伍利華，鐘林江，楊俊莉，張小雪，馬焓彬，劉 濤

(成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院，四川 成都 610106)

0 引 言

金蓮花系列制劑由金蓮花一味中藥制得，包括金蓮花口服液、金蓮花片、金蓮花膠囊和金蓮花顆粒，是《中國(guó)藥典》2015版一部收錄中藥單味制劑，臨床用于上呼吸道感染、咽炎、扁桃體炎等。研究發(fā)現(xiàn)，各劑型生產(chǎn)工藝參數(shù)不同，劑型有異，而功能主治現(xiàn)象卻完全相同[1]，由于制備工藝不同，藥效物質(zhì)基礎(chǔ)可能存在差異，其合理性有待評(píng)價(jià)。

中藥譜效關(guān)系是指建立在中藥指紋圖譜的研究基礎(chǔ)上，最大限度地獲取有用的化學(xué)信息，將標(biāo)示物質(zhì)與藥效結(jié)果聯(lián)合分析，為確定中藥質(zhì)量藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、制定反應(yīng)產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的控制標(biāo)準(zhǔn)而進(jìn)行的研究[2]。中藥譜效關(guān)系通過(guò)化學(xué)成分研究結(jié)合藥理研究，能夠闡明有效化學(xué)成分的整體療效及其相互間關(guān)系，構(gòu)建的藥效指紋圖譜能更有針對(duì)性的控制中藥質(zhì)量。

金蓮花化學(xué)成分復(fù)雜，多數(shù)為黃酮類化何物，主要包括葒草苷、牡荊素及其衍生物等。目前對(duì)金蓮花制劑的研究大多是對(duì)一種制劑進(jìn)行含量測(cè)定、指紋圖譜和藥理研究，未檢索到關(guān)于金蓮花4種制劑對(duì)比研究和聯(lián)合藥效的文獻(xiàn)[3-6]。中藥發(fā)揮藥效作用物質(zhì)基礎(chǔ)復(fù)雜，可能不是單一成分起效，而目前指紋圖譜也僅體現(xiàn)某一波長(zhǎng)項(xiàng)下可被檢測(cè)的物質(zhì)，僅用指紋圖譜無(wú)法表征其臨床藥效。本文采用高效液相色譜法建立金蓮花4種制劑的指紋圖譜，并以藥用生藥量為指標(biāo)，測(cè)定金蓮花4種制劑對(duì)金黃色葡萄球菌及大腸桿菌的最小抑菌生藥量。通過(guò)相關(guān)性分析，探討指紋圖譜特征峰與抑菌活性的相關(guān)性，并以此對(duì)劑型進(jìn)行再評(píng)價(jià)。

1 儀器與試藥

DZTW電子調(diào)溫電熱套（天津市靜海縣工興電器廠）；FA2004 分析電子天平（上海良平儀器儀表有限公司）；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（成都康宇科技有限公司）；麥?zhǔn)媳葷峁埽刂菔锌堤┥锟萍加邢薰荆?；DZF-6050A真空干燥箱（北京中興偉業(yè)儀器有限公司）；SHZ-DⅢ型循環(huán)水真空泵（鄭州杜甫儀器廠）；JJCJ-2FD潔凈工作臺(tái)（蘇州金凈凈化有限公司）；XFS-280手提式壓力蒸汽滅菌鍋（浙江新木醫(yī)療器械有限公司）；DH-系列電熱培養(yǎng)箱（西安禾普科技有限公司）；P230Ⅱ高效液相色譜儀（大連依利特分析儀器有限公司）。

金蓮花（購(gòu)自成都市荷花池中藥材市場(chǎng)，批號(hào)20180219），經(jīng)成都大學(xué)藥學(xué)與生物工程學(xué)院劉濤研究員級(jí)高級(jí)工程師鑒定為毛茛科金蓮花屬植物金蓮花Trollius chinensisBunge的干燥花。葒草苷對(duì)照品（批號(hào) wkq16031602，HPLC≥98.0%）、牡荊素對(duì)照品（批號(hào) wkq16031606，HPLC≥98.0%），對(duì)照品均購(gòu)自四川維克奇生物科技有限公司。磷酸（成都市科龍化工試劑廠，批號(hào) 20170951，含量≥85.0%）；甲醇、乙腈均為色譜純；其他試劑為分析純，水為怡寶純凈水。大腸桿菌、金黃色葡萄球菌，均由成都大學(xué)生物技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。

