王子璇 靳亞軍 張泗舉 欒維江

摘 ? ?要：水稻成花素家族基因在水稻的開(kāi)花結(jié)實(shí)過(guò)程中發(fā)揮重要作用。水稻基因組中共有19個(gè)成花素相關(guān)基因，其中Hd3a和RFT1基因已被證實(shí)能夠促進(jìn)水稻抽穗開(kāi)花，其余成花素成員功能未知。本文針對(duì)水稻成花素家族成員OsDTH11基因，基于CRISPR/Cas9技術(shù)構(gòu)建了基因編輯載體，并通過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法成功獲得了該基因的敲除突變體。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)了2種類(lèi)型的突變體，一種是純合的62 bp缺失突變體，另一種是31 bp缺失的雜合突變體。通過(guò)自交分離分別獲得兩種類(lèi)型穩(wěn)定遺傳的純合突變體材料，為OsDTH11基因的生物學(xué)功能與水稻開(kāi)花分子機(jī)制研究奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞：水稻;突變體;OsDTH11;CRISPR/Cas9

中圖分類(lèi)號(hào)：S511 ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2019.11.001

Abstract： The florigen family genes play an important role for the rice flowering. There are 19 members predicted in the rice genome. In these members， Hd3a and RFT1 were identified and characterized as florigen to promote rice flowering. The function of the rest of members remained unknown. In this study， we constructed the CRISPR/Cas9 editing vector of OsDTH11， a member of the florigen family gene， and introduced it into rice callus to produce the editing mutants by Agrobacterium-mediated transformation method. Further sequencing analysis confirmed that the obtained mutants had two types of mutation. One type of mutation was a homozygous 62 bp deletion in the editing mutant. The other was a heterozygous 31 bp deletion in the editing mutant. Finally， we obtained two kinds of homozygous mutants by self-fertilization， and these two kinds of mutation could stablely transmit to the next generation. These mutants laid a foundation for the functional study of OsDTH11 gene.

Key words： rice; mutant; OsDTH11; CRISPR/Cas9

水稻抽穗開(kāi)花是水稻生產(chǎn)實(shí)踐中的重要農(nóng)藝性狀，對(duì)水稻產(chǎn)量有著重要影響。目前研究表明，水稻的抽穗開(kāi)花受多種基因表達(dá)調(diào)控通路的共同影響，其中成花素基因家族在這一過(guò)程中扮演重要角色。成花素基因編碼的磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白（Phosphatidyl ethanolamine-binding protein，PEBP），是一類(lèi)可溶性的小分子球狀蛋白，由中央較大的β-折疊和兩側(cè)較小的β-折疊及α-螺旋形成陰離子結(jié)合口袋，能夠識(shí)別和結(jié)合磷酸化氨基酸殘基，和磷脂酰乙醇胺（Phosphatidyl ethanolamine）結(jié)合[1-2]。PEBP蛋白分布廣泛，存在于從酵母到哺乳動(dòng)物的多個(gè)物種中[3-5]。水稻基因組中共發(fā)現(xiàn)19個(gè)PEBP基因[1]，其中Hd3a及RFT1是兩個(gè)功能明確的水稻成花素基因，可以促進(jìn)水稻的抽穗[6]。成花素Hd3a及RFT1首先在葉片中表達(dá)，然后長(zhǎng)距離轉(zhuǎn)運(yùn)到莖頂端分生組織后，在細(xì)胞質(zhì)中與其受體14-3-3蛋白結(jié)合，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞核中與OsFD1轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合形成成花素激活復(fù)合體（Florigen activation complex， FAC），誘導(dǎo)下游的花分生組織特異性基因OsMADS14及OsMADS15的表達(dá)，從而促進(jìn)水稻的開(kāi)花[6-7]。

