鮑統(tǒng)惠，郭桂蘭，李武芬，祁璘

宮頸癌是臨床上最為常見的婦科惡性腫瘤之一，發(fā)病率極高，僅次于乳腺癌，位居第2位，多見于發(fā)展中國家的中老年女性，但是隨著社會的發(fā)展及人們生活水平的提高，宮頸癌的發(fā)生正趨于年輕化并有明顯上升趨勢[1]。調(diào)查顯示，全球每年大約有48萬女性被確診為宮頸癌，有大約25萬的宮頸癌患者死亡[2]。宮頸癌患者的預后與其臨床分期存在很大的關(guān)系，在美國，宮頸癌患者從確診以后計算，5年的病死率大約為30%，如果患者能夠被早期確診，病死率可降低20%[3]。另外由于宮頸癌的發(fā)展是一個長期量變產(chǎn)生質(zhì)變的過程，前期病變也是可以逆轉(zhuǎn)的，所以宮頸癌的早期診斷在降低病死率、提高生存率方面有著重要的意義[4]。目前，臨床上已公認高危人乳頭瘤病毒(HPV)的持續(xù)性感染是宮頸癌癌前病變及進一步惡化的關(guān)鍵，但是高危HPV感染并不一定能夠促使形成宮頸癌[5]。有研究顯示，機體抑癌基因表達的失活通常是通過相關(guān)基因啟動子區(qū)的異常甲基化引起的，在腫瘤發(fā)展的整個過程中，甲基化是早期發(fā)生的事件，可作為一種新型的腫瘤分子標志物[6]?，F(xiàn)分析p16異常甲基化聯(lián)合高危HPV檢測在早期宮頸癌診斷中的價值，為其臨床診斷提供參考，報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2018年3月—2019年3月在青海大學附屬醫(yī)院婦科行門診活檢、子宮全切術(shù)及宮頸環(huán)形電刀切除術(shù)患者100例(病例組)作為研究對象，根據(jù)其宮頸上皮是否存在異性細胞、細胞核分裂相、極性及異型細胞侵犯上皮細胞的程度分為宮頸癌亞組20例，年齡31～75(45.32±6.27)歲，按照我國2016年FIGO規(guī)定的的臨床分期[7]，Ⅰ期3例，Ⅱ期7例，Ⅲ期6例，Ⅳ期4例；高度病變亞組(CINⅡ～Ⅲ期)35例，年齡30～74(44.98±6.17)歲；低度病變亞組45例，年齡31～74(45.20±6.41)歲。另取正常人宮頸組織30例作為健康對照組，年齡31～73(44.53±6.39)歲。4組受試者年齡比較差異無統(tǒng)計學意義(P>0.05)，具有可比性。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審核批準，受試者及家屬知情同意并簽署知情同意書。

1.2 選擇標準 (1)納入標準：①所有患者均為已婚女性，存在完整的宮頸；②均同意行宮頸癌活性病理檢查；③臨床資料完整。(2)排除標準：①心肝腎等功能障礙、精神障礙及并發(fā)有其他腫瘤疾病者；②長時間使用激素及免疫制劑者；③已接受生物、化療及放療者；④嚴重感染及自身免疫病史者；⑤已有顯著的宮頸癌臨床癥狀者；⑥依從性差，中途退出者。

1.3 觀察指標與方法

1.3.1 p16異常甲基化檢測[8]：提取所有受試者宮頸組織的DNA，之后對其進行甲基化處理：①取宮頸組織的DNA 1～2 μg ，加入20 μl生理鹽水，再加入NaOH溶液3 mol/L調(diào)節(jié)濃度至0.3 mol/L，置于37℃條件下15 min；②加入新配濃度為10 mmol/L氫醌溶液調(diào)節(jié)濃度至5 mmol/L，再加入濃度為3.6 mol/L新配置的亞硫酸氫鈉調(diào)整為3.1 mol/L的最終濃度，最后加入礦物油，置于50℃條件下16 h；③再向上述樣品中加入適量3 mol/L NaOH溶液調(diào)節(jié)濃度至0.3 mol/L，置于37℃條件下15 min；④加入濃度為20 μg/μl糖原1 μl，加入濃度為8 mol/L醋酸氨溶液，調(diào)節(jié)樣品溶度為3 mol/L，按照樣品體積，加入2.5倍量的無水乙醇，-20℃條件下過夜。之后再通過甲基化特異性聚合酶鏈反應(yīng)(MSP)。陽性對照選用Sssl甲基轉(zhuǎn)移酶修飾的胎盤DNA，操作方法嚴格按照說明書執(zhí)行。亞硫酸氫鹽修飾完全判斷：同一DNA在修飾前后均用非甲基化特異性引物和甲基化特異性引物擴增，即如果修飾前無目的條帶發(fā)生擴增現(xiàn)象，而修飾后存在目的條帶擴增現(xiàn)象，則為修飾完全。相關(guān)引物由賽百盛基因技術(shù)有限公司合成，見表1。