2 方法與結(jié)果

2.1 金蓮花系列制劑的制備

目前市場(chǎng)上出售的金蓮花制劑有金蓮花口服液、金蓮花片劑、金蓮花顆粒及金蓮花膠囊等，各個(gè)廠家生產(chǎn)環(huán)境、原藥材來(lái)源、設(shè)備設(shè)施各異，制備工藝參數(shù)有別，工藝規(guī)程有異，上市產(chǎn)品質(zhì)量差異較大，且可能存在藥用輔料對(duì)抑菌活性測(cè)定的影響，為減少實(shí)驗(yàn)誤差，故本實(shí)驗(yàn)未購(gòu)買已上市金蓮花系列制劑作為樣品而是按照《中國(guó)藥典》2015年版一部相應(yīng)品種項(xiàng)下的工藝參數(shù)制備。

按照《中國(guó)藥典》2015年版一部金蓮花制劑項(xiàng)下制備方法，分別制得生藥量為0.454 5 g/mL、3.017 2 g/g、2.882 8 g/g、2.916 9 g/g 的金蓮花口服液、金蓮花片、金蓮花顆粒及金蓮花膠囊。

2.2 金蓮花4種制劑的最小抑菌生藥量測(cè)定

2.2.1 金蓮花 4 種制劑供試品儲(chǔ)備液制備

以口服液為標(biāo)準(zhǔn)，根據(jù)相同生藥量，分別取金蓮花4種制劑適量，精密稱定金蓮花膠囊、片及顆粒 4.045 1 g、4.288 7 g、4.227 5 g 于 25 mL 容量瓶中，加純凈水定容搖勻制得 0.161 8 g/mL、0.171 5 g/mL、0.169 1 g/mL 的供試品儲(chǔ)備液。

2.2.2 營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基和營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基平板的配制

稱取營(yíng)養(yǎng)肉湯粉末約 3 g，加入 100 mL蒸餾水，攪拌溶解即得營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基。稱取牛肉浸膏0.6 g、蛋白胨2 g、瓊脂 3～4 g、氯化鈉1 g，加水200 mL，加熱攪拌溶解即得。取滅菌培養(yǎng)皿，倒入15 mL培養(yǎng)基，冷卻，即得牛肉膏蛋白胨平板，備用。

2.2.3 菌液配制

取兩支滅菌試管加入適量無(wú)菌水，冷卻至室溫，接種環(huán)灼燒后分別挑取適量大腸桿菌和金黃色葡萄球菌，與麥?zhǔn)媳葷峁鼙葘?duì)，制成 1.5×108CFU/mL的菌液，備用。

2.2.4 最小抑菌生藥量測(cè)定

取編號(hào)為1～11的試管，每支試管按供試品儲(chǔ)備液：培養(yǎng)基體積比1∶1加入營(yíng)養(yǎng)肉湯培養(yǎng)基，1～5號(hào)為大腸桿菌組（5號(hào)不加藥液，為陰性對(duì)照），6號(hào)為空白（不加菌液），7～11為金黃色葡萄球菌組（11號(hào)不加藥液，為陰性對(duì)照）；分別按試管二倍稀釋法制得 1～5號(hào)大腸桿菌試管組和7～11號(hào)金黃色葡萄球菌試管組；加入50 μL菌液、棉塞塞住試管口于37 ℃下培養(yǎng)24 h后，取2.2.2所得平板劃線接種，37 ℃培養(yǎng)24 h，測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表1。結(jié)果表明金蓮花口服液抑菌生藥量最小，抑菌效果最優(yōu)。

表1 金蓮花系列制劑抑菌生藥量

2.3 金蓮花系列制劑指紋圖譜的建立

2.3.1 供試品溶液的制備

精密量取2.2.1項(xiàng)下供試品儲(chǔ)備液1.00 mL于50 mL容量瓶中，加純凈水稀釋至刻度，搖勻，即得供試品溶液。

2.3.2 對(duì)照品溶液的制備

精密稱定牡荊素對(duì)照品5.61 mg于25 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得224.4 μg/mL的牡荊素貯備液。精密稱定葒草苷對(duì)照品10.00 mg于50 mL容量瓶中，加甲醇定容，搖勻即得200.0 μg/mL的葒草苷貯備液。精密量取牡荊素貯備液2.00 mL、葒草苷貯備液1.00 mL，混合至5 mL容量瓶中，加甲醇定容搖勻得 97.92 μg/mL 牡荊素、40 μg/mL 葒草苷混合對(duì)照品溶液，作為混合對(duì)照品指認(rèn)色譜峰。

