LewisEEdwin王從麗

(1．中國科學院 東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所 黑土區(qū)農(nóng)業(yè)生態(tài)重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150081； 2．美國愛達荷大學 植物、土壤和昆蟲學系，愛達荷 美國 ID 83844)

0 引 言

溫度是制約昆蟲種群發(fā)生、分布和擴散的重要環(huán)境因子。在長期進化和自然選擇過程中，昆蟲形成了一系列適應外界溫度變化的策略。其中，冷馴化作為一種有效提高耐寒能力的途徑，在昆蟲對環(huán)境溫度晝夜和季節(jié)變化的適應中發(fā)揮著重要作用。自然界中的很多種昆蟲經(jīng)常暴露在不利的低溫環(huán)境中，使得存活成為多種昆蟲的主要挑戰(zhàn)[1]，而暴露于非致命低溫環(huán)境可以提高昆蟲的抗低溫能力等特性[2-3]。張剛應和楊懷文[4]研究發(fā)現(xiàn)，斯氏線蟲Steinernemacarpocapsae對12 ℃貯存一周的大蠟螟(Galleriamellonella)幼蟲的致死率沒有明顯變化，但大蠟螟幼蟲的12 ℃貯存時間對線蟲侵染強度有明顯的影響。楊秀芬等[5]證實了低溫誘導有助于培育斯氏線蟲A54適應0 ℃以上的低溫特性，但恢復25 ℃培養(yǎng)2個侵染循環(huán)后線蟲耐低溫特性有不同程度的喪失。5 ℃儲存349 d的S.carpocapsae對大蠟螟幼蟲的侵染力較新培養(yǎng)的線蟲顯著下降[6]。但對關于低溫馴化的寄主昆蟲對昆蟲病原線蟲其它方面的生物學特性的影響還未見報道。

環(huán)境溫度也是限制昆蟲病原線蟲推廣應用的因素之一。我國東北地區(qū)，春秋季晝夜溫差大，不耐低溫的病原線蟲存活率降低，致病力下降。例如，我國北方的韭菜根蛆每年4、5月份是為害盛期，此時地溫較低，非耐低溫的線蟲不易侵染，所以低溫下防治效果很差[7-8]。而從我國寒冷地區(qū)—黑龍江省分離到的耐寒昆蟲病原線蟲對北方韭菜根蛆的防治效果達100%[9-10]。因不同線蟲種(品系)對溫度的適應性與其最初的自然生長環(huán)境有關[11-12]，使得昆蟲病原線蟲的生物學特性不同，對害蟲防治效果也存在很大差異[13]。

該研究采用非耐寒和相對較耐低溫的昆蟲病原線蟲為研究對象，試圖探索其侵染力、繁殖力及存活力對低溫馴化后的寄主昆蟲的響應，以明確低溫馴化后的寄主昆蟲對昆蟲病原線蟲生物學特性的影響，為昆蟲病原線蟲在晝夜或季節(jié)溫差較大地理區(qū)域的害蟲防治應用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

供試寄主昆蟲：開心果、胡桃、巴旦木和核桃里的害蟲—臍橙螟Amyeloistransitella(Walker)，由美國圣華金河谷農(nóng)業(yè)科學中心的Siegal研究員提供的卵和食物。其飼養(yǎng)方法參照Siegal等[14]，將卵置于25 ℃、光照12 h、相對濕度70%的培養(yǎng)箱中，從卵飼養(yǎng)到五齡幼蟲約25 d。

供試昆蟲病原線蟲：S.carpocapsae和S.feltiae，由美國加州大學戴維斯分校提供，采用White trap[15]方法，以大蠟螟為寄主昆蟲進行繁殖，30 d內(nèi)備用。

1.2 試驗方法

將臍橙螟5齡幼蟲進行10 ℃、15 ℃、20 ℃和25 ℃4個溫度處理。每處理3個培養(yǎng)皿(直徑60 mm)，皿內(nèi)墊有同皿底一樣大小的雙層濾紙，再向皿內(nèi)加0.5 mL蒸餾水。每皿10頭5齡幼蟲，每頭幼蟲體重約0.05 g，置于不同溫度的恒溫培養(yǎng)箱中，每天向皿內(nèi)加0.1 mL水保濕。7 d后取出所有溫度處理的培養(yǎng)皿置于室溫1 d。

