李 佳，曹先梅，劉立云，牛啟祥

（中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所，海南文昌 571339）

檳榔 (Areca catechu L.) 為棕櫚科檳榔屬多年生植物，是重要的熱帶經(jīng)濟(jì)作物，具有抗氧化、抗菌和助消化等重要的藥用價值[1]。近年來，隨著生產(chǎn)上氮、磷、鉀化肥用量的增加和有機肥用量的減少，檳榔葉片缺鎂現(xiàn)象在海南檳榔主產(chǎn)區(qū)普遍存在[2]，且呈逐年加重的趨勢，已成為阻礙檳榔產(chǎn)量和品質(zhì)提高的重要因素之一。鎂是植物葉綠體的重要組成成分，對維持葉綠體的結(jié)構(gòu)有著舉足輕重的作用[3]。同時，鎂還是植物體內(nèi)多種酶的活化劑，在植物進(jìn)行光合作用[4]、呼吸作用[5]、糖酵解、三羧酸循環(huán)[6]等過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。目前有關(guān)鎂對植物光合特性的研究主要集中在龍眼[7]、菜豆[8]、菜薹[9]、葡萄[10]、水稻[11]和臍橙[12]等方面，研究表明，在缺鎂狀態(tài)下，植物的光合色素含量下降，同時葉綠體結(jié)構(gòu)會受到破壞，從而導(dǎo)致凈光合速率和葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)[Fv/Fm和Y(Ⅱ)]的降低。目前有關(guān)鎂對檳榔光合特性以及葉綠體結(jié)構(gòu)的影響尚未見報道。因此，本試驗以檳榔幼苗為材料，研究不同供鎂水平對檳榔葉綠素?zé)晒馓匦?、葉綠體超微結(jié)構(gòu)、非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量以及相關(guān)酶活性的影響，以期探明缺鎂加重檳榔葉片光抑制現(xiàn)象的生理機制，為檳榔的平衡施肥技術(shù)和高產(chǎn)優(yōu)質(zhì)栽培提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

試驗于中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所溫室大棚內(nèi)進(jìn)行。供試品種為三葉齡‘熱研1 號’檳榔幼苗，選用形態(tài)一致且生長良好的幼苗定植于直徑為16 cm，高度為22 cm 的塑料苗盆中，每盆定植1 株。盆中基質(zhì)由石英砂、珍珠巖和蛭石按體積1∶1∶1 混合而成，每盆基質(zhì)干重為1 kg，盆底放托盤，自然光照條件下培養(yǎng)。

1.2 試驗設(shè)計

MS 完全營養(yǎng)液配方為:NH4NO320 mmol/L、KH2PO41.25 mmol/L、KNO318 mmol/L、CaCl2·2H2O 3 mmol/L、ZnSO4·7H2O 0.03 mmol/L、MgSO4·7H2O 1.5 mmol/L、H3BO30.1 mmol/L、KI 5 μmol/L、MnSO4·H2O 0.1 mmol/L、Fe-EDTA 0.1 mmol/L、CuSO4·5H2O 0.1 μmol/L、Na2MoO4·2H2O 1.03 μmol/L、CoCl2·6H2O 1.05 μmol/L、pH 值5.8～6.0。試驗用營養(yǎng)液為完全營養(yǎng)液配方的1/2 濃度。試驗設(shè)3 個鎂水平，即缺鎂 (-Mg，0 mmol/L)、正常供鎂(CK，0.75 mmol/L) 和高鎂 (+Mg，2.25 mmol/L)，每個水平處理20 盆。其中缺鎂處理組為了維持離子濃度的平衡和避免硫元素的缺乏以添加Na2SO4替代MgSO4·7H2O。試驗處理期間，每3～4 天給試驗盆補澆400 mL 營養(yǎng)液，每2 周用去離子水洗鹽1 次，防止鹽分積累。試驗處理5 個月后進(jìn)行各項指標(biāo)的測定。

1.3 測定指標(biāo)及方法

1.3.1 地上部與地下部鎂含量的測定 將檳榔植株分為地上與地下兩部分，樣品先用自來水沖洗干凈，再用超純水沖洗。于105℃烘箱中殺青30 min，然后在75℃下烘干至恒重。將樣品進(jìn)行粉碎后過0.149 mm 篩，經(jīng)硫酸-高氯酸消煮后，用原子吸收分光光度法測定[13]。

