張榕蓉， 王雅慧， 李 彤， 丁 旭， 徐志勝， 熊愛生

(南京農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝學(xué)院 作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華東地區(qū)園藝作物生物學(xué)與種質(zhì)創(chuàng)新重點實驗室， 江蘇 南京 210095)

胡蘿卜(Daucuscarotavar.sativaHoffm.)為二年生草本植物，是全球十大蔬菜作物之一，栽培面積廣闊[1]。胡蘿卜的肉質(zhì)根為其主要食用部位，含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和類胡蘿卜素等營養(yǎng)成分[2]。植物激素可直接或間接調(diào)控胡蘿卜的生長發(fā)育過程，如物質(zhì)積累、結(jié)構(gòu)變化和基因調(diào)控等[3]。植物生長調(diào)節(jié)劑是一類人工合成的化合物，具有與天然植物激素相同的功能[4]，可通過調(diào)節(jié)植物的新陳代謝調(diào)控其生殖和生長[5]。已有研究結(jié)果表明：植物生長調(diào)節(jié)劑在胡蘿卜生長發(fā)育過程中具有重要的調(diào)控作用[6-7]，因此，研究不同植物生長調(diào)節(jié)劑對胡蘿卜生長發(fā)育的影響及探明胡蘿卜對植物生長調(diào)節(jié)劑的分子響應(yīng)機制具有重要的科學(xué)意義。

WRKY轉(zhuǎn)錄因子是一類主要存在于植物體內(nèi)的鋅指型轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，除具有高度保守的WRKYGQK基序，通常還具有C2H2(Cx4-5Cx22-23HxH)型或C2HC(Cx7Cx23HxC)型鋅指結(jié)構(gòu)[8]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子可與啟動子中的W-box〔(T)TGACC(A/T)〕特異性結(jié)合，從而調(diào)控靶基因的表達(dá)，參與各種信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[9]。Eulgem等[10]根據(jù)WRKY結(jié)構(gòu)域數(shù)量和鋅指結(jié)構(gòu)類型將WRKY轉(zhuǎn)錄因子分成Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ類，其中，Ⅰ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有2個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2型；Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2型；Ⅲ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2HC型。迄今為止，研究者已在擬南芥〔Arabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.〕[8]、紅薯〔Ipomoeabatatas(Linn.) Lam.〕[11]、水稻(OryzasativaLinn.)[12]、玉米(ZeamaysLinn.)[13]、大豆〔Glycinemax(Linn.) Merr.〕[14]和胡蘿卜[15]等植物中發(fā)現(xiàn)WRKY轉(zhuǎn)錄因子，該轉(zhuǎn)錄因子參與調(diào)控植物對多種生物和非生物脅迫的響應(yīng)[16-17]，主要參與調(diào)控脫落酸(ABA)、水楊酸(SA)和茉莉酸甲酯(MeJA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑[18]，進而調(diào)控植物的生長發(fā)育、物質(zhì)代謝及抗病和抗逆過程，并通過參與赤霉素(GA)信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑調(diào)控植物的衰老進程[19]。研究胡蘿卜WRKY轉(zhuǎn)錄因子有助于深入了解胡蘿卜對不同植物生長調(diào)節(jié)劑的分子響應(yīng)機制。

為了深入開展胡蘿卜WRKY轉(zhuǎn)錄因子相關(guān)研究，作者以胡蘿卜品種‘黑田五寸’(‘Heitian Wucun’)為研究對象，根據(jù)GenBank中的DcWRKY69基因序列設(shè)計引物，采用RT-PCR技術(shù)從其葉片cDNA中克隆獲得DcWRKY69基因片段，對該基因及其編碼的氨基酸序列進行生物信息學(xué)分析；同時，采用RT-qPCR技術(shù)對不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理下葉中DcWRKY69基因表達(dá)水平的差異進行了比較，為進一步開展胡蘿卜WRKY轉(zhuǎn)錄因子對植物生長調(diào)節(jié)劑的分子響應(yīng)機制研究提供基礎(chǔ)資料。