不同溫度處理后的臍橙螟幼蟲，用線蟲S.carpocapsae和S.feltiae侵染，侵染劑量為50條侵染期線蟲(IJs)/頭幼蟲，于25 ℃培養(yǎng)。接種線蟲后24 h和48 h，調(diào)查臍橙螟幼蟲死亡率，并解剖幼蟲調(diào)查侵入體內(nèi)的線蟲數(shù)量，計算實際侵入率，每皿解剖1頭。然后，保證每皿5頭幼蟲，25 ℃培養(yǎng)8 d，調(diào)查幼蟲體表是否有線蟲出現(xiàn)，并計算臍橙螟幼蟲體表有線蟲出現(xiàn)的比率。培養(yǎng)至22 d～26 d，收集所有線蟲，計算產(chǎn)量。

經(jīng)不同溫度馴化寄主體內(nèi)繁殖后的線蟲加入50目無菌沙子中，保持沙子含水量為5%，直徑為40 mm的塑料培養(yǎng)皿中裝有沙子5 g，含有500條收集到的侵染期線蟲。每處理3皿，將培養(yǎng)皿直接投入-15 ℃冰箱中20 min后，取出后置于室溫12 h，將沙子倒入250 ml燒杯，加水漩渦，倒出上清液，顯微鏡下調(diào)查上清液中線蟲的冷凍存活率。

1.3 數(shù)據(jù)分析

每個試驗重復3次。試驗中調(diào)查所得數(shù)據(jù)經(jīng)Excel處理和SPSS11.5軟件分析，采用單因素(One-Way ANOVA)于0.05水平方差分析各處理間的差異顯著性。

2 結(jié)果與分析

2.1 低溫馴化寄主對昆蟲病原線蟲致病力的影響

從線蟲對5齡臍橙螟幼蟲經(jīng)4個溫度處理后的致死率可以看出(圖1)，侵染24 h時，線蟲對4個溫度處理后的寄主昆蟲致死率無顯著影響，S.carpocapsae對寄主的致死率為52.6%～70.0%，S.feltiae的致死率為40.7%～61.9%。48 h時，S.carpocapsae對寄主的致死率均達100%，S.feltiae的致死率為81.4%～96.7%，并且S.feltiae對經(jīng)10 ℃處理的5齡臍橙螟幼蟲致死率(96.7%)顯著高于25 ℃處理(81.4%)(P<0.05)。分析其原因可能是寄主昆蟲經(jīng)過10 ℃處理7d后昆蟲本身免疫力降低，使得中間型的S.feltiae線蟲致病力明顯增強，但對于伏擊型的S.carpocapsae對寄主的致死率沒有明顯影響，因為寄主的校正死亡率均已達100%。

2.2 低溫馴化寄主對線蟲侵入力的影響

不同溫度處理5齡臍橙螟幼蟲對兩種線蟲的侵入率影響較大(圖2)，隨著寄主溫度的降低，2種線蟲的侵入率呈升高趨勢。25 ℃、20 ℃和15 ℃處理幼蟲7d后，S.carpocapsae對寄主的侵入率分別為26.0%，36.3%和36.0%，差異不顯著，但均顯著低于10 ℃處理(49.3%)(P<0.05)。20 ℃和25 ℃處理7 d后S.feltiae對寄主的侵入率為20%和24%，均顯著低于10 ℃(39.7%)和15 ℃處理(32.3%)(P<0.05)。表明隨著寄主昆蟲馴化溫度的降低，其對昆蟲病原線蟲侵入的抵抗力降低，導致線蟲更容易侵入體內(nèi)，侵入體內(nèi)線蟲的數(shù)量增加。

圖1昆蟲病原線蟲對低溫馴化寄主的致病力
Fig.1ThevirulenceofEPNstonavelorangewormacclimatedatdifferenttemperatures

注：柱狀圖上方的相同字母表示同一種線蟲對10、15、20、25℃馴化寄主之間的致死率差異不顯著。

Note:The same letters on the top of bar chart indicate similar mortality ofS.carpocapsaeorS.feltiaeto acclimated hosts at 10、15、20、25 ℃ for 7 d.

