王 冕 張朝昕 陳 娜 陳明娜 禹山林 遲曉元

(1山東省花生研究所,山東青島 266100；2青島市市容環(huán)境衛(wèi)生管理中心,山東青島 266100)

花生(Arachis hypogaeaL.)是重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物,其生長發(fā)育容易受到高鹽、低溫、干旱、病蟲害等逆境脅迫的影響[1]。近年來,隨著花生栽培技術(shù)的提高,其生產(chǎn)產(chǎn)區(qū)逐漸向高鹽、干旱等地區(qū)擴(kuò)展,增加了鹽堿地區(qū)的生產(chǎn)量[2]。但隨著環(huán)境條件的惡化,花生減產(chǎn)日趨嚴(yán)重,因此進(jìn)行花生抗逆相關(guān)基因克隆及抗逆途徑的挖掘,有利于從根本上提高花生自身抗性和適應(yīng)性,對(duì)花生生產(chǎn)具有重要的理論和實(shí)踐意義。

研究表明植物在長期的抗逆進(jìn)化過程中,具有應(yīng)答逆境信號(hào)的感知和轉(zhuǎn)導(dǎo)能力[3-4]。其中參與植物細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)過程中最普遍的是蛋白質(zhì)的磷酸化與去磷酸化過程,其是通過蛋白激酶的作用來完成的[5-6]。蛋白激酶根據(jù)其磷酸化底物蛋白的不同氨基酸殘基類型可分為五大類(絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶、酪氨酸蛋白激酶、組氨酸蛋白激酶、色氨酸蛋白激酶和天冬氨酰基/谷氨?；鞍准っ?,其中有關(guān)絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶家族中的促絲裂原活化蛋白激酶(mitogenactivated protein kinase,MAPK)家族的研究較多[7-8]。MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳遞系統(tǒng)(mitogen-activated protein kinase cascade pathway)是指,當(dāng)植物受到外界環(huán)境刺激,細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)傳遞通過促絲裂原活化蛋白激酶激酶激酶(mitogen-activated protein kinase kinase kinase,MAPKKK)-促絲裂原活化蛋白激酶激酶(mitogenactivated protein kinase kinase,MAPKK)-MAPK的依次磷酸化得以放大,調(diào)控下游基因的起始轉(zhuǎn)錄[9-10]。其中MAPKK(MKK)為該傳遞系統(tǒng)的中間組分[11]。

目前已在大量作物中分離得到了MAPK級(jí)聯(lián)途徑的組分,包括擬南芥的80個(gè)MAP3K、10個(gè)MKK和20個(gè)MAPK[3]；水稻的75個(gè) MAP3K、8個(gè) MKK和17個(gè)MAPK[12-13]；番茄的89個(gè) MAP3K、5個(gè) MKK 和16個(gè)MAPK[14-15]；黃瓜的59個(gè)MAP3K和6個(gè)MKK[16]；玉米的74個(gè)MAP3K、9個(gè)MKK和15個(gè)MAPK[17-18]；大豆的38個(gè)MAPK[19]；煙草的17個(gè)MAPK[20]等。其中MKK可以被多個(gè)MAPKKK磷酸化,同時(shí)可以啟動(dòng)多個(gè)MAPK的磷酸化,參與多種生物學(xué)途徑,是極其重要的MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳遞系統(tǒng)組分[21-22]。但目前分離得到MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳遞系統(tǒng)組分中MKK的數(shù)量最少。