1 材料和方法

1.1 材料

實驗使用的胡蘿卜品種‘黑田五寸’種子由南京農(nóng)業(yè)大學(xué)作物遺傳與種質(zhì)創(chuàng)新國家重點實驗室傘形科蔬菜課題組提供。于2018年9月在人工氣候室內(nèi)進行播種，并在晝溫25 ℃、夜溫18 ℃、光照時間16 h·d-1及光照強度300 μmol·m-2·s-1的條件下進行培養(yǎng)。

1.2 方法

1.2.1 總RNA提取及cDNA第1鏈合成 待幼苗萌出60 d后，選取長勢良好且無病蟲害的完整葉片，將采集的葉片混勻后置于-80 ℃冰箱中保存、備用，采集葉片的總質(zhì)量約10 g。采用植物總RNA提取試劑盒〔天根生化科技(北京)有限公司〕提取葉片的總RNA，使用One-Drop OD-1000+超微量核酸分析儀(南京五義科技有限公司)檢測提取的總RNA樣品溶液的濃度，并采用HiScript Ⅱ Q RT SuperMix for qPCR(+gDNA wiper)試劑盒(南京諾唯贊生物科技有限公司)對提取的總RNA樣品進行反轉(zhuǎn)錄，合成cDNA第1鏈。

1.2.2 基因克隆 基于Xu等[20]獲得的胡蘿卜轉(zhuǎn)錄組和基因組數(shù)據(jù)庫檢索獲得DcWRKY69基因序列(GenBank登錄號為XM_017382173.1)，根據(jù)檢索到的DcWRKY69基因序列設(shè)計1對特異的克隆引物，正向引物DcWRKY69-F1的序列為5′-T-C-T-C-T-C-T-A-G-CC-A-G-C-C-A-A-T-A-G-C-3′，反向引物DcWRKY69-R1的序列為5′-C-A-A-C-A-A-A-A-A-G-C-A-G-T-T-T-T-A-T-T-T-3′。以cDNA第1鏈為模板進行PCR擴增反應(yīng)，擴增體系總體積30.0 μL，包括PrimerStar Max Premix (2×)高保真酶(含Mg2+和dNTPs)〔寶生物工程(大連)有限公司〕15.0 μL、100 ng·μL-1cDNA第1鏈2.0 μL、10 nmol·mL-1正向引物和反向引物各1.5 μL、ddH2O 10.0 μL。擴增程序為：98 ℃預(yù)變性10 s；98 ℃變性10 s、60 ℃退火10 s、72 ℃延伸30 s，共35個循環(huán)；72 ℃延伸10 s。取5 μL擴增產(chǎn)物，用質(zhì)量體積分?jǐn)?shù)1.2%的瓊脂糖凝膠進行電泳檢測，確定得到目標(biāo)基因片段后，將剩余的25 μL擴增產(chǎn)物交由滁州通用生物系統(tǒng)有限公司進行測序。

1.2.3 序列分析 在NCBI網(wǎng)站(http：∥blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)上對獲得的目的基因片段的核苷酸和氨基酸序列進行BLAST比較和保守域預(yù)測；采用DNAMAN 6.0軟件進行不同植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列同源性比對和親水性/疏水性分析；使用MEGA 7.0軟件構(gòu)建系統(tǒng)進化樹并生成圖形報告；運用BioXM 2.6軟件及SMS序列處理在線工具包(http：∥www.bio-soft.net/sms/)分析不同植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸組成及理化性質(zhì)；使用TMHMM Server v. 2.0軟件(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)預(yù)測分析DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的跨膜結(jié)構(gòu)；使用SignalP 4.1 Server軟件(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/SignalP-4.1/)預(yù)測分析DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的信號肽區(qū)域；使用NetPhos 3.1 Server軟件(http：∥www.cbs.dtu.dk/services/ NetPhos/)預(yù)測分析DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化位點；在SOPMA網(wǎng)站(https：∥npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/ npsa_automat.pl?page=/NPSA/npsa_sopma.html)上預(yù)測分析DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)。