1.3.2 相對葉綠素含量測定 采用日本Konica 公司生產(chǎn)的SPAD-502 葉綠素測定儀測定檳榔相對葉綠素含量，選取各植株頂端完全展開、成熟的第二片葉，在葉片主脈兩側(cè)從葉尖到葉基部均等測6 個點，取其平均值，測定前用標(biāo)準(zhǔn)色板校正儀器基準(zhǔn)數(shù)值。

1.3.3 非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量以及酶活性的測定 選取檳榔植株頂端往下數(shù)第二片葉，進(jìn)行非結(jié)構(gòu)性碳水化合物含量及酶活性的測定?？扇苄钥偺?、蔗糖以及淀粉的提取采用80%乙醇在80℃水浴條件下浸提2 次，根據(jù)Garcia-Luis 等[14]的方法進(jìn)行含量測定，以蒽酮-硫酸溶液為空白對照，分別在620 nm、480 nm、620 nm 進(jìn)行比色，并計算含量。按北京索萊寶生物科技有限公司生產(chǎn)的試劑盒說明書測試能夠蔗糖合成酶 (SS)、蔗糖磷酸合成酶 (SPS) 活性，以生成1 μg/min 蔗糖為1 個酶活力單位 (U)。

1.3.4 葉綠素?zé)晒鈪?shù)測定 挑選正常光照的實驗日，選取檳榔植株頂端往下數(shù)第2 片葉，利用德國WALZ 公司生產(chǎn)的PAM-2500 便攜式熒光儀于上午9:00—11:00 測定初始熒光 (Fo)、最大熒光 (Fm) 和PSⅡ最大光能轉(zhuǎn)化效率 (Fv/Fm)、PSⅡ?qū)嶋H光化學(xué)量子產(chǎn)量[Y(Ⅱ)]、光化學(xué)淬滅系數(shù) (qP) 和非光化學(xué)淬滅系數(shù) (NPQ)，測定前葉片暗適應(yīng)20 min。每個處理重復(fù)3 株，每株重復(fù)測2～3 次。

1.3.5 葉綠體超微結(jié)構(gòu) 取檳榔幼苗頂端第2 片葉葉尖到葉基的中間部位 (避開葉脈)，切成1 mm × 2 mm 大小的樣塊，放入0.1 mol/L 磷酸緩沖液 (pH 7.4)配制成的5%戊二醛溶液的固定液中，后將樣品在1%鋨酸和0.1 mol/L 磷酸緩沖液 (pH 7.4) 室溫 (20℃)固定5 h，用0.1 mol/L 磷酸緩沖液洗3 次，經(jīng)不同濃度酒精脫水，丙酮過渡，最后用環(huán)氧樹脂Epon812包埋。包埋后的材料用Leica UC7 型超薄切片機切片，經(jīng)醋酸雙氧鈾和枸櫞酸鉛染色后，于HT7700 型電鏡下觀察、拍照。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用Excel 2010 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析，用SPSS 軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行單因素方差(one-way ANOVA)分析，利用Duncan 檢驗法進(jìn)行差異顯著性檢查(P ＜0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同供鎂水平對檳榔幼苗葉片鎂含量的影響

從表1 看出，檳榔幼苗地上部、地下部鎂含量在不同供鎂水平下具有差異顯著，其地下部鎂含量高于地上部，隨著供鎂濃度的提高，植株鎂含量呈上升的趨勢。與對照相比，缺鎂處理組檳榔地上部、地下部分別降低了32.4%、38.7%，而高鎂組檳榔地上部、地下部分別提高了34.2%、18.7%。

2.2 不同供鎂水平對檳榔幼苗葉片相對葉綠素及非結(jié)構(gòu)性糖含量的影響

由圖1 可知，隨著供鎂濃度的升高，檳榔葉片相對葉綠素含量呈增加趨勢。與對照相比，缺鎂處理組SPAD 值顯著降低了30.8%，而高鎂處理組SPAD 值與對照組差異不顯著。

表 1 不同供鎂水平檳榔幼苗各部位鎂含量 (mg/kg)Table 1 Mg contents in shoot and root of areca palm under different Mg concentrations

