趙璐藐 劉瑞玲 郜海燕 韓延超 吳偉杰 陳杭君

(浙江省農(nóng)業(yè)科學院食品科學研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部果品產(chǎn)后處理重點實驗室/浙江省果蔬保鮮與加工技術(shù)研究重點實驗室/中國輕工業(yè)果蔬保鮮與加工重點實驗室,浙江杭州 310021)

茭白(Zizania caducifloraL.)又名高瓜、菰筍、菰手[1],禾本科菰屬多年生水生植物,喜沼澤多濕環(huán)境,是我國主要水生蔬菜之一,具有清熱解毒的功效[2-3]。茭白肉質(zhì)水嫩、味道鮮美且富含營養(yǎng),因其高營養(yǎng)和經(jīng)濟價值,在中國南方稻田廣泛種植[4],深受消費者喜愛。茭白采收期主要集中在5-10月的高溫季節(jié),常溫下不耐貯藏,其采后品質(zhì)劣變速度較快[5],易出現(xiàn)茭殼發(fā)黃、失水萎縮、肉質(zhì)木纖化、霉變軟化等問題。近年來有關(guān)茭白采后保鮮技術(shù)[6-8]的研究較多,但對于引起茭白采后腐爛問題的原因鮮有報道。

果蔬采后腐爛原因分病原菌采前潛伏感染和采后感染,采后感染主要是由于機械損傷而使微生物有適宜生長條件對果蔬侵染導致,其中真菌是果蔬最主要的致腐病原菌[9-10]。目前對茭白微生物病害的研究主要集中在田間病害,其中胡麻葉斑病是茭白重要病害之一。鐘海英等[11]和楊紹麗等[12]發(fā)現(xiàn)葉斑病由半知菌亞門長蠕孢屬真菌(Bipolaris zizaniae)引起；茭白紋枯病[13]、茭白銹病[14]也均為真菌病害,但鮮見針對茭白采后貯藏過程中的致腐微生物的研究報道。

本研究以茭白品種龍茭2號為試驗材料,放置在25℃恒溫條件下使其自然腐爛,應用傳統(tǒng)菌種分離法及rDNA-ITS序列分析[15]對茭白采后腐敗菌進行分離鑒定,并對此微生物進行生物學特性的初步研究,旨在確定引起茭白采后常溫貯藏腐敗的主要致腐真菌,為后續(xù)采取針對性的防腐保鮮措施提供基礎(chǔ)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料及前處理

茭白品種龍茭2號,采自浙江省嘉興市桐鄉(xiāng)董家茭白合作社。挑選大小均一、無明顯病蟲害的茭白。為模擬茭白采后貯藏條件,選擇100根茭白,用PE袋(0.06 mm)進行包裝,每袋5根,置于25℃下貯藏。貯藏期間,定期觀察發(fā)病情況。

馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基,上海盛思生物科技有限公司；馬鈴薯葡萄糖肉湯(PDB)培養(yǎng)基,上海盛思生物科技有限公司。

1.2 主要儀器與設(shè)備

MLS-3781L-PC型高壓蒸汽滅菌器,松下健康醫(yī)療器械株式會社；MJX-160B-Z型霉菌培養(yǎng)箱,上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠；BSC-1300IIAZ超凈工作臺,江蘇蘇凈集團有限公司；蔡司axio-vert型倒置熒光顯微鏡,卡爾·蔡司股份公司；血細胞計數(shù)板,上海求精生化試劑儀器有限公司。

1.3 測定項目及方法

1.3.1 腐敗菌的分離純化 參照方中達[16]的方法,將自然發(fā)病的茭白按照病癥分組,采用常規(guī)組織分離法,對發(fā)病茭白上的病原菌進行分離與純化。在無菌條件下,用無菌手術(shù)刀切取小塊病健交界處的茭白組織,75%酒精表面消毒30 s,用無菌水洗滌數(shù)次后,移入PDA培養(yǎng)基平板上,每個病癥3個平板,于25℃條件下培養(yǎng)3～5 d,觀察分離生長出菌落的外觀形態(tài)。用已經(jīng)滅菌的接種環(huán)從菌落最外圈挑取菌絲,轉(zhuǎn)接至新的PDA平板,直至菌落均勻為止,于25℃培養(yǎng)3 d,反復分離純化,待出現(xiàn)純菌落時轉(zhuǎn)接至斜面繼續(xù)培養(yǎng),菌種編號后轉(zhuǎn)接至試管斜面4℃冰箱保存,用于初步菌落形態(tài)及觀察鑒定。