1.2.4 植物生長調(diào)節(jié)劑處理方法及基因表達(dá)分析

分別配制0.1 mmol·L-1茉莉酸甲脂(MeJA)[21]、1.0 mmol·L-1水楊酸(SA)[22]、0.1 mmol·L-1赤霉素(GA3)[23]和0.1 mmol·L-1脫落酸(ABA)[24]，并向上述溶液中添加表面活性劑(體積分?jǐn)?shù)0.1% Tween-20)；待幼苗萌出60 d后，選取長勢良好的植株，分別將植物生長調(diào)節(jié)劑溶液充分噴灑在植株的全部葉面上，每組設(shè)置3個生物學(xué)重復(fù)，每個重復(fù)8株。以處理0 h為對照(CK)，在處理1、2、4、8和12 h選取植株上長勢良好且無病蟲害的完整葉片，將采集的同組植株葉片混勻后置于-80 ℃冰箱中保存、備用，每個時間點采集的各組葉片的總質(zhì)量約10 g。

按照上述方法提取總RNA并合成cDNA第1鏈。使用Primer Premier 6.0軟件設(shè)計1對熒光定量檢測引物，正向引物DcWRKY69-F2的序列為5′-G-G-A-A-G-A-A-G-A-G-C-A-G-G-A-A-G-A-A-G-A-A-G-3′，反向引物DcWRKY69-R2的序列為 5′-A-G-C-C-A-C-T-C-A-A-C-G-G-A-GA-A-T-G-T-A-3′。以胡蘿卜Actin基因為內(nèi)參基因[25]，該基因正向引物Actin-F的序列為5′-C-G-G-T-A-T-T-G-TG-T-T-G-G-A-C-T-C-T-G-G-T-G-A-T-3′，反向引物Actin-R的序列為5′-C-A-G-C-A-A-G-G-T-C-A-A-G-A-C-G-G-A-G-T-A-T-G-G-3′。使用HieffTMqPCR? SYBR Green Master Mix(No Rox Plus)(上海翊圣生物科技有限公司)進行RT-qPCR反應(yīng)，擴增體系總體積20.0 μL，包括HieffTMqPCR? SYBR Green Master Mix(No Rox Plus)(含Mg2+和dNTPs) 10.0 μL、100 ng·μL-1cDNA第1鏈2.0 μL、10 nmol·mL-1正向引物和反向引物各0.4 μL、ddH2O 7.2 μL。擴增程序為：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性10 s、60 ℃退火30 s，共40個循環(huán)。在65 ℃逐步升溫至95 ℃的過程中連續(xù)測量熒光，繪制熔解曲線。采用2-ΔΔCT法[26]計算DcWRKY69基因的相對表達(dá)量，并使用SPSS 20.0和EXCEL 2019軟件進行差異顯著性分析。

2 結(jié)果和分析

2.1 DcWRKY69基因的克隆

以胡蘿卜葉片cDNA第1鏈為模板，使用特異引物DcWRKY69-F1和DcWRKY69-R1擴增得到1條長度約750 bp的目的片段。測序及序列分析結(jié)果(圖1)表明：實驗獲得的DcWRKY69基因片段包含1個長度為783 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼260個氨基酸。

2.2 DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列分析

2.2.1 保守域預(yù)測 對胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(DcWRKY69)氨基酸序列的保守域預(yù)測結(jié)果(圖2)表明：DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列在第52至第110位含有1個保守的WRKY結(jié)構(gòu)域，據(jù)此認(rèn)為該轉(zhuǎn)錄因子屬于WRKY超級家族。

*： 終止密碼子 Stop codon.圖1 胡蘿卜WRKY69基因(DcWRKY69)的測序及序列分析結(jié)果Fig. 1 Sequencing and sequence analysis results of WRKY69 gene in Daucus carota var. sativa Hoffm. (DcWRKY69)

圖2 胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(DcWRKY69)的保守域預(yù)測Fig. 2 Prediction of conserved domain of WRKY69 transcription factor in Daucus carota var. sativa Hoffm. (DcWRKY69)

