王海業(yè) 麻穎宜

Rho家族又稱Rho GRP酶，是一類GTP結(jié)合蛋白，具有GTP酶活性，在細胞增殖、分化、凋亡、運動轉(zhuǎn)移和和血管生成等多種過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用［1］。Ras相關(guān)C3肉毒素底物1（Rac1）是Rho家族成員，被證實在胃癌［2］、皮膚癌［3］和卵巢癌［4］等多種腫瘤中異常高表達，可通過調(diào)控細胞增殖、轉(zhuǎn)移和凋亡等在腫瘤的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮著重要作用。近年有研究指出，Rac1在口腔鱗狀細胞癌中高表達，但其在口腔癌進展中的具體作用尚不明確［5］。口腔鱗狀細胞癌是口腔癌中最為常見的病理類型，約占口腔癌的90%以上［6］。本研究以人口腔鱗狀細胞癌HSC-3細胞為研究對象，采用小干擾RNA（siRNA）技術(shù)靶向抑制細胞中Rac1的表達，觀察Rac1對HSC-3細胞增殖、侵襲和凋亡的影響，并探討其可能的分子機制，以期為口腔癌的治療提供新的靶點。

1 材料與方法

1.1細胞、試劑與儀器 HSC-3細胞株購于美國ATCC，RPMI-1640培養(yǎng)基購于美國Gibco公司；胎牛血清購于美國Hyclone公司，胰蛋白酶購于中國碧云天公司，青霉素、鏈霉素購于上海先鋒藥業(yè)公司，Rac1抗體購于美國Proteintech公司，PVDF膜購于美國Millipore公司，脫脂奶粉購于瑞士Nestle公司，siRNARac1及其陰性對照siRNA-NC購于上海吉瑪制藥公司，β-catenin、c-Myc、Bcl-2、Cleaved Caspase-3和GAPDH等抗體均購于美國Santa Cruz公司，HRP-羊抗兔二抗購于美國Zymed公司，脂質(zhì)體2000和RNA提取試劑盒購于美國Invitrogen公司。RIPA裂解液、CCK-8、超敏ECL發(fā)光和BCA蛋白濃度測定等試劑盒均購于上海Beyotime公司，細胞凋亡檢測試劑盒購于中國萬類生物公司，RT-PCR試劑盒購于上海Transgene公司；Transwell小室購于美國Costar公司，ELX800酶標(biāo)儀購于美國Biotek公司，WD-9413B凝膠成像系統(tǒng)購于北京六一儀器廠，NaoDrop 2000紫外分光光度計購于美國Thermo公司，9700PCR儀購于美國ABI公司，PY-16電熱恒溫培養(yǎng)箱購于美國Crystal公司。

1.2實驗方法

1.2.1HSC-3細胞培養(yǎng)、分組與轉(zhuǎn)染 在37℃和5%CO2的常規(guī)培養(yǎng)條件下以含10%胎牛血清、100 μg／ml鏈霉素和100 U／ml青霉素的RPMI-1640培養(yǎng)基培養(yǎng)HSC-3細胞。接種適量的對數(shù)生長期HSC-3細胞于6孔細胞板上，常規(guī)條件下培養(yǎng)過夜。

實驗分為未轉(zhuǎn)染組（未做任何處理）、siNC組（轉(zhuǎn)染siRNA-NC）和siRac1組（轉(zhuǎn)染siRNA-Rac1）。觀察細胞密度達70%以上時，參照脂質(zhì)體2000說明書步驟將200 pmol的siRNA-NC和siRNA-Rac1轉(zhuǎn)至siNC組和siRac1組細胞中。孵育4 h后，棄培養(yǎng)液，加入新鮮培養(yǎng)液繼續(xù)培養(yǎng)24 h。