MKK根據(jù)其蛋白催化區(qū)域的氨基酸序列的不同,可以分為 4個(gè)組,如擬南芥中 AtMKK1、AtMKK2和AtMKK6屬于 A組,AtMKK3屬于 B組,AtMKK4和AtMKK5屬于C組,AtMKK7-10屬于D組[23]。有研究表明,同一組中的MKK可能共同作用于同一種生物學(xué)過程,不同組的MKK可能參與的生物學(xué)過程不同[24-25]。如在擬南芥中MKK4和MKK5功能類似,均能參與乙烯的合成,促進(jìn)抗病基因的表達(dá)[26]；MKK2能被低溫、高鹽等脅迫誘導(dǎo)激活[27],還能通過負(fù)調(diào)控參與氣孔的發(fā)育過程,調(diào)控相應(yīng)基因表達(dá)[28]；MKK9也參與乙烯的應(yīng)答反應(yīng),在擬南芥的葉片衰老過程中AtMKK7和AtMKK9的表達(dá)量上調(diào),此外,其還參與氣孔的發(fā)育[29]；MKK7參與生長素的極性運(yùn)輸[30]；MKK3參與茉莉酸(jasmonic acid,JA)合成[31]；MKK6參與調(diào)控?cái)M南芥的胞質(zhì)分裂[32]。在煙草中,MKK1參與調(diào)控脫落酸(abscisic acid,ABA)依賴的CAT1基因的表達(dá)[33]。

目前關(guān)于MKK基因的研究主要集中于擬南芥、煙草等模式植物,關(guān)于花生中MKK基因的研究尚鮮見報(bào)道。本研究從已有的cDNA文庫中篩選到1條MKK同源序列,通過RACE-PCR克隆了該基因的完整序列,通過序列分析和構(gòu)建同源進(jìn)化樹,將基因命名為AhMKK4。進(jìn)一步分析該基因在非生物脅迫下的表達(dá)模式,并構(gòu)建表達(dá)載體,進(jìn)行亞細(xì)胞定位研究,通過分析該基因的表達(dá)模式和蛋白定位情況,闡明其對(duì)非生物脅迫、激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的響應(yīng),以期為花生抗逆分子調(diào)控研究提供一定的理論參考。

1 材料與方法

1.1 材料

試驗(yàn)采用的花生品種為花育20號(hào),由山東省花生研究所育成并保存?；ㄉN子經(jīng)過無菌水清洗后,浸泡3 h,點(diǎn)播于水培培養(yǎng)箱中,置于恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),光周期為16 h光照/8 h黑暗,培養(yǎng)溫度為25℃,待四葉期時(shí)取各組織作為試驗(yàn)材料。瞬時(shí)表達(dá)和亞細(xì)胞定位采用的材料為本生煙(Nicotiana benthamiana),種子由青島生工生物工程有限公司提供。將煙草種子播種于土壤中,在恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng),光周期為16 h光照/8 h黑暗,培養(yǎng)溫度為25℃,待四葉期時(shí)取煙草葉片作為試驗(yàn)材料。

花生不同組織表達(dá)模式分析采用的材料分別為根、莖、葉、花、子葉和下胚軸,其中根、莖和葉取自花生三葉期的幼苗,花取自盛花期,子葉和下胚軸取自成熟期的鮮花生種子。不同植物激素的處理濃度分別為水楊酸 (salicylic acid,SA,2 mmol·L-1)、 JA(100 μmol·L-1)、吲 哚 乙 酸 (indole acetic acid,IAA,100 μmol·L-1)和 ABA(100 μmol·L-1),取樣時(shí)間分別為處理后1、2、4、8、12、24 和48 h；鹽脅迫和干旱脅迫處理時(shí),取四葉期的幼苗,沖洗根部泥土后,將根分別浸泡于200 mmol·L-1NaCl和15%PEG6000溶液中,取樣時(shí)間分別為浸泡后 1、2、4、8、12、24 和 48 h；ABA 處理下以相同濃度乙醇作為對(duì)照,其他處理則以清水作為對(duì)照。

分別選擇易感病品種(花育34號(hào)和花育19號(hào))、感病品種(遠(yuǎn)雜9805和開17-6)、抗病品種(青花1號(hào)和豫花9805)和高抗品種(P09-2和開17-15)三葉期葉片,作為不同品種間基因表達(dá)水平分析中的材料。