非結(jié)構(gòu)性碳水化合物在植物代謝中占據(jù)著重要的地位，它們是光合作用的主要產(chǎn)物，其組分的含量反映了植物碳水化合物的供應(yīng)情況[15]。由圖1 可看出，在缺鎂條件下，檳榔葉片的可溶性糖、蔗糖含量均顯著升高，分別較對照組提高了22.7%、30.9%；而淀粉含量較對照組降低了31.3%；在高鎂條件下，淀粉含量顯著高于對照組，較對照組提高了17.5%，但可溶性糖和蔗糖含量與對照差異不顯著。

2.3 不同供鎂水平對檳榔幼苗葉片蔗糖合成酶(SS) 和蔗糖磷酸合成酶 (SPS) 的影響

SS 和SPS 是蔗糖代謝過程中兩種關(guān)鍵酶，SPS是控制葉片中蔗糖合成的關(guān)鍵酶，其活性的高低直接影響可溶性糖含量及對庫端的供應(yīng)能力[16]。SS 分解蔗糖生成腺苷二磷酸葡萄糖和果糖，用來合成淀粉等碳水化合物[16]。由圖2 可看出，缺鎂組檳榔葉片SS 活性較對照組降低了39.1%，而高鎂組較對照升高了16.9%，但三個處理組SPS 活性差異不顯著。

2.4 不同供鎂水平對檳榔幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)的影響

由表2 可知，缺鎂處理導(dǎo)致檳榔葉片光系統(tǒng)Ⅱ(PSⅡ) 的最大光化學(xué)效率Fv/Fm、實際光化學(xué)效率Y(Ⅱ)和光化學(xué)淬滅系數(shù)qP 顯著降低，分別較對照降低了20.3%、43.9%和13.5%，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ 與對照差異不顯著。高鎂處理組檳榔葉片qP 較對照升高了6.7%，但Fv/Fm、Y(Ⅱ)和NPQ 與對照差異不顯著。以上結(jié)果說明缺鎂脅迫對檳榔幼苗光合作用的影響顯著，且大于鎂過量脅迫，缺鎂處理檳榔幼苗葉片易發(fā)生光抑制，從而產(chǎn)生光傷害。

圖 1 不同供鎂水平下檳榔幼苗葉片相對葉綠素與糖類物質(zhì)含量Fig. 1 Relative chlorophyll and carbohydrates contents in areca palm leaves under different Mg treatments

圖 2 不同供鎂水平下檳榔幼苗葉片蔗糖合成酶和蔗糖磷酸合成酶活性Fig. 2 Activities of sucrose and sucrose phosphate synthase in areca palm leaves under different Mg treatments

2.5 不同供鎂水平對檳榔幼苗葉片葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響

由圖3 可知，不同供鎂水平處理對檳榔葉綠體超微結(jié)構(gòu)具有明顯的影響。正常鎂對照處理組檳榔葉片葉綠體發(fā)育良好，結(jié)構(gòu)完整，呈規(guī)則的梭形，緊貼著細(xì)胞壁，基粒、基質(zhì)片層清晰，基粒類囊體垛疊多且排列致密整齊，葉綠體內(nèi)富含大的淀粉顆粒(圖3-A、B)；在缺鎂條件下，葉綠體膜解體，基粒片層大部分消失，類囊體片層結(jié)構(gòu)斷裂，噬鋨顆粒數(shù)目增多，且大部分葉綠體中不含有淀粉顆粒 (圖3-C、D)；在高鎂條件下，葉綠體形狀發(fā)生變形，形狀不規(guī)則，有的呈圓球形，基粒片層部分消失，噬鋨顆粒和淀粉粒較對照增多，散亂地分布在胞質(zhì)中 (圖3-E、F)。以上結(jié)果說明，適宜的Mg2+濃度對維持葉綠體結(jié)構(gòu)具有重要的作用，Mg2+過少時葉綠體結(jié)構(gòu)會遭到破壞，淀粉顆粒明顯減少，說明其光合作用受到了嚴(yán)重的影響；Mg2+過多時葉綠體結(jié)構(gòu)雖然會發(fā)生變化，但淀粉顆粒明顯增多，說明仍可以進(jìn)行正常的光合作用。