2.3.3 色譜條件

Supersil C18 色譜柱（4.6 mm×250 mm，5 μm），流動(dòng)相為乙腈（A）-0.2% 磷酸（B）；體積流量1.0 mL/min，進(jìn)樣體積 10 μL；檢測(cè)波長(zhǎng) 220 nm；柱溫 30 ℃，梯度洗脫程序見(jiàn)表2。

表2 梯度洗脫條件

2.3.4 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取金蓮花口服液按2.3.1項(xiàng)方法制備供試品溶液，將同一供試品溶液分別于 0，2，4，6，8，10，12 h進(jìn)樣分析，計(jì)算其各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，其RSD值分別小于3.00%和2.00%，結(jié)果表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定，詳見(jiàn)表3。

2.3.5 精密度試驗(yàn)

取金蓮花口服液按2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，同一供試品溶液重復(fù)進(jìn)樣6次，計(jì)算其各共有峰相對(duì)峰面積和相對(duì)保留時(shí)間，其RSD值分別小于2.90%和1.20%，結(jié)果表明儀器精密度良好，詳見(jiàn)表4。

2.3.6 重復(fù)性試驗(yàn)

取金蓮花口服液按2.3.1項(xiàng)方法平行制備供試品溶液6份，進(jìn)樣分析，計(jì)算其各共有峰相對(duì)峰面積及相對(duì)保留時(shí)間，其RSD值分別小于2.00%和1.00%。結(jié)果表明供試品溶液重復(fù)性良好，詳見(jiàn)表5。

表4 精密度實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.7 指紋圖譜的建立

取金蓮花4種制劑，按2.3.1項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3.3項(xiàng)下色譜方法進(jìn)行測(cè)定，通過(guò)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（藥典委員會(huì)2004A版）”對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析，確定了13個(gè)共有峰。金蓮花4種制劑指紋圖譜如圖1～圖4所示。經(jīng)對(duì)照品HPLC圖譜指認(rèn)，確認(rèn)10號(hào)和12號(hào)峰分別為葒草苷和牡荊素?；旌蠈?duì)照品圖譜見(jiàn)圖5。

表5 重復(fù)性實(shí)驗(yàn)結(jié)果

圖1 金蓮花口服液HPLC指紋圖譜

圖2 金蓮花片HPLC指紋圖譜

3 金蓮花4種制劑HPLC指紋圖譜相似度分析

圖3 金蓮花膠囊HPLC指紋圖譜

圖4 金蓮花顆粒HPLC指紋圖譜

通過(guò)“中藥色譜指紋圖譜相似度評(píng)價(jià)系統(tǒng)（藥典委員會(huì)2004A版）”對(duì)金蓮花4種制劑指紋圖譜進(jìn)行相似度分析，以金蓮花口服液為對(duì)照指紋圖譜，色譜峰自動(dòng)匹配；結(jié)果表明金蓮花顆粒、金蓮花膠囊、金蓮花片的相似度分別為0.996、0.980、0.978。譜圖見(jiàn)圖6。S2為金蓮花口服液對(duì)照譜圖，S1、S3、S4分別為金蓮花顆粒、金蓮花片及金蓮花膠囊。