表1 MSP引物序列

注:U為非甲基化特異性內(nèi)側(cè)引物;M為甲基化特異性內(nèi)側(cè)引物

1.3.2 宮頸組織p16蛋白表達檢測[9]：采用Western-blot法檢測。制備SDS-聚丙烯酰胺凝膠，將提取處理后的蛋白質(zhì)樣品向樣品孔中點樣30 μg，之后按照電泳操作方法進行電泳。再進行轉(zhuǎn)膜處理，在裝有蛋白的PVDF膜朝上，加入5%的封閉液，在4℃條件下?lián)u床封閉3 h。之后加入兔抗人p16單克隆抗體(1 ∶1 000，購自Abcam公司)，為一抗，在4℃條件下孵育過夜，TBST進行洗滌操作，共3次，每次15 min。之后再加入辣根過氧化物酶標記羊抗兔IgG(1 ∶1 000，購于上海信裕生物技術(shù)有限公司)，為二抗。在37℃條件下，孵育1 h，TBST進行洗滌操作，共3次，每次15 min。將上述經(jīng)過處理的PVDF膜浸入到發(fā)光工作液中，室溫條件下，孵育1 min，瀝干后顯影保存，之后通過Quantity One軟件對電泳條帶光密度值進行分析，將內(nèi)參β-actin與目的條帶光密度值進行對比，計算得出p16蛋白表達的相對量。

1.3.3 高危HPV病毒載量檢測[10]：通過第二代雜交捕獲試驗(HC-Ⅱ人乳頭狀瘤病毒檢測技術(shù))測定。醫(yī)生采集每例患者的宮頸細胞，做好標記；另外，患者自身采用dacron棉簽放入陰道6～7 cm深左右，靜止30 s后，轉(zhuǎn)動棉簽取出即可，放置于做好標記的試管中。通過堿性溶液破壞患者體內(nèi)病毒，使DNA雙鏈裂解成單鏈；通過RNA探針可以與病毒單鏈特異性結(jié)合形成雜交復合物；再通過其特異性抗體將復合物粘合于微孔壁上；之后雜交復合物會與堿性磷酸酶的多個抗體相結(jié)合，放大信號；最后，由于底物于堿性磷酸酶結(jié)合會發(fā)光，通過判定其發(fā)光強弱可以判定堿性磷酸酶的含量，從而確定雜交復合物的含量。陽性判定標準：對于上述2組待檢樣品，其中任何1組發(fā)現(xiàn)檢出的雜交復合物含量≥1.0 pg/ml時即可判定為陽性感染。采用聚合酶鏈式反應(yīng)反向點雜交法對高危HPV病毒載量進行檢測，試劑盒購自深圳亞能生物技術(shù)有限公司，操作方法嚴格按照說明書執(zhí)行。

2 結(jié) 果

2.1 4組高危HPV及p16異常甲基化陽性率比較 高危HPV和p16異常甲基化的陽性率比較，宮頸癌亞組>高度病變亞組>低度病變亞組>健康對照組(P均<0.01)，見表2。

表2 4組受試者高危HPV及p16異常

2.2 高危HPV病毒載量、p16蛋白表達量與宮頸病變程度的關(guān)系 隨著宮頸癌病變程度的不斷加重，其HPV病毒載量呈現(xiàn)增加趨勢，兩者呈正相關(guān)(r=0.692,P<0.01)。隨著宮頸癌病變程度的不斷加重，p16蛋白表達量也逐漸增加，兩者呈正相關(guān)(r=0.554,P<0.01)，見表3。

2.3 3種檢測方法診斷早期宮頸癌的ROC曲線分析 p16異常甲基化、高危HPV及p16異常甲基化+高危HPV的AUC分別為0.62、0.74、0.98；p16異常甲基化+高危HPV的敏感度、特異度、陰性預測值、陽性預測值及約登指數(shù)明顯高于單項檢查，見表4、圖1。

表3 高危HPV病毒載量、p16蛋白表達量與宮頸病變程度的關(guān)系 [例(%)]