創(chuàng)制突變體是基因功能研究的重要手段。傳統(tǒng)的突變體創(chuàng)制方法主要通過(guò)理化誘變、T-DNA片段插入、轉(zhuǎn)座子序列插入等方法。這些方法費(fèi)時(shí)費(fèi)功，不能定向產(chǎn)生某一確定基因的突變體材料。近年來(lái)，隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，對(duì)于基因組序列已知的物種，可針對(duì)某一特定的基因，創(chuàng)制相應(yīng)的編輯突變體。目前基因編輯方法主要包括ZFN，TALEN，CRISPR/Cas9，其中CRISPR/Cas9最為便捷高效[8]。CRISPR/Cas9的作用機(jī)制是由gRNA與Cas9蛋白組成復(fù)合體實(shí)現(xiàn)的，gRNA負(fù)責(zé)定位與其有互補(bǔ)關(guān)系的DNA雙鏈，Cas9蛋白負(fù)責(zé)切割DNA雙鏈產(chǎn)生雙鏈斷裂（Double strand breaking， DSB），經(jīng)非同源末端連接修復(fù)后，導(dǎo)致堿基的插入或缺失突變。由于CRISPR/Cas9技術(shù)操作簡(jiǎn)單，效率較高，目前已被廣泛地應(yīng)用于各類(lèi)生物中進(jìn)行基因編輯。本研究采用CRISPR/Cas9技術(shù)對(duì)水稻成花素基因家族中未知功能基因OsDTH11（Date to heading 11， DTH11）進(jìn)行敲除，產(chǎn)生功能缺失的突變體，并通過(guò)自交分離獲得穩(wěn)定遺傳的純合突變體材料。本研究結(jié)果為水稻成花素基因的功能研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)，以期全面揭示水稻成花素基因家族在開(kāi)花分子調(diào)控中扮演的角色。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

本研究以粳稻品種中花11（Oryza sativa spp.japonica）為受體材料，經(jīng)過(guò)農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法，產(chǎn)生CRISPR/Cas9編輯突變體材料。

1.2 CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)設(shè)計(jì)

從水稻基因組數(shù)據(jù)庫(kù)（http：//rice.plantbiology.msu.edu/）獲得OsDTH11基因組序列和編碼序列。利用CRISPR/Cas9靶位點(diǎn)在線(xiàn)設(shè)計(jì)平臺(tái)http：//skl.scau.edu.cn/[9]，設(shè)計(jì)靶位點(diǎn)。設(shè)計(jì)原則為：從目的基因的CDS序列中，查找符合GN19NGG的序列。其中GN19為20個(gè)堿基的靶點(diǎn)序列，NGG（N表示任意堿基）為識(shí)別靶序列的原初間隔序列毗鄰基序（Protospacer adjacent motif， PAM）。優(yōu)選靶位點(diǎn)位于編碼序列5端，GC含量大于50%，且與潛在脫靶位點(diǎn)的差異至少在3個(gè)堿基以上，以保證編輯的特異性，避免產(chǎn)生脫靶效應(yīng)。

1.3 CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

具體分為gRNA表達(dá)載體與CRISPR/Cas9-gRNA表達(dá)載體的構(gòu)建兩個(gè)步驟。第一步是構(gòu)建gRNA的表達(dá)載體。（1）將靶點(diǎn)加上接頭序列，合成兩條24 nt的引物T-F和T-R。將引物T-F和引物T-R溶解，終濃度為10 μmol·L-1，各取10 μL加到PCR管，PCR儀中95 ℃孵育10 min，緩慢降至室溫，獲得寡聚二聚體。（2）用非典型Ⅱ型核糖核酸內(nèi)切酶BbsⅠ切割空載體pOsU6SK，回收載體骨架。（3）將獲得寡聚二聚體與回收的pOsU6SK載體骨架，用T4 DNA連接酶于16 ℃水浴鍋中過(guò)夜連接。（4）將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)，挑選單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證及測(cè)序分析，獲得含有靶點(diǎn)的gRNA表達(dá)載體pOsU6SK-T1/T2。

