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        p16異常甲基化聯(lián)合高危人乳頭瘤病毒檢測在早期宮頸癌診斷中的臨床價值

        2019-12-17 03:43:46鮑統(tǒng)惠郭桂蘭李武芬祁璘
        疑難病雜志 2019年12期
        關(guān)鍵詞:失活癌基因甲基化

        鮑統(tǒng)惠,郭桂蘭,李武芬,祁璘

        宮頸癌是臨床上最為常見的婦科惡性腫瘤之一,發(fā)病率極高,僅次于乳腺癌,位居第2位,多見于發(fā)展中國家的中老年女性,但是隨著社會的發(fā)展及人們生活水平的提高,宮頸癌的發(fā)生正趨于年輕化并有明顯上升趨勢[1]。調(diào)查顯示,全球每年大約有48萬女性被確診為宮頸癌,有大約25萬的宮頸癌患者死亡[2]。宮頸癌患者的預(yù)后與其臨床分期存在很大的關(guān)系,在美國,宮頸癌患者從確診以后計(jì)算,5年的病死率大約為30%,如果患者能夠被早期確診,病死率可降低20%[3]。另外由于宮頸癌的發(fā)展是一個長期量變產(chǎn)生質(zhì)變的過程,前期病變也是可以逆轉(zhuǎn)的,所以宮頸癌的早期診斷在降低病死率、提高生存率方面有著重要的意義[4]。目前,臨床上已公認(rèn)高危人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)性感染是宮頸癌癌前病變及進(jìn)一步惡化的關(guān)鍵,但是高危HPV感染并不一定能夠促使形成宮頸癌[5]。有研究顯示,機(jī)體抑癌基因表達(dá)的失活通常是通過相關(guān)基因啟動子區(qū)的異常甲基化引起的,在腫瘤發(fā)展的整個過程中,甲基化是早期發(fā)生的事件,可作為一種新型的腫瘤分子標(biāo)志物[6]。現(xiàn)分析p16異常甲基化聯(lián)合高危HPV檢測在早期宮頸癌診斷中的價值,為其臨床診斷提供參考,報道如下。

        1 資料與方法

        1.1 臨床資料 選擇2018年3月—2019年3月在青海大學(xué)附屬醫(yī)院婦科行門診活檢、子宮全切術(shù)及宮頸環(huán)形電刀切除術(shù)患者100例(病例組)作為研究對象,根據(jù)其宮頸上皮是否存在異性細(xì)胞、細(xì)胞核分裂相、極性及異型細(xì)胞侵犯上皮細(xì)胞的程度分為宮頸癌亞組20例,年齡31~75(45.32±6.27)歲,按照我國2016年FIGO規(guī)定的的臨床分期[7],Ⅰ期3例,Ⅱ期7例,Ⅲ期6例,Ⅳ期4例;高度病變亞組(CINⅡ~Ⅲ期)35例,年齡30~74(44.98±6.17)歲;低度病變亞組45例,年齡31~74(45.20±6.41)歲。另取正常人宮頸組織30例作為健康對照組,年齡31~73(44.53±6.39)歲。4組受試者年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05),具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準(zhǔn),受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

        1.2 選擇標(biāo)準(zhǔn) (1)納入標(biāo)準(zhǔn):①所有患者均為已婚女性,存在完整的宮頸;②均同意行宮頸癌活性病理檢查;③臨床資料完整。(2)排除標(biāo)準(zhǔn):①心肝腎等功能障礙、精神障礙及并發(fā)有其他腫瘤疾病者;②長時間使用激素及免疫制劑者;③已接受生物、化療及放療者;④嚴(yán)重感染及自身免疫病史者;⑤已有顯著的宮頸癌臨床癥狀者;⑥依從性差,中途退出者。

        1.3 觀察指標(biāo)與方法

        1.3.1 p16異常甲基化檢測[8]:提取所有受試者宮頸組織的DNA,之后對其進(jìn)行甲基化處理:①取宮頸組織的DNA 1~2 μg ,加入20 μl生理鹽水,再加入NaOH溶液3 mol/L調(diào)節(jié)濃度至0.3 mol/L,置于37℃條件下15 min;②加入新配濃度為10 mmol/L氫醌溶液調(diào)節(jié)濃度至5 mmol/L,再加入濃度為3.6 mol/L新配置的亞硫酸氫鈉調(diào)整為3.1 mol/L的最終濃度,最后加入礦物油,置于50℃條件下16 h;③再向上述樣品中加入適量3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)濃度至0.3 mol/L,置于37℃條件下15 min;④加入濃度為20 μg/μl糖原1 μl,加入濃度為8 mol/L醋酸氨溶液,調(diào)節(jié)樣品溶度為3 mol/L,按照樣品體積,加入2.5倍量的無水乙醇,-20℃條件下過夜。之后再通過甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)。陽性對照選用Sssl甲基轉(zhuǎn)移酶修飾的胎盤DNA,操作方法嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。亞硫酸氫鹽修飾完全判斷:同一DNA在修飾前后均用非甲基化特異性引物和甲基化特異性引物擴(kuò)增,即如果修飾前無目的條帶發(fā)生擴(kuò)增現(xiàn)象,而修飾后存在目的條帶擴(kuò)增現(xiàn)象,則為修飾完全。相關(guān)引物由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成,見表1。