1.3.2 回接驗證試驗 根據(jù)柯赫氏法則,采用針刺法[16]把純化后的絲狀真菌塊回接至健康的茭白上,以不接真菌塊為對照。將處理后的茭白置于長、寬、高分別為 400、300、100 mm的塑料筐內(nèi),貯藏于25℃恒溫箱中,定期觀察茭白腐敗情況,顯出病癥后再次對其進行分離鑒定,觀察相應形態(tài),判斷菌株是否一致。

1.3.3 腐敗菌形態(tài)學鑒定 將保存于4℃冰箱中的菌株活化,25℃培養(yǎng)3 d,用打孔器打取直徑6 mm的菌餅,轉(zhuǎn)接到PDA平板上,25℃培養(yǎng),每天觀察記錄菌落培養(yǎng)特征。挑取菌絲制成載玻片,于熒光顯微鏡下觀察菌絲體及孢子形態(tài)。

1.3.4 腐敗菌分子學鑒定

1.3.4.1 腐敗菌基因組DNA提取 將純化的供試菌株在PDA平板上25℃培養(yǎng)3 d,刮取少量菌絲,轉(zhuǎn)接到50 mL PDB培養(yǎng)液中,恒溫搖床振蕩(25℃、150 r·min-1)培養(yǎng)3～4 d,然后用無菌濾紙濾出菌絲體,再用無菌水沖洗3～5次,用濾紙吸干水分,收集菌絲。采用CTAB法提取和純化基因組DNA[17]。

1.3.4.2 腐敗菌rDNA-ITS序列擴增 采用真菌通用引物ITS1和ITS4對提取的基因組DNA進行PCR擴增[18],引物序列:ITS1:5′-TCCGTAGGTGAACCTGCGC-3′；ITS4:5′-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3′,引物合成委托杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。PCR反應體系 (50μL): 金牌 Mix(green)45μL、 ITS1(10 μmol·L-1)2μL、ITS4(10 μmol·L-1)2μL、模板 DNA 1μL。PCR反應程序:98℃預變性2 min,98℃變性10 s,55℃退火10 s,72℃延伸10 s,35個循環(huán),72℃延伸5 min,4℃保存。

上述擴增產(chǎn)物經(jīng)1.2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后,切下凝膠中的目的片段,用瓊脂糖凝膠電泳回收,回收的DNA片段送至杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司進行測序。

1.3.4.3 腐敗菌rDNA-ITS序列分析及進化樹構(gòu)建

將所測序列提交至GenBank數(shù)據(jù)庫,并利用NCBI網(wǎng)站進行BLAST在線比對,尋找同源性較高的已知序列。再用Neighbor-Joining法[19]構(gòu)建菌株與親緣關(guān)系相近物種的系統(tǒng)發(fā)育樹,結(jié)合菌株形態(tài),確定菌株種屬。

1.3.5TEF-1α基因序列分析 采用翻譯延伸因子(TEF-1α)引物 TEF-F(5′-ATGGGTAAGGARGACAAG AC-3′)和 TEF-R(5′-GGARGTACCAGTSATCATGTT-3′)對病原菌進行擴增鑒定以明確種。50μL反應體系:金牌 Mix(green)25μL、TEF-F 2μL、TEF-R 2μL、模板DNA 2μL及雙蒸水19μL。 PCR反應程序:98℃預變性2 min,98℃變性10 s,52℃退火10 s,72℃延伸15 s,35個循環(huán),72℃延伸6 min,4℃保存。引物合成及擴增產(chǎn)物均由杭州擎科梓熙生物技術(shù)有限公司完成。采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹,進行禾谷鐮孢復合種亞種的鑒定。

1.3.6 腐敗菌生物學特性分析

1.3.6.1 不同培養(yǎng)溫度對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響

取直徑為6 mm的菌餅放于PDA平板中央,分別置于 5、10、15、20、25、30、35℃溫度下培養(yǎng),3 d 后用十字交叉法測定各平板菌落直徑,9 d后用6 mL無菌水洗滌菌株的孢子,充分搖勻后,采用血細胞計數(shù)板計算孢子數(shù)。每個試驗重復3次。孢子數(shù)計算公式如下:

產(chǎn)孢量(個·mL-1)=N×5×104×稀釋倍數(shù)