第二步是構(gòu)建最終能在植物中表達(dá)的雙元載體。（1）用KpnⅠ和Hind III酶切第一步構(gòu)建好的pOsU6SK-T1/T2質(zhì)粒，回收gRNA表達(dá)盒;接著用Hind Ⅲ和EcoRⅠ酶切含有Cas9片段的pCas9SK質(zhì)粒，回收Cas9的表達(dá)盒;然后用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切pCAMBIA1300雙元載體，回收載體骨架。（2）將回收的3個(gè)片段用T4 DNA連接酶于16 ℃水浴鍋中過(guò)夜連接，經(jīng)轉(zhuǎn)化，挑選單克隆進(jìn)行PCR驗(yàn)證及酶切驗(yàn)證，獲得最終可以轉(zhuǎn)化水稻的雙元重組表達(dá)載體。

1.4 目的基因編輯突變體的獲得與分子鑒定

將構(gòu)建好的CRISPR/Cas9-gRNA表達(dá)載體電擊轉(zhuǎn)化至農(nóng)桿菌菌株EHA105中，采用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的遺傳轉(zhuǎn)化方法轉(zhuǎn)入水稻的愈傷組織中，獲得轉(zhuǎn)基因植株，具體操作方法參考Hiei等[10]論文中所述。將獲得的轉(zhuǎn)基因植株移栽至試驗(yàn)田中種植，植株復(fù)壯后采集單株葉片，用CTAB法提取基因組DNA作為模版，用載體中抗性標(biāo)記基因潮霉素檢測(cè)轉(zhuǎn)基因植株，判斷所構(gòu)建的載體是否轉(zhuǎn)入到水稻中。PCR擴(kuò)增引物為Hyg-F（5-GGAGCATATACGCCCGGAGT-3）和Hyg-R（5-GTTTATCGGCACTTTGCATCG-3）。擴(kuò)增條件為： 94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，運(yùn)行30次循環(huán);72 ℃延伸7 min，最后4 ℃保存。

1.5 編輯突變體的突變位點(diǎn)測(cè)序分析

參照OsDTH11基因的基因組序列，分別在靶點(diǎn)的上下游約250 bp處設(shè)計(jì)一對(duì)檢測(cè)引物，對(duì)包含了靶點(diǎn)的區(qū)段進(jìn)行PCR擴(kuò)增，分析目的基因OsDTH11的突變位點(diǎn)與類(lèi)型。所用引物序列為OsDTH11-C-F（5-GCACTGGAATGACGTAGCAC-3）和OsDTH11-

C-R（5-TAAGTACTCTCTCAACGTCG-3），擴(kuò)增條件為： 94 ℃預(yù)變性4 min;94 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，運(yùn)行30次循環(huán);72 ℃延伸7 min。最后4 ℃保存。擴(kuò)增產(chǎn)物先進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，以檢測(cè)擴(kuò)增產(chǎn)物質(zhì)量及片段大小，然后將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序。對(duì)出現(xiàn)編輯的測(cè)序結(jié)果，用雙鏈解碼工具h(yuǎn)ttp：//dsdecode.scgene.com或者h(yuǎn)ttp：//skl.scau.edu.cn/dsdecode/進(jìn)行解碼分析。對(duì)自交后代純合突變體的鑒定采用相同的引物和方法進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 靶位點(diǎn)的選擇

水稻OsDTH11基因結(jié)構(gòu)如圖1所示。OsDTH11包含4個(gè)外顯子和3個(gè)內(nèi)含子，編碼序列總長(zhǎng)度為543 bp，編碼180個(gè)氨基酸。根據(jù)靶點(diǎn)設(shè)計(jì)原則以及OsDTH11基因結(jié)構(gòu)特點(diǎn)，在第1個(gè)外顯子上設(shè)計(jì)了T1（5-GTCGGCGAACAGCCTGGTGC-3）和T2（5-GTTCTCGCCGGAGGTGACGC-3）2個(gè)靶點(diǎn)。通過(guò)BLAST比對(duì)分析顯示，2個(gè)靶點(diǎn)特異性好，潛在脫靶率低。