1.2 方法

1.2.1 RNA提取和cDNA合成 按照RNeasy Mini Kit試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]操作步驟提取花生樣品總RNA,用Pultton P100超微量分光光度計(jì)(Plextech,美國)測(cè)定提取的RNA濃度后,按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒[天根生化科技(北京)有限公司]步驟,合成cDNA第一鏈:于反應(yīng)總體系20μL中加入2 μg RNA,PCR擴(kuò)增條件為42℃延伸1 h,0℃保存15 min。合成后的cDNA于-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 基因全長克隆 根據(jù)cDNA文庫中已知AhMKK的EST序列,設(shè)計(jì)3′端特異引物kk4-3P1和kk4-3P2,與B26和B25進(jìn)行3′RACE巢式PCR,設(shè)計(jì)5′端特異引物kk4-5P1和kk4-5P2,與AAP和AUAP進(jìn)行5′RACE巢式PCR,將克隆片段與pMD19-T載體連接,轉(zhuǎn)化大腸桿菌Top-10,涂板后篩選陽性克隆,送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。將測(cè)序結(jié)果與中間片段進(jìn)行序列比較,確定所得片段為目的基因的兩端片段。PCR反應(yīng)體系共計(jì)20μL,包含上下游引物各 1μL,1μL cDNA 模板,10μL LA TaqTMmix 和7μL ddH2O。PCR第一輪擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s,50～60℃退火30 s,72℃延伸30 s,25個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；15℃保存。第二輪擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s,50～60℃退火30 s,72℃延伸30 s,35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物15℃保存?zhèn)溆肹34]。

根據(jù)序列拼接結(jié)果設(shè)計(jì)引物,利用RT-PCR從花育20號(hào)中擴(kuò)增目的基因的全長序列。PCR反應(yīng)體系共計(jì) 20μL,包含上下游引物各 1μL,1μL cDNA 模板,10μL LA TaqTMmix 和 7μL ddH2O。 PCR 擴(kuò)增程序:94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s,50～60℃退火30 s,72℃延伸1.5 min,30個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min；擴(kuò)增產(chǎn)物15℃保存?zhèn)溆谩CR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后回收純化。純化產(chǎn)物連接至pMD19-T載體,送至上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果進(jìn)行序列比對(duì),確認(rèn)翻譯的氨基酸序列無錯(cuò)誤后,進(jìn)行序列BLAST比對(duì)并分析序列信息。

1.2.3 序列分析及系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建 將克隆的基因序列在 NCBI(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/)和PeanutBase(https://peanutbase.org)網(wǎng)站上利用BLAST工具進(jìn)行基因序列的相似性及同源性查找,利用DNAMAN軟件的Multiple Alignment對(duì)這些序列進(jìn)行基因同源性的比較,用MEGA 4.0軟件的Neighbour-Joining法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹。

1.2.4 RT-qPCR基因表達(dá)分析 利用熒光定量試劑盒(Everbright?Inc.,美國),以反轉(zhuǎn)錄合成的cDNA為模板,進(jìn)行定量PCR檢測(cè)基因表達(dá)圖譜。反應(yīng)體系共計(jì) 20μL,包含 10μL 2×SYBR Premix,2μL cDNA 模板,200 nmol·L-1引物各 0.4μL 和 7.2μL ddH2O。 反應(yīng)程序:95℃預(yù)變性10 s；95℃變性5 s,60℃退火30 s和72℃延伸10 s,40個(gè)循環(huán)；60℃退火30 s；72℃延伸10 s。每個(gè)PCR反應(yīng)進(jìn)行3次重復(fù),所用內(nèi)參基因?yàn)榛ㄉ鶤ctin11。本研究中所用引物詳見表1。

表1 AhMKK4基因克隆引物Table1 The primers used in gene cloning of AhMKK4

1.2.5 植物表達(dá)載體的構(gòu)建 將回收的PCR產(chǎn)物與T載體pMD19-T進(jìn)行連接。用BamHⅠ/XbaⅠ雙酶切克隆到pCAMBIA-1300載體上,構(gòu)建pCAMBIA-1300-AhMKK4表達(dá)載體,連接后挑取正向克隆測(cè)序。DNA片段與pMD19-T的連接,采用pMD19-T 1μL,DNA回收片段 4μL(-50 ng),SolutionI(TaKaRa,日本)5μL,共10μL反應(yīng)混合液于16℃下連接過夜(約12～16 h)。PMD19-T和pCAMBIA-1300載體的酶切反應(yīng)體系為質(zhì)粒 10μL,Buffer 5μL,XmaI1μL,HamHⅠ 1μL,ddH2O 33μL,共計(jì) 50μL。 將反應(yīng)混合液于 37℃溫育6 h。取1μL酶切反應(yīng)液,用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)酶切效果,并估測(cè)載體片段的大小,該酶切反應(yīng)液可直接用作連接。

