)在臭椿純林和混交林中無顯著差異。3種不同林分土壤的Shannon指數(shù)無顯著差異。

2.5 細菌群落與土壤理化性質(zhì)主成分分析

以土壤理化性質(zhì)數(shù)據(jù)作為土壤環(huán)境變量,3種不同林分細菌群落在門水平上相對豐度大于1%的8種細菌門類相對豐度數(shù)據(jù)作為物種數(shù)據(jù)進行主成分分析,結(jié)果如圖3A所示,第1主成分(PC1)解釋了細菌群落變化的75.79%,第2主成分(PC2)解釋了24.21%,在第1主成分軸上含水量、全氮含量貢獻較大,在第2主成分軸上有效磷含量、pH與混交林土壤細菌高度相關(guān)。圖3B表示,3種不同林分之間土壤細菌群落結(jié)構(gòu)差異顯著,有較高程度的分離,與臭椿純林相關(guān)性較強的是變形菌門、芽單胞菌門;與刺槐純林相關(guān)性較強的是放線菌門、硝化螺旋菌門;與混交林相關(guān)性較強的是酸桿菌門、綠彎菌門、浮霉菌門、疣微菌門。

表2 不同林分土壤中細菌群落多樣性分析

同一行標注不同小寫字母的數(shù)據(jù)表示處理間存在顯著差異(P<0.05)

圖3 主要細菌群落與土壤理化性質(zhì)主成分分析Fig.3 Principal component analysis of main bacterial communities and soil physical and chemical properties CC: 刺槐純林Robinia pseudoacacia;CH: 臭椿純林Ailanthus altissima;FCC: Robinia pseudoacacia×Ailanthus altissima;

3 討論

3.1 不同林分類型對土壤細菌結(jié)構(gòu)及多樣性的影響

一般來說陸地生態(tài)系統(tǒng)可分為地上和地下兩部分。地下的土壤生態(tài)系統(tǒng)中的土壤細菌在驅(qū)動物質(zhì)循環(huán)和能量交換過程而作用于地上生態(tài)系統(tǒng)的同時,自身也受到地上生態(tài)系統(tǒng)的影響,其中植物對土壤細菌群落多樣性的影響顯得尤為突出[21]。植被是土壤細菌賴以生存的有機營養(yǎng)物和能量的重要來源,植被通過影響土壤有機碳和氮的水平、土壤含水量、及pH值等來影響土壤細菌多樣性[22]。植物地下部分的根系會產(chǎn)生各種分泌物,能形成特殊的根際環(huán)境。Kourtev等[23]研究表明,通常外來植物取代土著植物后會改變根系對土壤的營養(yǎng)物質(zhì)輸入,從而影響土壤細菌的結(jié)構(gòu)與功能。因此,不同樹種的混交實際上是改變了植物的類型,許多研究[24-25]表明,混交林可較好地促進土壤細菌的生長并豐富其多樣性。本試驗研究發(fā)現(xiàn),刺槐臭椿混交林及其純林因林分類型不同,土壤細菌群落的組成和結(jié)構(gòu)也不同。其中刺槐臭椿混交林土壤中檢測出31門細菌,而臭椿純林、刺槐純林土壤中分別只有27、25門細菌,刺槐臭椿混交林土壤中擬桿菌門(Bacteroidetes)細菌是相對豐度超過1%的主要細菌群落,而在兩種純林土壤中擬桿菌門則不是主要細菌群落,說明刺槐臭椿混交后不僅使土壤細菌組成更豐富,土壤中細菌豐度也有提高。很多研究表明森林土壤細菌群落組成是由主要樹種決定的[26-27],對針闊混交林的研究發(fā)現(xiàn)針闊混交林的土壤微生物結(jié)構(gòu)與針葉林和闊葉林均有明顯區(qū)別。羅達等[28]的研究也表明：與純林相比,南亞熱帶鄉(xiāng)土樹種營造的人工混交林可提高土壤生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性,增加土壤細菌種類。王凌云等[29]在研究馬尾松純林與楓香木荷混交林土壤微生態(tài)環(huán)境差異時發(fā)現(xiàn),香楓木荷混交林在改善土壤細菌生存環(huán)境方面有更明顯效果。造成這種現(xiàn)象的原因可能是在門水平上,土壤細菌群落結(jié)構(gòu)的變化受到自身細菌生長速率等因素的驅(qū)動[30],另外混交林相比純林有更為豐富和多樣的植物凋落物,提高了土壤保水能力,使得土壤環(huán)境和營養(yǎng)條件得以改善,加快細菌生長為土壤細菌數(shù)量的增加和群落結(jié)構(gòu)的豐富創(chuàng)造了條件[31]。不同林分類型,在凋落物數(shù)量和質(zhì)量、土壤有機質(zhì)含量以及土壤含水量等方面會有較大差異,這些差異會影響到土壤細菌的生存環(huán)境,從而影響到土壤細菌種類、數(shù)量、組成和分布等[32]。從前人的研究成果和本文的研究結(jié)果來看,與相應(yīng)的純林比較,混交林能改變土壤細菌的結(jié)構(gòu),提高土壤細菌的多樣性,為土壤功能的恢復(fù)奠定基礎(chǔ)。植物與土壤細菌群落的關(guān)系是復(fù)雜的,是各種影響因素綜合作用的結(jié)果,植物與土壤細菌之間的相互作用推動著由它們共同組成的生態(tài)系統(tǒng)功能的變化[33]。因此應(yīng)加強土壤微生物功能多樣性與植被之間的關(guān)系研究,使其發(fā)揮更大的生產(chǎn)和生態(tài)作用。