        表1 MSP引物序列

        注:U為非甲基化特異性內(nèi)側(cè)引物;M為甲基化特異性內(nèi)側(cè)引物

        1.3.2 宮頸組織p16蛋白表達(dá)檢測[9]:采用Western-blot法檢測。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠,將提取處理后的蛋白質(zhì)樣品向樣品孔中點(diǎn)樣30 μg,之后按照電泳操作方法進(jìn)行電泳。再進(jìn)行轉(zhuǎn)膜處理,在裝有蛋白的PVDF膜朝上,加入5%的封閉液,在4℃條件下?lián)u床封閉3 h。之后加入兔抗人p16單克隆抗體(1 ∶1 000,購自Abcam公司),為一抗,在4℃條件下孵育過夜,TBST進(jìn)行洗滌操作,共3次,每次15 min。之后再加入辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG(1 ∶1 000,購于上海信裕生物技術(shù)有限公司),為二抗。在37℃條件下,孵育1 h,TBST進(jìn)行洗滌操作,共3次,每次15 min。將上述經(jīng)過處理的PVDF膜浸入到發(fā)光工作液中,室溫條件下,孵育1 min,瀝干后顯影保存,之后通過Quantity One軟件對電泳條帶光密度值進(jìn)行分析,將內(nèi)參β-actin與目的條帶光密度值進(jìn)行對比,計(jì)算得出p16蛋白表達(dá)的相對量。

        1.3.3 高危HPV病毒載量檢測[10]:通過第二代雜交捕獲試驗(yàn)(HC-Ⅱ人乳頭狀瘤病毒檢測技術(shù))測定。醫(yī)生采集每例患者的宮頸細(xì)胞,做好標(biāo)記;另外,患者自身采用dacron棉簽放入陰道6~7 cm深左右,靜止30 s后,轉(zhuǎn)動棉簽取出即可,放置于做好標(biāo)記的試管中。通過堿性溶液破壞患者體內(nèi)病毒,使DNA雙鏈裂解成單鏈;通過RNA探針可以與病毒單鏈特異性結(jié)合形成雜交復(fù)合物;再通過其特異性抗體將復(fù)合物粘合于微孔壁上;之后雜交復(fù)合物會與堿性磷酸酶的多個抗體相結(jié)合,放大信號;最后,由于底物于堿性磷酸酶結(jié)合會發(fā)光,通過判定其發(fā)光強(qiáng)弱可以判定堿性磷酸酶的含量,從而確定雜交復(fù)合物的含量。陽性判定標(biāo)準(zhǔn):對于上述2組待檢樣品,其中任何1組發(fā)現(xiàn)檢出的雜交復(fù)合物含量≥1.0 pg/ml時即可判定為陽性感染。采用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)反向點(diǎn)雜交法對高危HPV病毒載量進(jìn)行檢測,試劑盒購自深圳亞能生物技術(shù)有限公司,操作方法嚴(yán)格按照說明書執(zhí)行。

        2 結(jié) 果

        2.1 4組高危HPV及p16異常甲基化陽性率比較 高危HPV和p16異常甲基化的陽性率比較,宮頸癌亞組>高度病變亞組>低度病變亞組>健康對照組(P均<0.01),見表2。

        表2 4組受試者高危HPV及p16異常

        2.2 高危HPV病毒載量、p16蛋白表達(dá)量與宮頸病變程度的關(guān)系 隨著宮頸癌病變程度的不斷加重,其HPV病毒載量呈現(xiàn)增加趨勢,兩者呈正相關(guān)(r=0.692,P<0.01)。隨著宮頸癌病變程度的不斷加重,p16蛋白表達(dá)量也逐漸增加,兩者呈正相關(guān)(r=0.554,P<0.01),見表3。

        2.3 3種檢測方法診斷早期宮頸癌的ROC曲線分析 p16異常甲基化、高危HPV及p16異常甲基化+高危HPV的AUC分別為0.62、0.74、0.98;p16異常甲基化+高危HPV的敏感度、特異度、陰性預(yù)測值、陽性預(yù)測值及約登指數(shù)明顯高于單項(xiàng)檢查,見表4、圖1。

        表3 高危HPV病毒載量、p16蛋白表達(dá)量與宮頸病變程度的關(guān)系 [例(%)]