1.2.6 煙草葉片瞬時(shí)表達(dá)及亞細(xì)胞定位分析 將煙草培養(yǎng)一個(gè)月后,用一次性注射器將農(nóng)桿菌菌液注射至煙草葉片背面,于陰暗處放置約2～5 d后進(jìn)行觀察。于注射部位周圍取約 1 cm2的材料,于OLYMPUSFV300激光共聚焦顯微鏡(奧林巴斯,日本)下觀察,使用OLYMPUSDP26數(shù)碼相機(jī)(奧林巴斯,日本)拍照。

2 結(jié)果與分析

2.1 AhMAPKK4基因的克隆

根據(jù)測(cè)序得到的EST序列,利用RACE-PCR擴(kuò)增出3′端DNA片段約 200 bp和 5′端 DNA片段約 300 bp(圖1)。序列分析表明所得片段為目的基因的兩端片段。

圖1 MAPKK4 3′和5′片段的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.1 The PCR products of 3′and 5′fragment of AhMKK4

根據(jù)所獲得的中間片段、5′片段和3′片段拼接出AhMKK4基因的全長cDNA序列,PCR擴(kuò)增得到1 500 bp左右的片段。同時(shí)得到編碼區(qū)全長1 000 bp片段。序列分析結(jié)果表明,該P(yáng)CR片段為目的基因片段(圖2)。

2.2 AhMAPKK4基因編碼的蛋白序列分析

對(duì)獲得全長序列進(jìn)行分析表明,序列全長1 434 bp,含有3′非編碼區(qū)151 bp,5′非編碼區(qū)317 bp,編碼區(qū)全長966 bp,編碼一條含有322個(gè)氨基酸的蛋白序列。預(yù)測(cè)其分子量為36.74 kDa。氨基酸的序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)其序列中含有MAPK家族典型的特異性11個(gè)保守區(qū)域,和特異性的N端T-Loop保守基序(圖3),因此將基因命名為AhMKK4,將序列提交到GenBank,獲得序列號(hào):KP329551。目前花生野生種二倍體基因組和栽培種四倍體基因組序列均已測(cè)通,通過在PeanutBase上進(jìn)行序列BLAST,從栽培種花生基因組中發(fā)現(xiàn)10個(gè)同源序列,且序列相似性均在88%以上。

圖2 AhMKK4全長和ORF全長的PCR擴(kuò)增產(chǎn)物Fig.2 PCR products of gene full length and full ORF fragment of AhMKK4

利用MEGA軟件對(duì)來自于不同植物的MAPKK蛋白進(jìn)行分子聚類分析,構(gòu)建同源進(jìn)化樹。利用DNAMAN軟件,對(duì)不同來源的MAPKK蛋白進(jìn)行同源性分析,結(jié)果顯示 AhMKK4與已知的棉花中的GhMKK9、煙草中的NtMKK9、番茄中的 LeMKK4、大豆中的GmMKK9同源性較高,分別為64.62%、67.70%、62.91%、71.74%(圖4)。

2.3 AhMKK4基因的組織特異性和品種特異性分析

RT-qPCR檢測(cè)結(jié)果顯示,AhMKK4基因在根中高表達(dá),而在莖、花和下胚軸中表達(dá)極低,說明該基因可能只在花生根中發(fā)揮重要的作用(圖5-A)。

采用RT-qPCR檢測(cè)AhMKK4基因的表達(dá)量變化,結(jié)果表明易感病品種花育34號(hào)和花育19號(hào)AhMKK4基因的表達(dá)量明顯低于其他品種,而在感病品種開17-6中AhMKK4表達(dá)量最高,在其他幾個(gè)品種中的表達(dá)量沒有明顯差異。表明在花生的種質(zhì)資源中存在抗病基因的差異表達(dá)(圖5-B)。