2.2 目的基因CRISPR/Cas9表達(dá)載體的構(gòu)建

CRISPR/Cas9在植物中的表達(dá)載體的骨架是pCAMBIA1300，表達(dá)載體需要裝載gRNA與Cas9表達(dá)盒。首先將靶點(diǎn)序列T1和T2裝載到gRNA的表達(dá)載體pOsU6SK上，用M13F和T-R引物對(duì)進(jìn)行菌斑PCR擴(kuò)增，得到372 bp的目的條帶（圖2A）;提取質(zhì)粒后，用KpnⅠ和Hind III酶切驗(yàn)證，得到475 bp的gRNA表達(dá)盒（圖2B），說(shuō)明T1及T2靶點(diǎn)已成功裝載到pOsU6SK載體中，后經(jīng)測(cè)序證明兩個(gè)靶點(diǎn)裝載正確。

將上述構(gòu)建的重組載體用KpnⅠ和Hind III酶切回收gRNA表達(dá)盒，再將Cas9的表達(dá)盒從p35S-Cas9-Nos-SK載體上用Hind III和EcoRⅠ雙酶切回收，同時(shí)將植物雙元載體pCAMBIA1300骨架用KpnⅠ和EcoRⅠ酶切回收。將上述3個(gè)回收后片段用瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)（圖2C），用T4 DNA連接酶將3個(gè)片段連接，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞得到最終的表達(dá)載體，挑取單克隆進(jìn)行酶切驗(yàn)證，目的條帶大小符合預(yù)期（圖2D），表明帶有靶點(diǎn)的gRNA及Cas9表達(dá)盒都成功連入植物雙元載體pCAMBIA1300中，獲得了最終的CRISPR/Cas9重組載體。

2.3 編輯突變體的獲得和分子鑒定

將含有T1靶點(diǎn)的重組載體pCAMBIA1300-Cas9-T1和含有T2靶點(diǎn)的重組載體pCAMBAI1300-Cas9-T2，分別轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌菌株EHA105，侵染水稻品種中花11的愈傷組織。在含有潮霉素的篩選培養(yǎng)基上培養(yǎng)4周后，挑選生長(zhǎng)緊實(shí)，顏色黃亮的愈傷顆粒移入分化培養(yǎng)基誘導(dǎo)分化。分化出的小苗經(jīng)生根誘導(dǎo)后，得到T0代轉(zhuǎn)基因植株。本研究共獲得了T1靶點(diǎn)CRISPR/Cas9載體轉(zhuǎn)化的17個(gè)獨(dú)立株系的基因編輯植株，未知原因未獲得T2靶點(diǎn)的基因編輯植株。提取17株基因編輯植株的基因組DNA作為PCR擴(kuò)增模板，用潮霉素抗性篩選標(biāo)記基因引物Hyg-F和Hyg-R進(jìn)行PCR擴(kuò)增檢測(cè)。結(jié)果表明，獲得的17株基因編輯植株均為潮霉素抗性基因陽(yáng)性植株（圖3）。

2.4 編輯突變體鑒定與測(cè)序分析

為了驗(yàn)證轉(zhuǎn)基因陽(yáng)性植株的靶位點(diǎn)是否發(fā)生了編輯突變，對(duì)所有的17株T0代轉(zhuǎn)基因植株進(jìn)行了靶位點(diǎn)測(cè)序分析，按預(yù)期設(shè)計(jì)，PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)度為605 bp。測(cè)序結(jié)果表明，17株T1靶點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因植株中有2株在靶點(diǎn)位置的序列發(fā)生了變異，將2株突變體分別命名為m1、m2。突變體m1在進(jìn)行PCR擴(kuò)增時(shí)，擴(kuò)增產(chǎn)物長(zhǎng)度比預(yù)期設(shè)計(jì)的片段?。▓D4A）。經(jīng)測(cè)序分析為純合大片段缺失，兩條同源染色體均從T1靶點(diǎn)開(kāi)始進(jìn)行編輯，缺失了64 bp（圖4A）。突變體m2經(jīng)測(cè)序出現(xiàn)疊峰，經(jīng)解碼分析為雜合突變，一條同源染色體缺失31 bp片段，另一條同源染色體與野生型序列一致（圖4B）。