4 金蓮花系列制劑譜-效相關(guān)性分析

文獻(xiàn)研究表明[7]，金蓮花中抑菌活性成分為葒草苷，在金蓮花系列制劑指紋圖譜中，10號(hào)峰經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)為葒草苷，且分離度良好，故選擇金蓮花系列制劑指紋圖譜中10號(hào)峰為參照峰，其相對(duì)峰面積比值為1，計(jì)算金蓮花系4種制劑指紋圖譜中共有色譜峰的相對(duì)峰面積。采用“Statistical Product and Service Solutions”軟件進(jìn)行相關(guān)性分析[8-9]，得到各個(gè)共有峰與抑菌作用的相關(guān)性。表6為金蓮花制劑指紋圖譜共有峰面積相對(duì)峰面積與抑菌生藥量的相關(guān)性分析結(jié)果，由2.2.4可知，所需的抑菌生藥量越低，其抑菌活性越強(qiáng)。由表可知峰1、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12 與抑菌生藥量成負(fù)相關(guān)，即與抑菌活性成正相關(guān)，峰2、13與抑菌活性成負(fù)相關(guān)。其中，峰1、7、8、9、11對(duì)金黃色葡萄球菌抑菌作用相關(guān)性與其他峰相比較有顯著性差異（P＜0.05），峰 3（P＜0.05）、峰 12（P＜0.01）對(duì)大腸桿菌的抑菌作用相關(guān)性也有顯著差異。12號(hào)峰經(jīng)對(duì)照品指認(rèn)為牡荊素，具有一定抗炎作用[10]。

圖5 混合對(duì)照?qǐng)D譜

圖6 金蓮花四種制劑HPLC指紋圖譜相似度分析

5 結(jié)束語(yǔ)

藥物是臨床用于預(yù)防治療疾病的物質(zhì)，理想的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)能夠控制藥物的安全性和有效性，但目前中藥質(zhì)量的控制方法、評(píng)價(jià)指標(biāo)以及標(biāo)準(zhǔn)與中藥的有效性關(guān)聯(lián)不強(qiáng)，缺少能夠反映中藥有效性的質(zhì)量控制體系。中藥譜效關(guān)系的建立可以確定中藥藥效物質(zhì)基礎(chǔ)、為制定反映產(chǎn)品內(nèi)在質(zhì)量的控制標(biāo)準(zhǔn)提供依據(jù)。

目前譜效分析研究多應(yīng)用于中藥材及中藥注射液化學(xué)指紋圖譜與體外活性的相關(guān)性，未發(fā)現(xiàn)采用譜-效關(guān)系對(duì)中藥系列制劑進(jìn)行再評(píng)價(jià)的研究[11-13]，本文通過(guò)對(duì)金蓮花系列制劑的譜-效研究，發(fā)現(xiàn)了在本色譜條件下，峰1、7、8、9、11對(duì)金黃色葡萄球菌有顯著的抑菌作用，峰3與峰12對(duì)大腸桿菌的抑菌也有顯著作用，表明在生產(chǎn)工藝及質(zhì)量控制過(guò)程中，應(yīng)著重地對(duì)這7個(gè)峰進(jìn)行重點(diǎn)關(guān)注。由于中藥的功能主治多樣，構(gòu)建的譜效模型能否闡明藥物所有活性的物質(zhì)基礎(chǔ)有待進(jìn)一步研究。

表6 金蓮花系列制劑指紋圖譜共有峰相對(duì)峰面積及與抑菌生藥量相關(guān)性1)-3)

本文通過(guò)對(duì)金蓮花系列制劑化學(xué)指紋圖譜建立與體外抑菌活性測(cè)定，綜合譜效相關(guān)性，結(jié)果表明金蓮花口服液劑型優(yōu)于金蓮花顆粒、金蓮花片和金蓮花膠囊，即不同的生產(chǎn)制備工藝對(duì)各制劑化學(xué)成分有一定影響，從而出現(xiàn)體外抑菌活性出現(xiàn)差異。藥物的活性成分需進(jìn)入血液后才能發(fā)揮作用，本研究采用體外生物活性測(cè)定，藥效指標(biāo)不能完全反映對(duì)人體藥理效應(yīng)，后續(xù)研究將建立動(dòng)物模型測(cè)定金蓮花制劑體內(nèi)生物活性，我們目前僅指認(rèn)兩個(gè)色譜峰，后續(xù)將采用液質(zhì)聯(lián)用等技術(shù)對(duì)其他色譜峰進(jìn)行分析指認(rèn)；金蓮花抗菌譜較廣，后續(xù)研究將對(duì)金葡菌和大腸桿菌之外的細(xì)菌（如肺炎鏈球菌等）展開(kāi)研究，較為全面地對(duì)4種劑型的適應(yīng)癥進(jìn)行再評(píng)價(jià)研究。