2.4 AhMKK4基因的激素誘導(dǎo)以及干旱和鹽脅迫下的表達(dá)分析

在JA誘導(dǎo)下,AhMKK4基因的表達(dá)量呈先降低后升高再降低的表達(dá),在誘導(dǎo)處理12 h時(shí)表達(dá)量達(dá)到最高(圖6-A)；IAA誘導(dǎo)下,AhMKK4基因總體上表現(xiàn)為上調(diào),且在誘導(dǎo)處理8 h時(shí)表達(dá)量最高,但上調(diào)的倍數(shù)總體上較少,表明該基因可能參與IAA的激素調(diào)控網(wǎng)絡(luò),但不是關(guān)鍵節(jié)點(diǎn)(圖6-B)；ABA誘導(dǎo)下,AhMKK4表現(xiàn)為下調(diào)模式,且在誘導(dǎo)處理8 h時(shí)表達(dá)量最低,推測(cè)該基因可能參與ABA介導(dǎo)的干旱調(diào)控途徑,并可能起到負(fù)調(diào)控作用(圖6-C)；SA誘導(dǎo)下,AhMKK4基因的表達(dá)量表現(xiàn)為下調(diào)模式,且在誘導(dǎo)處理48 h表達(dá)量最低(圖6-D)。

圖3 AhMKK4與其他物種中MAPKK9蛋白質(zhì)序列的同源比較Fig.3 Alignment of the deduced AhMKK4 protein sequence with other plants MAPKKs

在PEG模擬干旱脅迫處理下AhMKK4基因表達(dá)量表現(xiàn)為下調(diào)模式,在PEG模擬干旱脅迫處理1 h時(shí)表達(dá)量最低(圖6-E)；在NaCl脅迫處理下,AhMKK4基因表達(dá)量呈先上調(diào)后下調(diào)的變化趨勢(shì),且在脅迫處理2 h時(shí)表達(dá)量最高(圖6-F)。表明AhMKK4基因在干旱和鹽脅迫下的表達(dá)模式存在差異,且對(duì)鹽脅迫更敏感。

2.5 AhMKK4蛋白亞細(xì)胞定位

為研究AhMKK4蛋白在植物細(xì)胞中的定位情況,設(shè)計(jì)引物KK4-Xma1-F和KK4-Hind3-R構(gòu)建了含有AhMKK4基因和GFP基因的pBI221融合表達(dá)載體,同時(shí)將空載體和融合載體分別轉(zhuǎn)入煙草葉片中培養(yǎng),觀察GFP基因的定位情況。結(jié)果顯示,轉(zhuǎn)入空載體的GFP在細(xì)胞的核和質(zhì)中均有定位,且AhMKK4-GFP在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中均有綠色熒光,表明AhMKK4基因可能在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中發(fā)揮重要功能(圖7)。

圖4 AhMKK4與其他物種中MAPKK蛋白質(zhì)序列的聚類分析Fig.4 Alignment and dendrogram of the deduced AnMKK4 protein sequence with other plants MAPKKs

3 討論

前人研究表明,植物中的MAPKK根據(jù)序列特征和已知的功能可以被分為A、B、C、D四組,如擬南芥中的AtMKK1、AtMKK2、AtMKK6與番茄中的LeMEK1屬于A組；擬南芥中的AtMKK3和煙草中的NtNPK2屬于B組；擬南芥中的AtMKK4、AtMKK5與棉花中的GhMKK5屬于 C組；擬南芥AtMKK7-10屬于 D組[23,35]。本研究克隆得到的AhMKK4序列含有MAPK家族特異的 11個(gè)保守結(jié)構(gòu),且與 D組的MAPKK同源性較高,達(dá)到60%以上,表明AhMPKK4屬于D組。進(jìn)一步對(duì)其序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn),該基因除了與番茄中的MKK4基因序列相似性均較高,與其他植物的MKK9序列相似性更高,猜測(cè)其可能也具有MKK9的功能。