式中,N為5個中方格中的孢子總數(shù)。

1.3.6.2 不同pH值對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響用 0.1 mol·L-1HCl和 0.1 mol·L-1NaOH 調(diào)節(jié)滅菌后的PDA 培養(yǎng)基,制成 pH 值分別為 4、5、6、7、8、9、10、11的平板,其余操作方法同1.3.6.1。

1.3.6.3 不同碳源對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 以察氏固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,用等摩爾碳量的D-果糖、甘露醇、乳糖、麥芽糖、葡萄糖、蔗糖、可溶性淀粉替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的蔗糖,以無碳源培養(yǎng)基為對照,其余操作方法同1.3.6.1。

1.3.6.4 不同氮源對菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 以察氏固體培養(yǎng)基為基礎(chǔ)培養(yǎng)基,用等摩爾氮量的牛肉膏、蛋白胨、酵母浸出粉、硫酸銨、硝酸銨、硝酸鈉、尿素替代基礎(chǔ)培養(yǎng)基中的硝酸鈉,以無氮源培養(yǎng)基為對照,其余操作方法同1.3.6.1。

1.3.6.5 致死溫度測定 在菌落邊緣打取直徑6 mm的菌餅放入盛有5 mL無菌水的試管中,分別于40、45、50、55、60、65、70℃條件下恒溫水浴處理 10 min,迅速冷卻并接種于PDA平板上,25℃恒溫培養(yǎng),觀察菌落生長情況。每個試驗設(shè)3個重復。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計與分析

試驗數(shù)據(jù)用Microsoft Office Excel 2010整理,用SPSS Statistics 23軟件進行差異顯著性分析(P＜0.05),采用Origin 2017繪制圖形。

2 結(jié)果與分析

2.1 腐敗菌分離純化結(jié)果

自然發(fā)病癥狀:該菌危害茭白表現(xiàn)為茭殼出現(xiàn)暗黃色,形成黑色病斑,軟化。隨后病斑部位有白色絨狀物,逐漸擴大(圖1-A,B)。從自然腐爛的茭白上共分離出3株真菌,分別標記為 ZL-1、ZL-2、ZL-3。將分離得到的菌株,按照柯赫式法則進行回接驗證,只有ZL-2能導致茭白發(fā)病腐爛(圖1-C),經(jīng)形態(tài)學初步鑒定,該菌屬于鐮刀菌屬。將菌接種至茭白上,3 d可使茭殼發(fā)黃黑化,隨后長出白毛出現(xiàn)軟腐病癥,與茭白自然腐爛癥狀相符合,從接種發(fā)病的部位也能分離得到與接種菌相同的菌株,表明該菌為茭白采后致腐病菌。

由圖1-D、E、F可知,ZL-2菌落圓形,棉絮狀或毛氈狀,菌絲體初期白色,生長旺盛,后期成淡粉色,可擴展至整個培養(yǎng)皿；菌絲有隔,分枝,大型分生孢子呈鐮刀形或紡錘形,3～4個隔膜,呈無色或透明。

2.2 腐敗菌rDNA-ITS序列和系統(tǒng)發(fā)育樹分析

用真菌通用引物ITS1和ITS4對分離出的腐敗菌進行rDNA-ITS的PCR擴增驗證,得到序列長度約為509 bp的片段,條帶清晰(圖2)。將該序列在NCBI上進行比對發(fā)現(xiàn),該菌ZL-2的rDNA-ITS序列與禾谷鐮刀菌(Fusarium graminearum)的同源性達到99%,可信度較高。進一步進行多重序列比較,構(gòu)建其系統(tǒng)發(fā)育樹(圖3),結(jié)果顯示,ZL-2與親緣關(guān)系最近的禾谷鐮刀菌(登錄號:KT318586.1)聚為一類。為進一步確定其屬種,接下來對禾谷鐮孢復合種的TEF-1α基因序列進行分析。

圖2 茭白采后分離病原菌rDNA-ITS區(qū)PCR擴增產(chǎn)物的電泳結(jié)果Fig.2 Electrophoresis results on PCR products of rDNA-ITS from pathogens

