劉斯琪

(四川省食品藥品檢驗(yàn)檢測(cè)院，四川 成都 610000)

0 引 言

納他霉素（natamycin）又名匹馬霉素，是一種多烯大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗菌素，對(duì)霉菌、酵母等真菌有顯著抑制性。因其高效的廣譜抗菌性，且不影響食品風(fēng)味，目前在全世界多達(dá)30個(gè)國(guó)家作為天然、安全的食品防腐劑與抗菌劑使用[1]。脫氫乙酸（relative deviation）可有效抑制霉菌、大腸桿菌等微生物生長(zhǎng)，是繼山梨酸、苯甲酸后作為低毒高效的新一代廣譜防腐劑，廣泛應(yīng)用于糕點(diǎn)、飲料等食品中[2-4]。

目前，食品中納他霉素或脫氫乙酸的檢測(cè)方法多為單一法檢測(cè)，主要有高效液相色譜法、氣相色譜法、液相色譜-質(zhì)譜法、分光光度法、電化學(xué)法等[5-6]。GB 2760-2014《食品安全國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)食品添加劑使用標(biāo)準(zhǔn)》中明確規(guī)定[7]，在糕點(diǎn)、果蔬汁中納他霉素最大使用量0.3 g/kg，脫氫乙酸在糕點(diǎn)、果蔬汁中最大使用量0.5 g/kg和0.3 g/kg，且牛奶等乳制品中不允許使用[8]。鑒于常見(jiàn)防腐劑納他霉素和脫氫乙酸應(yīng)用性的廣泛性，建立一種能同時(shí)測(cè)定二者含量，可在一定程度減少檢測(cè)人力、物力、時(shí)間成本。本研究選取3種常見(jiàn)食品基質(zhì)，旨在探索一種納他霉素和脫氫乙酸的同步前處理和含量檢測(cè)的分析方法。

1 材料和方法

1.1 儀器與試劑

島津LC-20A高效液相色譜儀；Mettler Toledo電子天平；heidolph振蕩器；Thermo離心機(jī)。

甲醇（色譜純，SIGMA-ALDRICH）；超純水(由Mill-Q純水器系統(tǒng)制得)；納他霉素標(biāo)準(zhǔn)品（Dr Ehrenstorfer GmbH，91.3%）；脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)品（Chemical Service，99.90%）；乙酸 (色譜純)。

糕點(diǎn)、純牛奶、果蔬汁飲料購(gòu)于本地超市。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液配制

分別稱(chēng)取經(jīng)純度換算后的納他霉素、脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)，用甲醇溶解并定容至25 mL，配制成1 000 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，保存于 4 ℃ 冰箱。臨用前分別各取母液1 mL，用甲醇稀釋至濃度為100 mg/L的中間液。再用甲醇依次稀釋?zhuān)渲瞥?.05，0.5，1，2，5，10，20 mg/L 的標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液。

1.3 樣品溶液的制備

稱(chēng)取樣品 5 g（精確至 0.01 g），加入 20 mL 甲醇，10 mL濃度為10%乙酸溶液，放入振蕩器提取15 min，取出，離心靜置(若為牛奶基質(zhì)，則另加入質(zhì)量濃度為10%的亞鐵氰化鉀溶液2滴)，取上清液過(guò)孔徑為0.22 μm有機(jī)微孔濾膜，供液相分析使用。

1.4 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18 柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇∶10% 乙酸溶液（梯度洗脫）；柱溫：30 ℃；流量：1.2 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)：305 nm；進(jìn)樣體積：10 μL。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件篩選

2.1.1 流動(dòng)相選擇

參考相關(guān)文獻(xiàn)及常用流動(dòng)相[9-11]，選取了甲醇∶水 (50∶50)，甲醇∶10% 乙酸 (60∶40)，對(duì)質(zhì)量濃度為5.0 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)品進(jìn)行分離時(shí)，發(fā)現(xiàn)甲醇∶水流動(dòng)相所產(chǎn)生的納他霉素峰形較差，甲醇∶10%乙酸能有較好峰形，因此選用甲醇∶10%乙酸為流動(dòng)相，結(jié)果見(jiàn)圖1所示。實(shí)驗(yàn)對(duì)其比例進(jìn)行多次調(diào)整，結(jié)合3種基質(zhì)雜峰影響，最終以甲醇：10%乙酸梯度洗脫進(jìn)行分離，具體比例見(jiàn)表1所示，并在篩選中發(fā)現(xiàn)3種基質(zhì)均為陰性，其中糕點(diǎn)基質(zhì)的雜峰較多，因此后續(xù)色譜條件以糕點(diǎn)基質(zhì)進(jìn)行條件確定。