2.2.2 同源性比對分析 將DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子與NCBI數(shù)據(jù)庫中西洋參(PanaxquiquefoliumLinn.)、橡膠樹〔Heveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.〕、木薯(ManihotesculentaCrantz.)、胡桃(JuglansregiaLinn.)、桃〔Prunuspersica(Linn.) Batsch〕、甜櫻桃(P.aviumLinn.)、黃胡蘿卜〔Daucuscarotasubsp.sativus(Hoffm.) Arcang.〕、擬南芥和蕪菁(BrassicarapaLinn.)9種植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列進行同源性比對。結(jié)果(圖3)表明：DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子與這9種植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列相似性較高，說明WRKY轉(zhuǎn)錄因子具有高度的保守性。DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)類型屬于C2H2型，據(jù)此判斷該轉(zhuǎn)錄因子屬于Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子。

2.2.3 系統(tǒng)進化樹分析 利用DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子與其他9種植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進化樹。結(jié)果(圖4)表明：這10種植物的WRKY轉(zhuǎn)錄因子被分成2個分支，其中，十字花科(Brassicaceae)植物擬南芥的WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(AtWRKY69)與同科植物蕪菁的WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(BrWRKY69)聚為一個分支，其余8種植物的WRKY轉(zhuǎn)錄因子聚為另一個分支?？傮w來看，同科植物的WRKY轉(zhuǎn)錄因子間親緣關(guān)系較近，但DcWRKY69與同科植物黃胡蘿卜WRKY65轉(zhuǎn)錄因子(DcWRKY65)的親緣關(guān)系并非最近。

DcWRKY69： 胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Daucus carota var. sativa Hoffm.； PqWRKY4： 西洋參WRKY4轉(zhuǎn)錄因子 WRKY4 transcription factor in Panax quiquefolium Linn.； HbWRKY69： 橡膠樹WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.； MeWRKY35： 木薯WRKY35轉(zhuǎn)錄因子 WRKY35 transcription factor in Manihot esculenta Crantz.； JrWRKY69： 胡桃WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Juglans regia Linn.； PpWRKY69： 桃WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Prunus persica (Linn.) Batsch； PaWRKY69： 甜櫻桃WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Prunus avium Linn.； DcsWRKY65： 黃胡蘿卜WRKY65轉(zhuǎn)錄因子 WRKY65 transcription factor in Daucus carota subsp. sativus (Hoffm.) Arcang.； AtWRKY69： 擬南芥WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.； BrWRKY69： 蕪菁WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Brassica rapa Linn. 方框示W(wǎng)RKY結(jié)構(gòu)域 The box indicates WRKY domain； ▲： 鋅指結(jié)構(gòu) Zinc finger structure.圖3 胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(DcWRKY69)與其他9種植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列同源性比對結(jié)果Fig. 3 Homology comparison result of amino acid sequences of WRKY69 transcription factor in Daucus carota var. sativa Hoffm. (DcWRKY69) and WRKY transcription factors in other 9 species

HbWRKY69： 橡膠樹WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Hevea brasiliensis (Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.； MeWRKY35： 木薯WRKY35轉(zhuǎn)錄因子 WRKY35 transcription factor in Manihot esculenta Crantz.； JrWRKY69： 胡桃WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Juglans regia Linn.； DcWRKY69： 胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Daucus carota var. sativa Hoffm.； PpWRKY69： 桃WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Prunus persica (Linn.) Batsch； PaWRKY69： 甜櫻桃WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Prunus avium Linn.； PqWRKY4： 西洋參WRKY4轉(zhuǎn)錄因子 WRKY4 transcription factor in Panax quiquefolium Linn.； DcsWRKY65： 黃胡蘿卜WRKY65轉(zhuǎn)錄因子 WRKY65 transcription factor in Daucus carota subsp. sativus (Hoffm.) Arcang.； AtWRKY69： 擬南芥WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Arabidopsis thaliana (Linn.) Heynh.； BrWRKY69： 蕪菁WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor in Brassica rapa Linn.圖4 胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(DcWRKY69)與其他9種植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的系統(tǒng)進化樹Fig. 4 Phylogenetic tree of WRKY69 transcription factor in Daucus carota var. sativa Hoffm. (DcWRKY69) and WRKY transcription factors in other 9 species