表 2 不同供鎂水平下檳榔幼苗葉片葉綠素?zé)晒鈪?shù)Table 2 Chlorophyll fluorescence parameters in areca palm leaves affected by different Mg treatments

圖 3 不同鎂水平處理對檳榔葉片葉綠體超微結(jié)構(gòu)的影響Fig. 3 Effects of different magnesium concentrations on chloroplast ultrastructure of areca palm leaves

3 討論

鎂是植物生長發(fā)育所必需的營養(yǎng)元素，在植物體內(nèi)主要通過韌皮部進(jìn)行運輸[17]。本試驗結(jié)果表明，檳榔植株鎂含量與供鎂濃度呈正相關(guān)關(guān)系，這與在葡萄[11]和黃瓜[18]上的研究結(jié)果一致。鎂是構(gòu)成葉綠素的中心元素，其含量與相對葉綠素呈極顯著相關(guān)[19]。植物葉片葉綠素?zé)晒鈩恿W(xué)參數(shù)與光合色素的含量及光合作用中的各個反應(yīng)過程有著緊密聯(lián)系，目前已被廣泛應(yīng)用到植物逆境生理研究的領(lǐng)域中[20-22]。對菜心[10]、葡萄[11]和黃瓜[18]的研究表明，葉片葉綠素a、葉綠素b、類胡蘿卜素含量會隨著供Mg 的減少而逐漸降低。Fv/Fm和Y(Ⅱ)反映了光系統(tǒng)Ⅱ (PSⅡ)反應(yīng)中心利用所捕獲激發(fā)能的情況。本研究表明，缺鎂導(dǎo)致了檳榔葉片SPAD 值、Fv/Fm、Y(Ⅱ)顯著下降 (圖1、表1)，表明檳榔葉片受到了嚴(yán)重的光抑制，造成葉片量子產(chǎn)量降低，阻礙光合電子傳遞，進(jìn)而降低光合效率；而在高鎂條件下，檳榔SPAD值、Fv/Fm和Y(Ⅱ)與對照相比差異不顯著 (圖1、表1)，蘇仲等[23]研究指出高鎂也會造成葉片量子產(chǎn)量降低，但在本研究中并沒有體現(xiàn)，這可能跟植株內(nèi)鎂的含量有關(guān)，雖然高鎂組檳榔鎂含量顯著高于正常鎂處理組，但其鎂含量仍處于一個中等水平，說明了試驗設(shè)置的高鎂 (為對照Mg 濃度的3 倍) 未達(dá)到抑制檳榔光合作用的水平。植物在捕獲的光能超過光合作用所需要的能量時，過多的激發(fā)能會以熱能的形式耗散掉，從而保護(hù)光合系統(tǒng)免受破壞。缺鎂組檳榔葉片光化學(xué)淬滅系數(shù)qP 顯著低于高鎂組和對照組，而非光化學(xué)淬滅系數(shù)NPQ 則無顯著差異，表明在強光下缺鎂葉片有較多的激發(fā)能沒有用于光化學(xué)反應(yīng)。Goss 等[24]研究表明，非光化學(xué)淬滅系數(shù)反映了依賴葉黃素循環(huán)的非輻射能量耗散途徑的強弱，葉黃素循環(huán)主要依賴跨類囊體膜的pH 梯度，在強光下由H2O 光解產(chǎn)生大量的H+以降低類囊體腔的pH 值，從而啟動葉黃素循環(huán)。本研究結(jié)果顯示，缺鎂組qP 下降的同時，NPQ 并沒有顯著上升 (表1)，說明過剩的激發(fā)能未能通過非光化學(xué)淬滅途徑有效的耗散。Mg2+對維持類囊體膜兩側(cè)的pH 值至關(guān)重要[25]，因此缺鎂葉片可能是由于葉黃素循環(huán)受阻以致過剩激發(fā)能不能及時地耗散，從而導(dǎo)致光合系統(tǒng)受到損傷。