1.2.2HSC-3細胞中Rac1 mRNA表達的檢測 采用RT-PCR檢測。參照RNA試劑盒說明書步驟提取HSC-3細胞的總RNA。再根據(jù)RT-PCR試劑盒說明書將定量后的RNA進行逆轉(zhuǎn)錄。以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進行PCR擴增，2-ΔΔCT法計算HSC-3細胞中Rac1 mRNA的表達。反應(yīng)體系：模板 1μl、上下游引物（10μM）各0.5μl、SYBR GREEN MasterMix 10μl，加入 dd H2O補至20μl。反應(yīng)條件：95℃ 36 0s，95℃30 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，共40個循環(huán)。其中，由上海吉瑪公司合成的引物序列如下：GAPDH引物F：5′-GAAGGTCGGAGTCAACGGAT-3′和 R：5′-CCTGGAAGATGGTGATGGGAT-3′；Rac1引 物 F：5′-CGAGAAACTGAAGGAGAAGAAGC-3′和 R：5′-AAGGGACAGGACCAAGAACGAG-3′。

1.2.3HSC-3細胞增殖的檢測 采用CCK-8法檢測。以胰蛋白酶消化收集各組細胞，細胞計數(shù)后以每孔4×104個接種至3張96孔細胞板上。每組設(shè)置5個復(fù)孔。置于培養(yǎng)箱中分別培養(yǎng)24、48和72 h后，棄培養(yǎng)液加入10μl CCK-8試劑孵育4 h。以酶標(biāo)儀在490 nm波長處檢測各組細胞吸光度（OD）值。實驗重復(fù)3次。

1.2.4HSC-3細胞侵襲的檢測 采用Transwell小室檢測。將無血清培養(yǎng)基稀釋的Matrigel膠緩慢鋪到Transwell小室膜上，置于培養(yǎng)箱中靜止2 h。胰蛋白酶消化收集各組細胞，加入無血清培養(yǎng)基制備濃度為3×104個／ml的單細胞懸液。將Tanswell小室放入24孔細胞板中，在下室加入含胎牛血清的培養(yǎng)基800 μl，上室內(nèi)加入細胞懸液200μl，每組設(shè)置3個重復(fù)。置于培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h后，取出Transwell小室，經(jīng)磷酸緩沖液洗滌后，小心除去上室中殘留的細胞，分別以4%多聚甲醛和0.5%結(jié)晶紫對細胞進行固定和染色。磷酸緩沖液沖洗晾干后，放于倒置顯微鏡下觀察穿膜細胞數(shù)，結(jié)果以隨機選取的5個視野的均值表示。實驗重復(fù)3次。

1.2.5HSC-3細胞凋亡的檢測 采用流式細胞儀檢測。收集轉(zhuǎn)染24 h后的各細胞，加入磷酸緩沖液洗滌細胞后，加入500μl Binding Buffer重懸細胞。再分別加入Annexin V和PI各5μl避光下室溫孵育15 min后，上機檢測。重復(fù)檢測3次。

1.2.6HSC-3細胞中 Rac1、β-catenin、Cleaved caspase-3、Bcl-2和c-Myc蛋白表達的檢測 采用Western blot檢測。收集轉(zhuǎn)染后的各組HSC-3細胞，加入細胞裂解液提取總蛋白，并根據(jù)BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測總蛋白的濃度。將蛋白樣品與上樣緩沖液以1∶1比例混合并置于沸水中煮沸3～5 min。以每孔20μl上樣液上樣至SDS-PAGE凝膠孔中，80 V電壓電泳2 h。濕轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)印到PVDF膜上。取出PVDF膜，浸入到TBST液中（含5%脫脂奶粉）封閉2 h。將膜與封閉液稀釋的一抗工作液（1∶1000）放入雜交袋中，封口4℃下孵育24 h。將膜取出并以封閉液洗滌5 min×3次后，將膜與封閉液稀釋的二抗工作液（1∶2000）放入雜交袋中，封口常溫孵育1h。再次洗膜后，滴加ECL發(fā)光劑反應(yīng)3 min。采用凝膠圖像處理系統(tǒng)以GAPDH為內(nèi)參，分析目的條帶的光密度值。

1.3統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS 22.0統(tǒng)計分析；實驗數(shù)據(jù)以（±s）形式表示，三組組間數(shù)據(jù)采用單因素方差分析，方差齊性采用LSD檢驗，兩組組間采用獨立樣本t檢驗；P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1Rac1 mRNA和蛋白的表達 轉(zhuǎn)染siRNA-Rac1后HSC-3細胞中Rac1表達下降；siNC組中Rac1 mRNA和蛋白的表達水平與未轉(zhuǎn)染組相比無顯著性差異（P＞0.05），但siRac1組中Rac1 mRNA和蛋白的表達水平較未轉(zhuǎn)染組明顯降低（P＜0.01）。見圖1和表1。