圖1 流動(dòng)相種類(lèi)篩選

表1 流動(dòng)相梯度洗脫比例

2.1.2 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定

分別以1.2項(xiàng)下所制納他霉素和脫氫乙酸標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備溶液稀釋后，進(jìn)行高效液相測(cè)定，在190～800 nm范圍內(nèi)進(jìn)行全波長(zhǎng)掃描，通過(guò)3D吸收?qǐng)D譜，結(jié)合納他霉素和脫氫乙酸的共有較大吸收，最終設(shè)定檢測(cè)波長(zhǎng)為 305 nm。

2.1.3 柱溫考察

為考察柱溫變化是否顯著影響色譜峰分離效果，在2.1.1和2.1.2項(xiàng)下所確定條件，分別設(shè)置柱溫 25，30，35 ℃ 進(jìn)行試驗(yàn)，無(wú)明顯差異，以常用柱溫30 ℃為最終實(shí)驗(yàn)溫度。

2.1.4 流量選擇

以2.1.1-2.1.3項(xiàng)下所確定流動(dòng)相比例、波長(zhǎng)和柱溫，進(jìn)行流量篩選。分別以 0.8，1.0，1.2 mL/min試驗(yàn)。流量為0.8 mL/min時(shí)，脫氫乙酸與左右相鄰峰均有連接，納他霉素能良好分離；流量為1.0 mL/min時(shí)，脫氫乙酸與右側(cè)峰有少許連接，納他霉素能良好分離；流量為1.2 mL/min時(shí)，脫氫乙酸與納他霉素均能與左右兩側(cè)峰有良好分離，且出峰時(shí)間最短；因此流量設(shè)定為1.2 mL/min。不同流量分離色譜圖見(jiàn)圖2所示。

2.2 樣品制備溶媒篩選

稱(chēng)取樣品5 g，參考相關(guān)文獻(xiàn)，駱健美等人研究發(fā)現(xiàn)納他霉素在甲醇中有一定溶解度[12]，魏寶東等人發(fā)現(xiàn)其易溶于稀酸溶液[13]，pH值對(duì)納他霉素和脫氫乙酸溶解均有影響[14-15]，前處理分別采用溶媒甲醇（40 mL）、超純水（40 mL），甲醇∶水（3∶1），甲醇∶10% 乙酸（3∶1），甲醇∶0.02 mol/L 乙酸銨（3∶1），以納他霉素和脫氫乙酸回收率對(duì)5種溶媒進(jìn)行篩選，結(jié)果趨勢(shì)如圖3所示。

圖2 不同流量分離色譜圖

由圖3結(jié)果可知，納他霉素和脫氫乙酸二者在甲醇：10% 乙酸（3∶1）和甲醇∶0.02 mol/L乙酸銨（3∶1）為溶媒時(shí)，提取效果良好，其次為甲醇：水（3∶1）?？紤]色譜條件中有10%乙酸，為減少溶液配制提高效率，因此選取甲醇∶10%乙酸（3∶1）為樣品提取溶媒。糕點(diǎn)、飲料、純牛奶3種基質(zhì)，考察中發(fā)現(xiàn)，牛奶經(jīng)離心處理后依然存在過(guò)濾難問(wèn)題，因此采用加入亞鐵氰化鉀溶液（質(zhì)量濃度10%）2滴，對(duì)蛋白質(zhì)進(jìn)行物理沉淀后再微孔濾膜過(guò)濾處理[16]。

2.3 考察不同溫度對(duì)納他霉素穩(wěn)定性的影響

吸取1.2項(xiàng)下所制備的納他霉素和脫氫乙酸母液，配制成10 μg/mL的標(biāo)液，平行6份。分別稱(chēng)取糕點(diǎn)、飲料、純牛奶3種基質(zhì)，加標(biāo)量為10 μg，平行6份。將樣品按1.3項(xiàng)下處理后（每個(gè)條件平行2 份），與 10 μg/mL 的標(biāo)液分別置于 4 ℃ 冰箱、30 ℃烘箱、50 ℃烘箱中放置6 h，于測(cè)定前取出。測(cè)定結(jié)果表明3種溫度影響下，納他霉素和脫氫乙酸含量穩(wěn)定，相對(duì)偏差均小于10%。且按文中考察方法對(duì)3種基質(zhì)進(jìn)行制備，檢測(cè)結(jié)果均為陰性，如圖4所示。