3.2 土壤理化性質(zhì)對土壤細菌多樣性的影響

土壤細菌的生存和繁衍需要一定的環(huán)境條件。土壤水分是土壤細菌所需的最基本條件,參與土壤細菌的各種的代謝活動[34],較好的土壤水分條件可為細菌的生長繁殖提供更為優(yōu)越的條件。吳俐莎等[35]研究表明,土壤含水量減少, 不利于細菌生長, 細菌數(shù)量會減少。本研究中,刺槐臭椿混交林土壤含水量顯著高于純林,3種林分土壤含水量呈刺槐臭椿混交林>臭椿純林和>刺槐純林,表明樹種混交增加了土壤含水量,這可能也是混交林土壤中細菌物種數(shù)高于純林的原因之一。本研究相關(guān)性分析也表明土壤含水量與物種數(shù)和Shannon指數(shù)呈正相關(guān),說明土壤含水量對土壤細菌群落多樣性有一定影響,與安韶山等[36]和區(qū)余端等[37]的研究結(jié)果相似。

刺槐臭椿混交林有機質(zhì)含量顯著高于刺槐純林,土壤中細菌多樣性和豐富度也高于相應(yīng)的純林。鄧嬌嬌等[38]研究也發(fā)現(xiàn)混交林土壤有機質(zhì)含量比純林高,同時混交林土壤細菌的多樣性和豐富度也較純林高。這可能是土壤中的有機質(zhì)可直接為土壤細菌提供生長所需的營養(yǎng)。Tóth等[39]研究證實,有機質(zhì)含量的高低能對土壤細菌群落的結(jié)構(gòu)和組成產(chǎn)生影響。

土壤中磷也是土壤細菌的重要營養(yǎng)來源,磷元素的多少也影響土壤細菌在土壤中生存和繁殖。唐宏亮等[40]研究磷供應(yīng)對玉米根際微生物的影響時發(fā)現(xiàn)當土壤含磷量較高時,可增加土壤微生物的代謝,提高土壤微生物的多樣性。本試驗中,刺槐臭椿混交林有效磷含量顯著高于臭椿純林,與土壤細菌物種數(shù)呈正相關(guān),表明土壤有效磷含量變化會引起土壤細菌群落變化。李亞娟等[41]研究發(fā)現(xiàn)當土壤中的磷元素大部分以遲效性狀態(tài)存在時,并不能很好地為土壤生物所利用,因此土壤全磷含量有時不能作為土壤磷素供應(yīng)的指標。所以在研究磷素對土壤細菌的影響時,應(yīng)綜合考慮土壤中全磷和有效磷兩種形式(楊菁等[42])。

細菌的多樣性高低不僅和物種數(shù)量有關(guān),還與物種分布的均勻程度有關(guān)。在計算刺槐純林、臭椿純林和刺槐臭椿混交林細菌多樣性時,刺槐林的Chao 1指數(shù)高于其他兩種林分,物種數(shù)又低于其他兩種林分,這可能與刺槐林分中土壤細菌分布較為均勻有關(guān),因而多樣性也稍高于另外兩種林分。

本文以黃河三角洲刺槐臭椿混交林及其純林作為研究對象,探究混交對土壤細菌群落的影響,通過運用高通量測序技術(shù),更準確地分析刺槐和臭椿混交對土壤細菌群落影響。本研究發(fā)現(xiàn)刺槐臭椿混交改善了土壤理化性質(zhì),提高了土壤細菌多樣性,說明混交栽培較相應(yīng)的純林有一定的優(yōu)勢,因此在黃河三角洲地區(qū)應(yīng)提倡栽培具有耐鹽性樹種組成的混交林,以提高林分的穩(wěn)定,使其發(fā)揮更好的生態(tài)效益和經(jīng)濟效益。

4 結(jié)論

酸桿菌門、變形菌門、放線菌門細菌豐度占到了細菌總量的69%—71%,是3種林地的共同優(yōu)勢細菌群落,尤其是在刺槐臭椿混交林中所占比例最高。刺槐臭椿混交林土壤細菌多樣性顯著高于刺槐純林和臭椿純林,混交林豐富了土壤細菌群落。同時,混交增加了物種數(shù)量,混交林土壤細菌多樣性優(yōu)于單一樹種純林,土壤理化性質(zhì)也在一定程度上有所改善尤其是土壤含水量、有效磷含量。