2.3 禾谷鐮孢復合種的TEF-1α基因序列分析

采用TEF-1α基因測序?qū)︾犳呔M行亞種的鑒定,比對發(fā)現(xiàn)該菌株與NCBI中相關(guān)菌的TEF-1α基因序列同源性達到100%,并構(gòu)建了系統(tǒng)發(fā)育樹(圖4)。鑒定結(jié)果表明,其與禾谷鐮刀菌(登錄號:JX118857.1)親緣關(guān)系較近。因此,綜合ZL-2的形態(tài)學特征、rDNA-ITS序列分析和系統(tǒng)發(fā)育樹,確定引起該茭白采后腐爛的主要病原真菌為禾谷鐮刀菌(F.graminearum)。

2.4 腐敗菌生物學特性分析

2.4.1 培養(yǎng)溫度對菌株ZL-2菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 由圖5可知,菌株ZL-2在PDA平板上對培養(yǎng)溫度適應范圍較寬,5～35℃范圍內(nèi)均能生長,適宜生長溫度為20～30℃,最適溫度為25℃,此溫度下培養(yǎng)3 d菌落直徑可達到77.90 mm。同時在25℃時產(chǎn)孢量最大,且顯著高于其他培養(yǎng)溫度(P＜0.05),在低于5℃或高于35℃時基本不產(chǎn)孢。故菌株ZL-2產(chǎn)孢的適宜溫度為20～30℃,最適溫度為25℃,平均產(chǎn)孢量為6.20×106個·mL-1。

圖3 基于ITS基因序列構(gòu)建的菌株ZL-2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 Phylogenetic tree based on ITS sequences of strain ZL-2

圖4 基于TEF-1α基因序列構(gòu)建的菌株ZL-2系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.4 Phylogenetic tree based on TEF-1α gene sequences of strain ZL-2

2.4.2 pH值對菌株ZL-2菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響由圖6可知,PDA平板pH值為4～11時,菌株均能生長,pH值為4時,菌絲生長緩慢；pH值為7～11時,其對菌絲生長的影響不顯著(P＞0.05),而pH值為5～6時,其對菌株ZL-2菌絲生長的影響顯著(P＜0.05),表明該菌適宜在偏中堿性環(huán)境中生長,且在pH值為7時出現(xiàn)菌絲生長高峰,菌落直徑達到71.64 mm。菌株ZL-2在pH值4～11時均能產(chǎn)孢,但高酸或高堿環(huán)境會抑制孢子產(chǎn)生[20],pH值為4和11時產(chǎn)孢量相對其他pH值均較低,該菌最適產(chǎn)孢pH值為6(P＜0.05)。

圖5 不同培養(yǎng)溫度對菌株ZL-2菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.5 Effect of different culture temperatures on the mycelial growth and sporulation of strain ZL-2

圖6 不同pH值對菌株ZL-2菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.6 Effect of different pH values on the mycelial growth and sporulation of strain ZL-2

2.4.3 不同碳源對菌株ZL-2菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 由圖7可知,菌株ZL-2以甘露醇、蔗糖、葡萄糖為碳源時生長較好,三者間無顯著差異(P＞0.05),其中,最佳碳源為甘露醇,菌落直徑可達到82.27 mm,且菌絲生長迅速,但較稀薄,相對其他碳源處理有顯著差異性(P＜0.05),表明不同碳源對禾谷鐮刀菌菌絲生長有一定的影響。D-果糖有利于該菌產(chǎn)孢,產(chǎn)孢量最大,為0.89×106個·mL-1,其次是甘露醇與蔗糖,這3種碳源對該菌產(chǎn)孢量的影響無顯著差異(P＞0.05)。

2.4.4 不同氮源對菌株ZL-2菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響 由圖8可知,菌株ZL-2以酵母浸出粉為氮源時生長較好,培養(yǎng)3 d時菌落直徑為78.85 mm,顯著高于其他氮源處理(P＜0.05),其他氮源處理對禾谷鐮刀菌生長的影響不明顯。其中,硫酸銨和蛋白胨有利于該菌產(chǎn)孢,最適產(chǎn)孢的氮源為硫酸銨,產(chǎn)孢量為4.10×106個·mL-1,且產(chǎn)孢量顯著高于其他氮源處理(P＜0.05)。

2.4.5 菌株ZL-2致死溫度分析 經(jīng)40～50℃處理后,菌株ZL-2在PDA上能繼續(xù)生長,且生長前期隨著水浴溫度的升高,其菌絲越稀薄,后期菌絲無明顯變化。而經(jīng)≥55℃的水浴溫度處理后,菌株ZL-2在PDA上培養(yǎng)5 d也無生長,表明該菌致死溫度為55℃(處理時間10 min)。