有研究表明,植物MAPKK作為MAPK級(jí)聯(lián)信號(hào)傳遞系統(tǒng)中的關(guān)鍵節(jié)點(diǎn),容易受到多種環(huán)境的刺激,引起植物的自身免疫反應(yīng)以應(yīng)答刺激[36]。MAPKK基因家族具有組成型表達(dá)模式,在不同植物的不同組織中表達(dá)量不同[22,37]。本研究檢測(cè)了AhMKK4基因在花生不同組織中的表達(dá)變化,發(fā)現(xiàn)AhMKK4基因在根中高表達(dá),而在莖、花和下胚軸中表達(dá)量極低,這可能是由于花生的根系對(duì)土壤環(huán)境變化更為敏感,當(dāng)土壤中病原菌數(shù)量超標(biāo)或者土壤水份失調(diào)時(shí),根系最先感知并傳遞信號(hào)。此外,本研究對(duì)AhMKK4基因在不同花生種質(zhì)資源中的表達(dá)量檢測(cè)發(fā)現(xiàn),其在感病品種開17-6中表達(dá)量最高,在其他幾個(gè)品種中的表達(dá)量沒有明顯差異,表明,在花生種質(zhì)資源中存在抗病基因的差異表達(dá)。劉雪[38]在馬鈴薯不同品種中同樣證明了MKK基因存在品種間差異表達(dá)[3]。

圖5 AhMKK4基因在花生不同組織(A)和不同品種(B)中的表達(dá)分析Fig.5 The expression analysis of AhMKK4 gene in different peanut tissues(A)and different peanut varieties(B)

植物應(yīng)答環(huán)境變化過程中內(nèi)源激素水平也會(huì)隨之發(fā)生變化[39]。如AtMKK2能夠調(diào)節(jié)體內(nèi)激素水平變化[40]；GhMKK5受不同激素誘導(dǎo)時(shí),表達(dá)量存在差異[41]。本研究結(jié)果顯示,AhMKK4在JA誘導(dǎo)下,表達(dá)量在誘導(dǎo)12 h后明顯上升；在SA誘導(dǎo)下,表達(dá)量下降,說明該基因可能參與JA和SA介導(dǎo)的植物激素信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑,并可能只在根中發(fā)揮作用。

圖7 AhMKK4-GFP在煙草葉片中的亞細(xì)胞定位Fig.7 Subcellular localization of AhMKK4-GFP in the leaves of tobacco

植物MAPKK參與多種信號(hào)的傳遞,對(duì)MAPKK基因的亞細(xì)胞定位研究有利于了解其上下游級(jí)聯(lián)組分及其在信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中的作用,由于MAPKK序列N端的特殊結(jié)構(gòu),使得MAPKK的定位也不同。已有研究表明,MAPKK可以定位于細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,如本生煙中D組NbMKK1定位于細(xì)胞核中[27]；荷蘭芹(Parsley)PcMKK5定位于細(xì)胞質(zhì)中[42]；擬南芥中的AtMKK4具有葉綠體轉(zhuǎn)運(yùn)肽因而定位于葉綠體中,而AtMKK9定位于細(xì)胞核中[31]。本研究構(gòu)建了AhMKK4的GFP表達(dá)載體,在煙草的瞬時(shí)表達(dá)過程中發(fā)現(xiàn),該基因定位在細(xì)胞核和細(xì)胞質(zhì)中,與擬南芥和棉花中MKK4的定位類似,表明該基因可能在細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核中發(fā)揮作用,但該基因是否定位于葉綠體尚需進(jìn)一步驗(yàn)證。

4 結(jié)論

本研究首次從花生中克隆得到MAPKK4基因,表達(dá)分析發(fā)現(xiàn)該基因在JA、IAA和高鹽的誘導(dǎo)下表達(dá)量上調(diào),在ABA、SA、PEG模擬干旱誘導(dǎo)下表達(dá)量下調(diào),在花生根中高表達(dá),具有組織特異性,亞細(xì)胞定位于細(xì)胞質(zhì)和細(xì)胞核。本研究結(jié)果為花生抗逆育種提供了新的基因資源和材料,下一步將對(duì)該基因的功能進(jìn)行深入分析和驗(yàn)證,尤其結(jié)合不同激素表達(dá)分析結(jié)果,研究在鹽脅迫和干旱脅迫下的生物學(xué)功能。