圖1 Western blot檢測HSC-3細胞中Rac1蛋白的表達

2.2Rac1對HSC-3細胞增殖的影響 下調(diào)Rac1表達可抑制HSC-3細胞增殖。未轉(zhuǎn)染組和siNC組比較，HSC-3細胞在24、48和72 h增殖過程中的OD值無明顯差異（P＞0.05）；但siRac1組細胞在24、48和72 h生長增殖過程中的OD值較未轉(zhuǎn)染組均明顯降低（P＜0.01）。見表2。

2.3Rac1對HSC-3細胞侵襲的影響 下調(diào)Rac1表達可抑制HSC-3細胞侵襲。三組侵襲細胞數(shù)分別為76.48±9.55、72.86±11.05和32.22±3.36。單因素方差分析三組間侵襲細胞數(shù)差異顯著（F＝24.201，P＝0.001）；與未轉(zhuǎn)染組比較，siRac1組中侵襲細胞數(shù)明顯減少（P＜0.05）；而siNC組與未轉(zhuǎn)染組間無顯著差異（P＞0.05）。

表1 各組HSC-3細胞中Rac1 mRNA和蛋白的相對表達量±s

表1 各組HSC-3細胞中Rac1 mRNA和蛋白的相對表達量±s

*與未轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.01

組別 RNA 蛋白未轉(zhuǎn)染組1.03±0.08 0.45±0.03 siNC組 0.97±0.06 0.48±0.03 siRac1組 0.31±0.02* 0.12±0.02*F 138.115 163.227 P 0.000 0.000

表2 各組不同時點HSC-3細胞的吸光度值比較/±s

表2 各組不同時點HSC-3細胞的吸光度值比較/±s

*與未轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.01

組別24 h 48 h 72 h未轉(zhuǎn)染組0.52±0.04 0.85±0.06 1.21±0.11 siNC組 0.49±0.03 0.83±0.05 1.18±0.08 siRac1組 0.38±0.03*0.48±0.04*0.69±0.05*F 14.382 50.610 36.529 P 0.005 0.000 0.000

2.4Rac1對HSC-3細胞凋亡的影響 下調(diào)Rac1表達可誘導(dǎo)HSC-3細胞凋亡。各組的細胞凋亡率分別為（3.06±0.25）%、（3.18±0.32）%和（13.82±1.24）%，三組間存在顯著差異（F＝201.764，P＝0.000）；與未轉(zhuǎn)染組比較，siNC組細胞凋亡率無顯著改變（P＞0.05），但siRac1組細胞的凋亡率明顯升高（P＜0.05）。見圖2。

圖2 AnnexinV-fitc流式細胞檢測HSC-3細胞的凋亡

2.5Rac1對Wnt／β-catenin信號通路的影響 下調(diào)Rac1表達可抑制Wnt／β-catenin信號通路的激活。siNC組Wnt／β-catenin信號通路相關(guān)蛋白β-catenin、c-Myc，以及其下游凋亡調(diào)控蛋白 Bcl-2和Cleaved Caspase-3的表達水平與未轉(zhuǎn)染組比較無明顯差異（P＞0.05），但 siRac1組β-catenin、c-Myc和Bcl-2T蛋白的表達水平均明顯低于未轉(zhuǎn)染組，而Bcl-2蛋白的表達水平明顯高于未轉(zhuǎn)染組（均P＜0.01）。見圖3和表3。

圖3 Western blot檢測 Wnt／β-catenin信號通路相關(guān)蛋白的表達

3 討論

Rac1基因位于人類7p22染色體上，全長29kb；通過與GTP結(jié)合激活或與GDP結(jié)合失活的循環(huán)作用在調(diào)控細胞生物學(xué)功能如細胞運動、增殖和凋亡等中發(fā)揮著重要作用，其異常表達與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切［7］。研究者分別對胃癌、結(jié)腸癌、乳腺癌、胰腺癌的研究［8～11］發(fā)現(xiàn)，Rac1在癌組織中高表達，且其表達水平與腫瘤分化、浸潤、增殖、侵襲、轉(zhuǎn)移和預(yù)后等有關(guān)，抑制其表達有望成為延緩和治療腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要策略。