為了驗(yàn)證T0代m1及m2突變體是否確為純合突變體和雜合的突變體，并獲得m2突變體的純合編輯突變體，我們收獲了T0代突變體的種子，種植在試驗(yàn)田中，獲得了T1代的植株。對(duì)T1代單株測(cè)序檢測(cè)表明：m1突變體T1代植株全部為大片段缺失突變，沒(méi)有分離，可以穩(wěn)定遺傳，說(shuō)明其的確為純合突變體。m2突變體T1代植株經(jīng)PCR檢測(cè)后發(fā)現(xiàn)，發(fā)生了基因型分離。20株T1代植株中6株（2、5、10、13、15、17）為純合31 bp缺失，6株（8、9、11、14、16、20）擴(kuò)增出了預(yù)期的605 bp和574 bp的兩條帶，仍為雜合突變，其余8株為野生型植株，只擴(kuò)增出了605 bp的目的條帶（圖4C），說(shuō)明T0代m2突變體的確是雜合突變，通過(guò)自交分離出純合的編輯突變體，而且可以穩(wěn)定遺傳到下一代。

進(jìn)一步分析突變體在氨基酸序列上的變化，發(fā)現(xiàn)m1突變體缺少起始密碼子，無(wú)法正常開(kāi)始翻譯蛋白質(zhì)。m2純合突變體由于缺失31 bp片段導(dǎo)致移碼突變，翻譯至第15個(gè)密碼子時(shí)出現(xiàn)終止密碼子，翻譯提前終止。

綜上，我們通過(guò)CRISPR/Cas9技術(shù)成功的敲除了成花素家族成員OsDTH11基因，產(chǎn)生了兩種類(lèi)型的突變體。兩種類(lèi)型的突變體都可能導(dǎo)致OsDTH11基因的功能缺失，為進(jìn)一步研究OsDTH11基因的功能提供了材料。后續(xù)針對(duì)純合突變體材料的表型分析將進(jìn)一步揭示OsDTH11基因的生物學(xué)功能。

3 結(jié)論與討論

PEBP家族廣泛存在于擬南芥、水稻、小麥、玉米、楊樹(shù)、番茄、大豆等高等植物中。對(duì)這些物種PEBP家族成員的氨基酸序列聚類(lèi)分析，可以明顯的分成FT-like、TFL-like和MFT-like三個(gè)亞家族[11]。這3個(gè)亞家族的功能已有了分化。如擬南芥的FT和TFL1、水稻的Hd3a及RCN、番茄的SP和SFT基因兩兩功能相反，分別為擬南芥、水稻及番茄的成花素和反成花素，促進(jìn)或抑制植物開(kāi)花[12-14]。最新的研究發(fā)現(xiàn)，過(guò)量表達(dá)OsFTL10可以增加水稻的耐旱性，表明PEBP家族存在花期調(diào)控以外的其他生長(zhǎng)發(fā)育功能[15]，因而對(duì)其他成員的研究有著重要的意義。

為了解析OsDTH11的功能，本研究設(shè)計(jì)了T1和T2兩個(gè)靶點(diǎn)，利用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行突變體的創(chuàng)制，共獲得了T1靶點(diǎn)CRISPR/Cas9轉(zhuǎn)化的17株T0代轉(zhuǎn)基因植株。測(cè)序分析表明，有2個(gè)轉(zhuǎn)基因植株的靶位點(diǎn)區(qū)段發(fā)生突變，突變率為12%，和以前報(bào)道的基因編輯效率相似?；蚓庉嫷男屎皖?lèi)型，跟表達(dá)載體的效率、靶點(diǎn)的序列、靶基因在染色體上的位置、T-DNA整合到染色體上的位置等緊密相關(guān)。Ma等[17]研究表明，靶點(diǎn)序列與gRNA的骨架如果形成連續(xù)7個(gè)以上堿基對(duì)的互補(bǔ)，會(huì)嚴(yán)重影響打靶的效率。因此，不同的基因或選擇的不同的靶點(diǎn)，編輯效率會(huì)有所不同。CRISPR/Cas9所導(dǎo)致的突變類(lèi)型，一般是位于PAM前4～8 bp處發(fā)生數(shù)個(gè)堿基的缺失或插入，不同靶點(diǎn)的突變效率也有差異[16]，本研究中獲得了兩個(gè)不同大片段缺失類(lèi)型，通過(guò)自交并進(jìn)行測(cè)序分析發(fā)現(xiàn)這兩個(gè)突變體都可以穩(wěn)定遺傳。本研究獲得的兩種基因編輯突變株均阻礙蛋白質(zhì)的正常翻譯，導(dǎo)致OsDTH11基因功能的喪失，為進(jìn)一步揭示其生物學(xué)功能提供了可靠的突變體材料。

參考文獻(xiàn)：

[1]CHARDON F，DAMERVAL C. Phylogenomic analysis of the PEBP gene family in cereals[J].Journal of ?molecular evolution，2005，61：579-590.