圖7 不同碳源對菌株ZL-2菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.7 Effect of different carbon sources on the mycelial growth and sporulation of strain ZL-2

圖8 不同氮源對菌株ZL-2菌絲生長及產(chǎn)孢量的影響Fig.8 Effect of different nitrogen sources on the mycelial growth and sporulation of strain ZL-2

3 討論

禾谷鐮刀菌(F.graminearum)為一類常見的鐮刀菌,屬半知菌亞門真菌,是禾本科作物重要病原菌之一,最早于小麥和大麥赤霉病害中[21-22]發(fā)現(xiàn)。近年來,有報道稱禾谷鐮刀菌會引起蘭州百合枯萎病[23]、小麥鐮刀菌枯萎病[24]、小麥赤霉病[25]等病害,其具有一定的致病性,且不同地方的菌株致病力有區(qū)別[26]。研究發(fā)現(xiàn)鐮刀菌屬(Fusarium)是引起荸薺[27]、蓮藕[28-29]等水生蔬菜采后貯藏期間腐敗的病原菌。本研究通過形態(tài)學鑒定、序列比對和回接試驗,確定茭白采后常溫貯藏腐爛的主要病原真菌為禾谷鐮刀菌,這與劉毛欣等[30]的研究有一定的相似之處,即禾谷鐮刀菌能侵染茭白,引起腐爛并造成危害。

研究菌株的生物學特性對了解該病害發(fā)生、形成規(guī)律以及防治具有重要意義。目前國內(nèi)對禾谷鐮刀菌的生物學特性有一些研究,吳小龍[31]發(fā)現(xiàn)在玉米青枯病上分離出的禾谷鐮刀菌菌絲生長最適溫度為25℃,生長最適pH值為7。本研究中菌株ZL-2菌絲生長的最適溫度為25℃,且在pH值為7時菌落直徑達到最大,與前人研究結(jié)果一致。常溫中性條件最適合菌株ZL-2生長,這可能是導致茭白常溫貯藏容易受其侵染的主要原因,因此,低溫貯藏能較好抑制茭白中微生物的生長。

研究培養(yǎng)基的碳源和氮源成分能了解真菌的生長環(huán)境需求,明確培養(yǎng)條件。本研究結(jié)果表明,菌株ZL-2生長的最佳碳源為甘露醇,且甘露醇與蔗糖、葡萄糖間無顯著差異,均能促進菌絲生長,這與李沛利等[32]的研究結(jié)果相似。本研究結(jié)果表明,ZL-2生長的最佳氮源為酵母浸出粉,這與周小軍等[33]研究發(fā)現(xiàn)的酵母浸出粉促進菌絲生長的結(jié)果相似。同時,D-果糖和硫酸銨有利于菌株ZL-2產(chǎn)孢。

綜上所述,茭白采后主要致腐菌也有可能因生長環(huán)境不同而不一致,這有待進一步研究。禾谷鐮刀菌在侵染過程中能產(chǎn)生對人體和動物有害的真菌毒素[34],因此,這幾年對禾谷鐮刀菌的研究主要集中于該菌致病毒力方面,此外,茭白腐爛也可能與其毒素的產(chǎn)生有關(guān)聯(lián)性。禾谷鐮刀菌如何致病以及具體侵染過程尚有待進一步研究,以便采取正確的保鮮及防治措施。

4 結(jié)論

本研究從常溫下自然腐爛的茭白上分離純化出主要致腐真菌,通過對其進行形態(tài)學及分子學鑒定,確認引起茭白采后自然腐爛的主要病原真菌為禾谷鐮刀菌(F.graminearum)。生物學特性研究發(fā)現(xiàn),該菌菌絲最適生長溫度為25℃,在25℃產(chǎn)孢量最大；在pH值4～11范圍內(nèi)均能生長,最適產(chǎn)孢pH值為6；以甘露醇為碳源、酵母浸出粉為氮源時菌絲生長最快,以 D-果糖為碳源、硫酸銨為氮源時菌產(chǎn)孢量大,菌株致死溫度為55℃(處理時間10 min)。綜合分析,為了延緩茭白采后腐爛,應避免該菌適合生長及產(chǎn)孢的有利環(huán)境條件。本研究結(jié)果為茭白采后病害防治提供了一定的參考依據(jù)。