口腔癌是一種位居全球第六位的惡性腫瘤，近年來其發(fā)病率呈升高趨勢，且發(fā)病年齡趨于年輕化，嚴重威脅著人們的身體健康［12］。目前口腔癌發(fā)生發(fā)展的機制并不完全清楚，探討其發(fā)生發(fā)展的機制，尋找有效的分子靶點對口腔癌治療具有重要意義。張月等［5］指出，Rac1在口腔鱗狀細胞癌組織中表達水平顯著高于癌旁組織，且其表達水平與腫瘤有無轉(zhuǎn)移有關(guān)，與上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化相關(guān)蛋白E-cadherin的表達無關(guān)；但Rac1在口腔癌進展中的作用并不清楚。

表3 各組細胞中Wnt／β-catenin信號通路的相對表達量比較/x±s

表3 各組細胞中Wnt／β-catenin信號通路的相對表達量比較/x±s

*與未轉(zhuǎn)染組比較，P＜0.01

-catenin c-Myc Bcl-2 Cleaved Caspase-3未轉(zhuǎn)染組組別 β 0.68±0.05 0.74±0.05 0.57±0.03 0.26±0.03 siNC組 0.72±0.05 0.69±0.06 0.54±0.03 0.23±0.03 siRac1組 0.35±0.03* 0.42±0.03* 0.11±0.02* 0.68±0.05*F 62.898 38.100 270.955 132.488 P 0.000 0.000 0.000 0.000

本研究以人口腔鱗狀細胞癌HSC-3細胞為研究對象，采用脂質(zhì)體法轉(zhuǎn)染siRNA-Rac1后成功下調(diào)HSC-3細胞中Rac1表達后，檢測到HSC-3細胞的增殖和侵襲能力減弱，細胞凋亡能力增強。結(jié)果表明，靶向Rac1的siRNA可抑制HSC-3細胞的增殖、侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡。提示，Rac1通過調(diào)控癌細胞增殖、侵襲和凋亡，促進口腔癌的惡性進展。

細胞信號途徑轉(zhuǎn)導(dǎo)在口腔癌等多種腫瘤細胞的增殖、侵襲和凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用，而經(jīng)典的Wnt／β-catenin轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑就是其中之一。β-catenin是Wnt／β-catenin通路的關(guān)鍵調(diào)控因子，其過度積累進入細胞核，通過調(diào)控靶基因轉(zhuǎn)錄激活Wnt／βcatenin通路，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展［13，14］；c-Myc是Wnt／β-catenin通路下游的靶基因，也是一種原癌基因，在促進細胞增殖、侵襲和抑制凋亡等過程中發(fā)揮著重要作用［15，16］；Bcl-2是公認的抑凋亡蛋白，而Caspase-3是細胞凋亡的重要執(zhí)行因子，兩者是檢測細胞凋亡的常見指標(biāo)［17，18］。在髓母細胞瘤和胰腺癌中，活化的Rac1可通過促進β-catenin表達激活Wnt／β-catenin通路，進而促進腫瘤的惡性進展［19，20］。

為深入闡明Rac1調(diào)控口腔癌進展的分子機制，本研究進一步檢測顯示，在Rac1低表達的HSC-3細胞中β-catenin、c-Myc和Bcl-2蛋白的表達水平均明顯降低，而Cleaved Caspase-3蛋白的表達水平明顯升高。結(jié)果表明，抑制Rac1可通過抑制Wnt／βcatenin信號通路活化抑制HSC-3細胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡。提示活化的Rac1可能通過激活Wnt／β-catenin信號通路促進口腔癌發(fā)生發(fā)展。

綜上所述，Rac1在口腔癌的發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮著重要的促進作用，靶向抑制其表達可通過Wnt／βcatenin信號通路抑制HSC-3細胞增殖、侵襲并誘導(dǎo)細胞凋亡，Rac1有望成為口腔癌治療的潛在靶點。