[2]SERRE L，VALLEE B，BUREAUD N，et al. Crystal structure of the phosphatidylethanolamine-binding protein from bovine brain： a novel structural class of phospholipid-binding proteins[J].Structure，1998，6（10）：1255-1265.

[3]ROBINSON L C，TATCHELL K.TFS1： a suppressor of cdc25 mutations in Saccharomyces cerevisiae[J].Molecular genetics and genomics，1991，230：241-250.

[4]PERRY A C F，HALL L，BELL A E，et al. Sequence analysis of a mammalian phospholipid-binding protein from testis and epididymis and its distribution between spermatozoa and extracellular secretions[J].Biochemical journal，1994，301：235-242.

[5]PIKIELNY C W，HASAN G，ROUYER F，et al. Members of a family of Drosophila putative odorant-binding proteins are expressed in different subsets of olfactory hairs[J].Neuron，1994，12：35-49.

[6]KOMIYA R，IKEGAMI A，TAMAKI S，et al.Hd3a and RFT1 are essential for flowering in rice[J].Development，2008，135（4）：767-774.

[7]TAOKA K， OHKI I， TSUJI H，et al. 14-3-3 proteins act as intracellular receptors for rice Hd3a florigen[J].Nature，2011，476：332-338.

[8]張泗舉，欒維江.基因編輯技術(shù)原理及其在動(dòng)植物研究中的應(yīng)用[J].天津師范大學(xué)學(xué)報(bào)，2019，39（3）：1-9.

[9]XIE X，MA X，ZHU Q， et al. CRISPR-GE：a convenient software toolkit for CRISPR-based genome editing[J].Molecular plant，2017，10（9）：1246-1249.

[10]HIEI Y，OHTA S，KOMARI T， et al. Efficient transformation of rice （Oryza sativa L.） mediated by Agrobacterium and sequence analysis of the boundaries of the T-DNA[J].Plant journal，1994， 6（2）：271-282.

[11]KARLGREN A，GYLLENSTRAND N，KALLMAN T， et al. Evolution of the PEBP gene family in plants： functional diversification in seed plant evolution[J].Plant physiology，2011，156：1967-1977.

[12]KOBAYASHI Y，KAYA H，GOTO K，et al. A pair of related genes with antagonistic roles in mediating flowering signals[J].Science，1999，286：1960-1963.

[13]KANEKO-SUZUKI M，KURIHARA-ISHIKAWA R，OKUSH-ITA-TERAKAWA C， et al.TFL1-like proteins in rice antagonize rice FT-like protein inflorescence development by competition for complex formation with 14-3-3 and FD[J].Plant cell and physiology，2018，59（3）：458-468.

[14]SHALIT A， ROZMAN A， GOLDSHMIDT A， et al. The flowering hormone florigen functions as a general systemic regulator of growth and termination[J].Proceedings of the national?academy of science，2009，106（20）：8392-8397.

[15]FANG M，ZHOU Z，ZHOU X， et al. Overexpression of?OsFTL10 induces early flowering and improves drought tolerance in Oryza sativa L.[J].Peer J，2019，7：e6422 http：//doi.org/10.7717/peerj.6422.

[16]SHAN Q， WANG Y， LI J，et al. Targeted genome modification of crop plants using a CRISPR-Cas system[J].Nature biotechnology， 2013，31（8）：686-688.

[17]MA X，ZHANG Q，ZHU Q， et al. A robust CRISPR/Cas9 system for convenient， high-efficiency multiplex genome editing in monocot and dicot plants[J].Molecular plant，2015，8： 1274-1284.