葉綠體是植物進(jìn)行光合作用的場所，其基粒片層和基質(zhì)片層結(jié)構(gòu)的完整有序是光能進(jìn)行正常有效轉(zhuǎn)換的保證[26]。植物葉片的葉綠體基粒和基粒片層越多、排列越整齊致密，葉片光合能力越強。鎂不僅參與葉綠素的合成，還參與類囊體膜的組裝和基粒垛疊，適當(dāng)鎂濃度能強化基粒和基質(zhì)片層的有序化垛疊[27]。申燕等[28]研究表明，缺鎂導(dǎo)致橘橙葉綠體類囊體片層模糊，片層數(shù)量減少；鎂過量會導(dǎo)致葉綠體片層消失，淀粉粒和質(zhì)體小球增多增大。本試驗中，缺鎂導(dǎo)致檳榔葉綠體類囊體片層結(jié)構(gòu)斷裂，產(chǎn)生了許多噬鋨顆粒，且大部分葉綠體不含有淀粉粒；高鎂會使葉綠體形狀發(fā)生變化，葉綠體膜模糊，基粒片層部分消失，但形成了較多淀粉粒。類囊體結(jié)構(gòu)是保證植物光能吸收與轉(zhuǎn)換的前提，淀粉粒是葉綠體基質(zhì)中所儲存的光合產(chǎn)物。而鎂在維持天線色素、反應(yīng)中心和膜的構(gòu)象，以及維持光能的高效吸收、傳遞和轉(zhuǎn)化方面發(fā)揮著重要作用[26]。由此反映出缺鎂時葉綠體膜解體、葉綠體類囊體結(jié)構(gòu)的斷裂直接影響到光合作用的有效進(jìn)行，而高鎂處理雖然對葉綠體形狀和基粒片層結(jié)構(gòu)造成了一定的影響，但并未達(dá)到嚴(yán)重的毒害程度，所以仍能進(jìn)行正常的光合作用。

植物葉片光合作用固定的碳主要以碳水化合物(淀粉、蔗糖) 的形式貯藏在葉綠體和細(xì)胞質(zhì)中。對雪柑和酸柚[5]、咖啡[29]和小麥[30]的研究表明，缺鎂增加或不影響葉片非結(jié)構(gòu)性碳水化合物的含量，但是降低了它們在根中的含量。與前人研究結(jié)果一致的是，缺鎂檳榔葉片可溶性糖 (蔗糖+葡萄糖+果糖)、蔗糖含量顯著高于正常鎂和高鎂處理組，但淀粉含量則顯著降低。蔗糖從質(zhì)外體進(jìn)入篩管-伴胞細(xì)胞中，是與質(zhì)子逆向運輸，由ATPase 產(chǎn)生的跨膜電化學(xué)梯度是物質(zhì)跨膜運輸?shù)脑瓌恿?，而Mg2+可以激活A(yù)TPase 的活性，從而保證了物質(zhì)跨膜運輸?shù)哪芰啃枨骩9,31]。盡管缺鎂葉片可溶性糖含量積累增加，但光合能力降低并不能由糖積累反饋抑制光合的機制來解釋，這與Li 等[32]研究結(jié)果是一致的；缺鎂可能影響了檳榔葉片中物質(zhì)的運輸，從而導(dǎo)致了缺鎂情況下葉片中可溶性糖的積累。缺鎂檳榔葉片淀粉含量的降低，可能是由于SS 活性的降低，影響了淀粉合成底物ADPG (腺苷二磷酸葡萄糖) 的產(chǎn)生，進(jìn)而影響了淀粉合成[33]。

4 結(jié)論

缺鎂脅迫下，檳榔幼苗葉綠體超微結(jié)構(gòu)受到破壞，從而導(dǎo)致光合系統(tǒng)受到損傷，光合能力降低。高濃度鎂處理 (對照Mg 濃度的3 倍，即2.25 mmol/L)雖對葉綠體形狀和基粒片層結(jié)構(gòu)造成了一定的影響，但并未達(dá)到嚴(yán)重毒害程度，葉片仍能進(jìn)行正常的光合作用。雖然缺鎂葉片中積累更多的可溶性糖和蔗糖，但這些葉片較低的光合能力并不能由糖積累反饋抑制光合的機制來解釋。因此，在檳榔生產(chǎn)中應(yīng)重視鎂肥的施用，且生產(chǎn)上一定程度的鎂肥過量不會對樹體產(chǎn)生明顯的不利影響。