圖3 不同提取溶媒的提取效果

2.4 方法線性范圍及檢出限

吸取1.2項(xiàng)下的納他霉素和脫氫乙酸混合標(biāo)準(zhǔn)品稀釋制備而成的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液 (0.05，0.5，1，2，5，10，20 μg/mL)進(jìn)行測(cè)定。以標(biāo)準(zhǔn)溶液質(zhì)量濃度（X）和峰面積（Y）制作標(biāo)準(zhǔn)曲線并得出其在0.05～20 μg/mL范圍的線性方程，結(jié)果見(jiàn)表2。

圖4 3種陰性基質(zhì)色譜圖

表2 納他霉素和脫氫乙酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)

再分別以3種基質(zhì)（糕點(diǎn)、飲料、牛奶），逐級(jí)稀釋混合標(biāo)準(zhǔn)溶液進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)3倍信噪比，得出納他霉素和脫氫乙酸的檢出限分別0.05 mg/kg和0.10 mg/kg。

2.5 考察納他霉素和脫氫乙酸的穩(wěn)定性

稱(chēng)取以糕點(diǎn)基質(zhì)為代表的陰性樣品，平行2份，加標(biāo)量為 10 μg 按 1.3 項(xiàng)下制備，進(jìn)樣體積 10 μL，分別在不同時(shí)間進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)表3，結(jié)果符合規(guī)定，說(shuō)明納他霉素和脫氫乙酸在60 h內(nèi)能保持穩(wěn)定。

表3 納他霉素和脫氫乙酸穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果（n=2）

2.6 方法回收率、重復(fù)性及精密度

在3種基質(zhì)（糕點(diǎn)、飲料、牛奶）樣品中分別添加脫氫乙酸與納他霉素在 5，10，50 mg/kg 3 個(gè)水平進(jìn)行加標(biāo)回收試驗(yàn)，每個(gè)水平設(shè)置6個(gè)平行樣，每種基質(zhì)設(shè)置2個(gè)空白樣，并計(jì)算其加標(biāo)回收率（扣除空白均值），相對(duì)偏差(RSD)均小于10%，結(jié)果如表4所示。

以糕點(diǎn)為陰性基質(zhì)代表，平行6份，加標(biāo)量為10 μg，按1.3項(xiàng)下制備，測(cè)定其回收率結(jié)果均在90%～100%間，相對(duì)偏差(RSD)均小于10%；再以其中一份，平行測(cè)定6次，相對(duì)偏差(RSD)小于2%，符合相關(guān)規(guī)定。說(shuō)明方法有較好的重復(fù)性和精密度。

表4 4種基質(zhì)中納他霉素和脫氫乙酸的加標(biāo)回收率(n=6)

3 結(jié)束語(yǔ)

本研究選取3種常見(jiàn)食品基質(zhì)，采用高效液相色譜法建立了同時(shí)測(cè)定其中納他霉素與脫氫乙酸的檢驗(yàn)方法。該方法與此兩種防腐劑國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)相比，前處理提取方法和流動(dòng)相均采用甲醇與10%乙酸溶液，操作簡(jiǎn)便且有良好的線性、回收率和相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差，縮減了試液配制種類(lèi)，進(jìn)一步提高檢驗(yàn)效率。且對(duì)納他霉素和脫氫乙酸在不同制備溫度環(huán)境下的穩(wěn)定性進(jìn)行考察，結(jié)果穩(wěn)定；對(duì)二者配制濃度為10 μg/mL標(biāo)液的穩(wěn)定性進(jìn)行了60 h內(nèi)的考察，結(jié)果穩(wěn)定，對(duì)食品中納他霉素和脫氫乙酸同時(shí)測(cè)定有一定參考意義。但該實(shí)驗(yàn)選取的食品基質(zhì)種類(lèi)有限，且除此二者外，食品常用多種防腐劑的同時(shí)測(cè)定，還有待進(jìn)一步研究。