2.2.4 氨基酸組成及理化性質(zhì)分析 不同植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸組成及理化性質(zhì)的分析結(jié)果(表1)表明：DcWRKY69及其他9種植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸數(shù)量為247～296；理論相對分子質(zhì)量差異較小，為28 560～32 470；理論等電點為pI 4.53至pI 6.51。在氨基酸組成方面，酸性氨基酸的比例最高，為21%～31%；堿性氨基酸和脂肪族氨基酸的比例接近，分別為14%～17%和13%～17%；芳香族氨基酸的比例最低，為6%～9%?？傮w來看，不同植物間WRKY轉(zhuǎn)錄因子的各類氨基酸比例差異較小。

由表1還可見：DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的理論相對分子質(zhì)量為30 030，理論等電點為pI 4.78，酸性氨基酸比例最高(27%)，堿性和脂肪族氨基酸比例次之(分別為17%和15%)，芳香族氨基酸比例最低(9%)。

2.2.5 親水性和疏水性分析 DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列的親水性和疏水性分析結(jié)果(圖5)表明：在親水性區(qū)域，第123、第125和第126位的谷氨酸(Glu)及第124位的賴氨酸(Lys)的親水性最強，第142位的天冬氨酸(Asp)和第143位的精氨酸(Arg)的親水性較強；在疏水性區(qū)域，第99位的亮氨酸(Leu)的疏水性最強，第101和第257位的異亮氨酸(Ile)的疏水性較強?？傮w來看，DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子氨基酸序列中的大部分氨基酸為親水性氨基酸，據(jù)此推測DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子屬于親水性蛋白。

表1 不同植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸組成及理化性質(zhì)分析1)

Table 1 Analyses on amino acid composition and physicochemical property of WRKY transcription factors in different species1)

轉(zhuǎn)錄因子Transcription factor登錄號Accession No.氨基酸數(shù)量Number of amino acid理論相對分子質(zhì)量Theoretical relative molecular mass理論等電點Theoretical isoelectric point(pI)比例/% Percentage堿性氨基酸Basic amino acid酸性氨基酸Acidic amino acid芳香族氨基酸Aromatic amino acid脂肪族氨基酸Aliphatic amino acidDcWRKY69XM_017382173.126030 0304.781727915PqWRKY4AEQ29017.127131 2804.531531814HbWRKY69AFX83949.125929 4004.801427714MeWRKY35XP_021611426.126129 6205.081526813JrWRKY69XP_018822131.125929 6906.511725717PpWRKY69XP_007201365.125829 3005.251624716PaWRKY69XP_021805196.128032 1704.851628615DcsWRKY65XP_017250159.124728 5604.671630815AtWRKY69OAP01678.127830 9304.961622814BrWRKY69AHB33864.129632 4704.821521813

1)DcWRKY69： 胡蘿卜WRKY69蛋白 WRKY69 protein inDaucuscarotavar.sativaHoffm.； PqWRKY4： 西洋參WRKY4蛋白 WRKY4 protein inPanaxquiquefoliumLinn.； HbWRKY69： 橡膠樹WRKY69蛋白 WRKY69 protein inHeveabrasiliensis(Willd. ex A. Juss.) Muell. Arg.； MeWRKY35： 木薯WRKY35蛋白 WRKY35 protein inManihotesculentaCrantz.； JrWRKY69： 胡桃WRKY69蛋白 WRKY69 protein inJuglansregiaLinn.； PpWRKY69： 桃WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor inPrunuspersica(Linn.) Batsch； PaWRKY69： 甜櫻桃WRKY69轉(zhuǎn)錄因子 WRKY69 transcription factor inPrunusaviumLinn.； DcsWRKY65： 黃胡蘿卜WRKY65蛋白 WRKY65 protein inDaucuscarotasubsp.sativus(Hoffm.) Arcang.； AtWRKY69： 擬南芥WRKY69蛋白 WRKY69 protein inArabidopsisthaliana(Linn.) Heynh.； BrWRKY69： 蕪菁WRKY69蛋白 WRKY69 protein inBrassicarapaLinn.