圖2昆蟲病原線蟲對低溫馴化寄主的侵入力
Fig.2ThepenetrationofEPNstonavelorangewormacclimatedatdifferenttemperatures

2.3 低溫馴化寄主對線蟲繁殖速度的影響

線蟲侵染后8d調(diào)查結(jié)果顯示(圖3)，不同溫度處理5齡臍橙螟幼蟲對線蟲侵染后從寄主體表出現(xiàn)的寄主比例影響很大，該比例為體表有線蟲出現(xiàn)的寄主數(shù)量占總寄主數(shù)量的比例。隨著處理溫度的降低，2種線蟲從體表出現(xiàn)的寄主比率呈升高的趨勢，尤其線蟲S.feltiae的升高趨勢更明顯。25 ℃、20 ℃和15 ℃處理7 d后有S.feltiae出現(xiàn)的寄主比率分別為43.3%、53.3%和66.7%，均顯著低于10 ℃處理(93.3%)(P<0.05)，即隨著寄主昆蟲馴化溫度的降低，線蟲侵入后在寄主昆蟲體內(nèi)繁殖的速度加快，寄主體表有線蟲出現(xiàn)的比例增多。因為同一種線蟲在寄主體內(nèi)繁殖的代數(shù)是相同的，只有線蟲在寄主體內(nèi)繁殖速度快把寄主體內(nèi)物質(zhì)消耗完才能從寄主體內(nèi)鉆出到體表，所以體表有線蟲出現(xiàn)的寄主比例越大意味著其體內(nèi)線蟲繁殖速度越快。

2.4 低溫馴化寄主對線蟲產(chǎn)量的影響

低溫馴化5齡臍橙螟幼蟲對線蟲S.carpocapsae和S.feltiae產(chǎn)量影響較大(圖4)。S.carpocapsae在15 ℃和10 ℃馴化7 d幼蟲體內(nèi)的產(chǎn)量為9 462和11 309條侵染期線蟲(IJs)/頭幼蟲，顯著高于25 ℃和20 ℃處理的產(chǎn)量(6 318和6 411 IJs /頭幼蟲)(P<0.05)，10 ℃馴化寄主后的產(chǎn)量較25 ℃高出79%。S.feltiae線蟲在10 ℃馴化7 d臍橙螟幼蟲體內(nèi)繁殖的產(chǎn)量是2 286 IJs/頭幼蟲，顯著高于其它3個處理溫度，15 ℃、20 ℃和25 ℃處理的產(chǎn)量分別為1 804、1 353和987 IJs/頭幼蟲，處理之間差異顯著(P<0.05)，其中，10 ℃較25 ℃的線蟲產(chǎn)量高出131.7%。表明低溫馴化寄主昆蟲有助于提高昆蟲病原線蟲的繁殖產(chǎn)量。

圖3低溫馴化寄主對昆蟲病原線蟲從寄主體表出現(xiàn)的影響
Fig.3TheemergenceofEPNsinfectingnavelorangewormacclimatedatdifferenttemperatures

圖4低溫馴化寄主對昆蟲病原線蟲產(chǎn)量的影響
Fig.4TheyieldofEPNsinfectingnavelorangewormacclimatedatdifferenttemperatures

2.5 經(jīng)低溫馴化寄主體內(nèi)繁殖出線蟲的冷凍存活能力

從不同溫度馴化的寄主臍橙螟5齡幼蟲體內(nèi)繁殖出的線蟲直接投入-15 ℃冰箱中20 min后的冷凍存活率來看，隨著寄主幼蟲馴化溫度的降低，2種線蟲的冷凍存活率均有上升趨勢(圖5)。經(jīng)10 ℃馴化7 d的臍橙螟5齡幼蟲體內(nèi)繁殖的線蟲S.carpocapsae收獲后于10 ℃儲存10 d和24 d的冷凍存活率分別為84.2%和90.5%，顯著高于25 ℃馴化7 d的處理(72.5%和80.6%)(P<0.05)。經(jīng)10 ℃馴化7 d幼蟲體內(nèi)繁殖的線蟲S.feltiae收獲后10 d和24 d的冷凍存活率為95.5%和92.8%，也顯著高于25 ℃處理(83.8%和83.1%)(P<0.05)。即2種線蟲經(jīng)過低溫馴化的寄主體內(nèi)繁殖后其冷凍存活能力增強。