表4 3種診斷方法對早期宮頸癌的cut-off值、敏感度及特異度

圖1 p16異常甲基化、高危HPV及聯(lián)合診斷的ROC曲線分析

3 討 論

大量研究顯示，許多腫瘤細胞呈現(xiàn)特定區(qū)域的CpG島高甲基化和整體基因組低甲基化，另外也有研究認為抑癌基因失活的主要機制為啟動子高甲基化[11]。實際上，腫瘤發(fā)生的本質(zhì)是抑癌基因的失活及癌基因的激活。p16基因主要位于人類第9號染色體短臂上，是一個可直接參與細胞周期調(diào)控的抑癌基因，與諸多癌癥的發(fā)生關(guān)系密切[12]。CyclinD1能與p16功能蛋白競爭性地結(jié)合CDK4/CDK6，會對pRb蛋白磷酸化產(chǎn)生抑制，促使pRb-E2F復合物中的E2F難以解離，對細胞DNA合成和G1期進入S期的啟動具有較好的阻止效果，負反饋調(diào)節(jié)細胞增殖周期，另外pRb-E2F復合物水平的升高也反饋性地對p16的表達產(chǎn)生抑制[13]。Tong等[14]研究顯示，p16基因失活與腫瘤的發(fā)生關(guān)系密切，p16基因的失活主要包括甲基化、突變及缺失。Stiasny等[15]認為諸如垂體瘤、鼻咽癌及肺癌等多種腫瘤發(fā)生主要與p16基因的異常甲基化有關(guān)。本研究正常人和宮頸癌患者p16基因甲基化率分別為0%和45%，也證實了宮頸癌的發(fā)生與p16基因甲基化有關(guān)。而隨著癌變程度的增加，p16異常甲基化越顯著，提示在宮頸癌發(fā)生之前已有p16基因啟動子發(fā)生了甲基化，并逐漸惡化，有利于對宮頸癌癌變級別進行預測，可作為一種新型的腫瘤分子標志物。與Ahmad等[16]的研究結(jié)果相符合。Yildirim等[17]研究顯示，正常宮頸組織中p16蛋白不表達，而在宮頸癌中呈現(xiàn)高表達，且與病變程度呈正相關(guān)，與本研究中結(jié)果相符。對此，臨床上有2種解釋[18]：(1)宮頸癌發(fā)生時，Rb基因失活致使功能性pRb蛋白缺失，解除機體對p16基因的抑制，升高p16蛋白的表達；(2)HPV16癌基因E7可誘導pRb蛋白降解或者失活，可通過pRb與p16之間的負反饋調(diào)節(jié)，誘導p16蛋白高水平表達。

宮頸癌患者宿主細胞中整合的高危HPV基因組，會持續(xù)性地對E6/E7癌基因進行表達，進而維持癌細胞的生長[19]。HPV E6/E7主要通過影響細胞周期中的Rb蛋白和調(diào)節(jié)因子P53發(fā)生致癌機制。E7與Rb蛋白相結(jié)合，會使pRb-E2F中的轉(zhuǎn)錄因子E2F釋放出來，影響G1/S的啟動，進而激活細胞周期，促使細胞非控制性增長[20]。E6可與P53蛋白特異性結(jié)合，使其喪失對細胞的負生成調(diào)節(jié)功能[21]。本研究結(jié)果顯示，高危HPV病毒載量與宮頸病變程度呈正相關(guān)，且各病變程度患者HPV陽性率與Tsakogiannis等[22]研究相符。而經(jīng)過ROC曲線分析聯(lián)合診斷的價值最高，這主要是由于HPV E7和p16基因均作用于以pRb為中心的pRb-E2F通路，而p16在G1～S期增殖過程中起著重要的作用，p16基因的甲基化會促使上述通路無限制進行，形成腫瘤[23]。據(jù)研究，人類癌癥細胞中pRb與p16基因水平呈負相關(guān)，兩者共同參與癌癥通路的抑制，破壞上述兩種的任一基因，均會促使細胞發(fā)生異常增生，兩者同時缺失會引起選擇性壓力缺乏[24]。隨著研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)單一高危HPV感染通常不會直接引起細胞發(fā)生癌變。Celewicz等[25]研究發(fā)現(xiàn)不同級別病變的高危HPV陽性宮頸癌亞組中均出現(xiàn)一定程度的p16甲基化，且出現(xiàn)p16甲基化的細胞大部分病變較為嚴重，故p16甲基化可能是促使低病變向高病變發(fā)展的誘導因子。

綜上所述，p16異常甲基化聯(lián)合高危HPV檢測對早期宮頸癌具有較高的診斷價值，值得臨床推廣應(yīng)用。