圖5 胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(DcWRKY69)氨基酸序列的親水性和疏水性分析Fig. 5 Analyses on hydrophilicity and hydrophobicity of amino acid sequence of WRKY69 transcription factor in Daucus carota var. sativa Hoffm. (DcWRKY69)

2.3 DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的預(yù)測分析

2.3.1 信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(DcWRKY69)的信號肽及跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果表明：DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列不存在信號肽(圖6)和跨膜結(jié)構(gòu)(圖7)。由于構(gòu)成蛋白質(zhì)跨膜結(jié)構(gòu)的氨基酸大部分為疏水性氨基酸，因此，該預(yù)測結(jié)果也說明DcWRKY轉(zhuǎn)錄因子屬于親水性蛋白。

2.3.2 磷酸化位點預(yù)測分析 DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的磷酸化位點預(yù)測結(jié)果(圖8)表明：DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的氨基酸序列中共有34個磷酸化位點，包括23個絲氨酸磷酸化位點、9個蘇氨酸磷酸化位點和2個酪氨酸磷酸化位點。

2.3.3 二級結(jié)構(gòu)預(yù)測分析 DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(圖9)表明：DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子的二級結(jié)構(gòu)由α-螺旋(α-helix)、β-折疊(β-sheet)、延伸鏈(extended strand)和隨機卷曲(random coil)組成，比例分別為21.92%、4.23%、11.92%和61.92%。

： C分值C-score； ： S分值S-score； ： Y分值Y-score.圖6 胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(DcWRKY69)的信號肽預(yù)測結(jié)果Fig. 6 Prediction result of signal peptide of WRKY69 transcription factor in Daucus carota var. sativa Hoffm. (DcWRKY69)

： 膜內(nèi)Inside； ： 膜外Outside.圖7 胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(DcWRKY69)的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig. 7 Prediction result of transmembrane structure of WRKY69 transcription factor in Daucus carota var. sativa Hoffm. (DcWRKY69)

： 絲氨酸Serine； ： 蘇氨酸Threonine； ： 酪氨酸Tyrosine； ： 閾值Threshold.圖8 胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(DcWRKY69)的磷酸化位點預(yù)測結(jié)果Fig. 8 Prediction result of phosphorylation site of WRKY69 transcription factor in Daucus carota var. sativa Hoffm. (DcWRKY69)

2.4 不同植物生長調(diào)節(jié)劑對DcWRKY69基因表達(dá)的影響

分別對0.1 mmol·L-1茉莉酸甲酯(MeJA)、1.0 mmol·L-1水楊酸(SA)、0.1 mmol·L-1赤霉素(GA3)和0.1 mmol·L-1脫落酸(ABA)處理0、1、2、4、8和12 h后胡蘿卜WRKY69基因(DcWRKY69)在其葉中的相對表達(dá)量進行比較，結(jié)果見圖10。由圖10可見：4種植物生長調(diào)節(jié)劑均能影響DcWRKY69基因的表達(dá)，但該基因相對表達(dá)量的變化存在明顯差異。在MeJA處理下，DcWRKY69基因的相對表達(dá)量在處理1～4 h顯著低于對照(處理0 h)；在處理8 h顯著高于對照，為對照的3.03倍；在處理12 h恢復(fù)至對照水平。在SA處理下，DcWRKY69基因的相對表達(dá)量在處理1、4和8 h顯著低于對照；在處理2 h與對照水平相近；在處理12 h顯著高于對照，為對照的2.53倍。在GA3處理下，DcWRKY69基因的相對表達(dá)量在處理1、2和4 h顯著高于對照，并在處理1 h達(dá)到峰值，為對照的2.47倍；在處理8 h顯著低于對照；在處理12 h略高于對照。在ABA處理下，DcWRKY69基因的相對表達(dá)量在處理1、2和4 h顯著高于對照，并在處理4 h達(dá)到峰值，為對照的5.76倍；在處理8 h與對照水平相近；在處理12 h很低，基本檢測不到。

： α-螺旋α-helix； ： β-折疊β-sheet； ： 延伸鏈Extended strand； ： 隨機卷曲Random coil.圖9 胡蘿卜WRKY69轉(zhuǎn)錄因子(DcWRKY69)的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果Fig. 9 Prediction result of secondary structure of WRKY69 transcription factor in Daucus carota var. sativa Hoffm. (DcWRKY69)