圖5 昆蟲病原線蟲經(jīng)低溫馴化寄主體內(nèi)繁殖后的冷凍存活率Fig.5 The frozen survival of EPNs reproduced by navel orangeworm acclimated at different temperatures

3 討 論

快速冷馴化是物種對不利環(huán)境的一種迅速適應的表現(xiàn)。有研究報道，西花薊馬的若蟲經(jīng)快速冷馴化后，其耐寒性得到顯著增強[16]。Zheng等研究結(jié)果顯示，經(jīng)歷非致命的低溫馴化有利于提高昆蟲對低溫脅迫的抗性[17]。黑腹果蠅(Drosophilamelanogaster)蛹后期至成蟲期經(jīng)過11 ℃的長時冷馴化，其耐寒性均顯著提高[18]。生活在不同地理緯度的同種昆蟲病原線蟲以不同的低溫馴化方式可以提高其耐寒能力[19]。目前還未見經(jīng)低溫馴化的寄主對其寄生線蟲生物學特性的影響進行報道。市場上大多數(shù)制劑產(chǎn)品中昆蟲病原線蟲都不耐低溫，雖然低溫下線蟲侵染力較差，但經(jīng)歷低溫后的昆蟲，如經(jīng)過晝夜溫差或季節(jié)溫差后的昆蟲對病原線蟲侵染力、繁殖力和低溫存活力有提高作用，對昆蟲病原線蟲可持續(xù)防治害蟲有著重要意義。

本研究借助低溫馴化的寄主昆蟲(5齡臍橙螟幼蟲)提高了S.feltiae對其致病力，2種昆蟲病原線蟲的侵染力、繁殖速度、產(chǎn)量和冷凍存活力，并且相對較耐低溫的線蟲S.feltiae生物學特性比S.carpocapsae更受低溫馴化寄主昆蟲的影響。所以該研究結(jié)果在昆蟲病原線蟲多個生物學特性指標對低溫馴化寄主的反應方面屬于首次報道。有學者總結(jié)了昆蟲的冷馴化作用機制，如組織和細胞水平的特異性，低分子量抗凍保護劑的產(chǎn)生，熱休克蛋白的表達及功能，以及阻止細胞程序性死亡的潛在機理等[20]。昆蟲病原線蟲經(jīng)低溫馴化過程體內(nèi)生化物質(zhì)(海藻糖和丙三醇等)的積累及變化利于線蟲的冷凍存活[21-23]，但關于在低溫馴化寄主昆蟲體內(nèi)繁殖后的昆蟲病原線蟲的生化物質(zhì)積累是否有變化還有待于進一步研究。同時，昆蟲的冷馴化作用機制對其寄生線蟲又有怎樣的影響還是未知。另外，不同種寄主昆蟲經(jīng)相同的低溫馴化方式對同一昆蟲病原線蟲生物學特性的影響情況還不清楚，通過低溫馴化寄主昆蟲使昆蟲病原線蟲提高的耐寒性可維持多久及其機制需要深入研究。

4 結(jié) 論

線蟲S.feltiae對10 ℃馴化7 d的5齡臍橙螟幼蟲的致病力明顯增強，S.feltiae和S.carpocapsae對10 ℃馴化7 d的的臍橙螟幼蟲侵入力增強，且線蟲S.feltiae在低溫馴化寄主體內(nèi)的繁殖速度加快。2種線蟲在經(jīng)低溫馴化的昆蟲體內(nèi)繁殖后的產(chǎn)量均受寄主馴化溫度影響，隨馴化溫度的降低線蟲S.carpocapsae和S.feltiae產(chǎn)量呈明顯上升趨勢。經(jīng)10 ℃馴化的寄主昆蟲體內(nèi)繁殖的2種線蟲的冷凍存活率升高。10 ℃馴化7 d的5齡臍橙螟幼蟲有助于提高S.feltiae線蟲的致病力、侵入力、繁殖速度和產(chǎn)量及其冷凍存活力，提高程度較S.carpocapsae更明顯。