        表4 3種診斷方法對早期宮頸癌的cut-off值、敏感度及特異度

        圖1 p16異常甲基化、高危HPV及聯(lián)合診斷的ROC曲線分析

        3 討 論

        大量研究顯示,許多腫瘤細(xì)胞呈現(xiàn)特定區(qū)域的CpG島高甲基化和整體基因組低甲基化,另外也有研究認(rèn)為抑癌基因失活的主要機(jī)制為啟動子高甲基化[11]。實(shí)際上,腫瘤發(fā)生的本質(zhì)是抑癌基因的失活及癌基因的激活。p16基因主要位于人類第9號染色體短臂上,是一個可直接參與細(xì)胞周期調(diào)控的抑癌基因,與諸多癌癥的發(fā)生關(guān)系密切[12]。CyclinD1能與p16功能蛋白競爭性地結(jié)合CDK4/CDK6,會對pRb蛋白磷酸化產(chǎn)生抑制,促使pRb-E2F復(fù)合物中的E2F難以解離,對細(xì)胞DNA合成和G1期進(jìn)入S期的啟動具有較好的阻止效果,負(fù)反饋調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖周期,另外pRb-E2F復(fù)合物水平的升高也反饋性地對p16的表達(dá)產(chǎn)生抑制[13]。Tong等[14]研究顯示,p16基因失活與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切,p16基因的失活主要包括甲基化、突變及缺失。Stiasny等[15]認(rèn)為諸如垂體瘤、鼻咽癌及肺癌等多種腫瘤發(fā)生主要與p16基因的異常甲基化有關(guān)。本研究正常人和宮頸癌患者p16基因甲基化率分別為0%和45%,也證實(shí)了宮頸癌的發(fā)生與p16基因甲基化有關(guān)。而隨著癌變程度的增加,p16異常甲基化越顯著,提示在宮頸癌發(fā)生之前已有p16基因啟動子發(fā)生了甲基化,并逐漸惡化,有利于對宮頸癌癌變級別進(jìn)行預(yù)測,可作為一種新型的腫瘤分子標(biāo)志物。與Ahmad等[16]的研究結(jié)果相符合。Yildirim等[17]研究顯示,正常宮頸組織中p16蛋白不表達(dá),而在宮頸癌中呈現(xiàn)高表達(dá),且與病變程度呈正相關(guān),與本研究中結(jié)果相符。對此,臨床上有2種解釋[18]:(1)宮頸癌發(fā)生時,Rb基因失活致使功能性pRb蛋白缺失,解除機(jī)體對p16基因的抑制,升高p16蛋白的表達(dá);(2)HPV16癌基因E7可誘導(dǎo)pRb蛋白降解或者失活,可通過pRb與p16之間的負(fù)反饋調(diào)節(jié),誘導(dǎo)p16蛋白高水平表達(dá)。

        宮頸癌患者宿主細(xì)胞中整合的高危HPV基因組,會持續(xù)性地對E6/E7癌基因進(jìn)行表達(dá),進(jìn)而維持癌細(xì)胞的生長[19]。HPV E6/E7主要通過影響細(xì)胞周期中的Rb蛋白和調(diào)節(jié)因子P53發(fā)生致癌機(jī)制。E7與Rb蛋白相結(jié)合,會使pRb-E2F中的轉(zhuǎn)錄因子E2F釋放出來,影響G1/S的啟動,進(jìn)而激活細(xì)胞周期,促使細(xì)胞非控制性增長[20]。E6可與P53蛋白特異性結(jié)合,使其喪失對細(xì)胞的負(fù)生成調(diào)節(jié)功能[21]。本研究結(jié)果顯示,高危HPV病毒載量與宮頸病變程度呈正相關(guān),且各病變程度患者HPV陽性率與Tsakogiannis等[22]研究相符。而經(jīng)過ROC曲線分析聯(lián)合診斷的價值最高,這主要是由于HPV E7和p16基因均作用于以pRb為中心的pRb-E2F通路,而p16在G1~S期增殖過程中起著重要的作用,p16基因的甲基化會促使上述通路無限制進(jìn)行,形成腫瘤[23]。據(jù)研究,人類癌癥細(xì)胞中pRb與p16基因水平呈負(fù)相關(guān),兩者共同參與癌癥通路的抑制,破壞上述兩種的任一基因,均會促使細(xì)胞發(fā)生異常增生,兩者同時缺失會引起選擇性壓力缺乏[24]。隨著研究的不斷深入,發(fā)現(xiàn)單一高危HPV感染通常不會直接引起細(xì)胞發(fā)生癌變。Celewicz等[25]研究發(fā)現(xiàn)不同級別病變的高危HPV陽性宮頸癌亞組中均出現(xiàn)一定程度的p16甲基化,且出現(xiàn)p16甲基化的細(xì)胞大部分病變較為嚴(yán)重,故p16甲基化可能是促使低病變向高病變發(fā)展的誘導(dǎo)因子。

        綜上所述,p16異常甲基化聯(lián)合高危HPV檢測對早期宮頸癌具有較高的診斷價值,值得臨床推廣應(yīng)用。

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