不同小寫字母表示在0.05水平差異顯著 Different lowercases indicate the significant difference at 0.05 level.A： 0.1 mmol·L-1茉莉酸甲酯 0.1 mmol·L-1 methyl jasmonate； B： 1.0 mmol·L-1水楊酸 1.0 mmol·L-1 salicylic acid； C： 0.1 mmol·L-1赤霉素 0.1 mmol·L-1 gibberellin； D： 0.1 mmol·L-1脫落酸 0.1 mmol·L-1 abscisic acid.圖10 不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理下胡蘿卜WRKY69基因(DcWRKY69)在其葉中相對表達(dá)量的比較Fig. 10 Comparison on relative expression level of DcWRKY69 gene in Daucus carota var. sativa Hoffm. (DcWRKY69) in its leaf under different plant growth regulator treatments

3 討論和結(jié)論

胡蘿卜是重要的根菜類蔬菜，合理使用植物生長調(diào)節(jié)劑可調(diào)控其食用部位的品質(zhì)[27]。WRKY轉(zhuǎn)錄因子在植物各種激素信號傳遞途徑中扮演重要角色，例如：NPR1是水楊酸(SA)信號傳遞途徑中最重要的蛋白之一，NPR1可直接調(diào)控擬南芥體內(nèi)至少8個WRKY轉(zhuǎn)錄因子的表達(dá)[28]；WRKY轉(zhuǎn)錄因子的多數(shù)靶基因(如ABF2、ABI5、DREB1α等)與脫落酸(ABA)信號通路相關(guān)[29]；OsWRKY51和OsWRKY71基因通過調(diào)控糊粉層細(xì)胞內(nèi)ABA和赤霉素(GA)信號傳遞途徑間接調(diào)控水稻種子的萌發(fā)和休眠[30]；PtrWRKY89基因在楊屬(PopulusLinn.)植物SA防御信號通路中發(fā)揮作用[31]。本研究獲得的DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子含有1個WRKY結(jié)構(gòu)域，其鋅指結(jié)構(gòu)類型為C2H2型，屬于Ⅱ類WRKY轉(zhuǎn)錄因子，并且，WRKY轉(zhuǎn)錄因子在進化過程中高度保守。

蛋白質(zhì)磷酸化是蛋白質(zhì)翻譯后的一種重要修飾方式，在調(diào)節(jié)生命活動中起到“分子開關(guān)”的作用[32]；信號肽是由10～40個氨基酸殘基組成的短肽鏈，可以將蛋白質(zhì)引導(dǎo)到細(xì)胞中具有不同膜結(jié)構(gòu)的亞細(xì)胞器內(nèi)[33]。預(yù)測結(jié)果表明：DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子共有34個磷酸化位點，這些磷酸化位點可能在維持蛋白質(zhì)空間穩(wěn)定性和調(diào)控植物生理生化反應(yīng)過程中發(fā)揮重要作用；并且，DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子是不含跨膜結(jié)構(gòu)和信號肽的親水性蛋白，據(jù)此推測DcWRKY69轉(zhuǎn)錄因子可能是非分泌蛋白。

迄今為止，已發(fā)現(xiàn)多種植物WRKY轉(zhuǎn)錄因子對植物生長調(diào)節(jié)劑的響應(yīng)作用[34-36]。本研究結(jié)果表明：在MeJA、SA、GA3和ABA處理0～12 h，胡蘿卜葉中DcWRKY69基因的相對表達(dá)量存在明顯差異，說明DcWRKY69基因表達(dá)對這4種植物生長調(diào)節(jié)劑均有響應(yīng)，但在不同植物生長調(diào)節(jié)劑處理下該基因相對表達(dá)量的響應(yīng)時間和強度存在差異，說明DcWRKY69基因可能參與胡蘿卜對不同植物生長調(diào)節(jié)劑的響應(yīng)過程，但其對不同植物生長調(diào)節(jié)劑的響應(yīng)模式存在差異，具體作用機制有待進一步深入研究。