文濱濱，張新昊，沈紅艷，武紅玉，陳修德，肖 偉，高東升

（山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院/山東果蔬優(yōu)質(zhì)高效生產(chǎn)協(xié)同創(chuàng)新中心/作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東泰安 271018）

氮素是植物中重要的營(yíng)養(yǎng)元素，其缺乏會(huì)導(dǎo)致葉片快速衰老[1-2]，而硝態(tài)氮是植物吸收的主要氮素形態(tài)，對(duì)植物的生長(zhǎng)發(fā)育和物質(zhì)代謝有不可替代的作用。NO3-在根系中被吸收以后，大部分通過(guò)蒸騰作用被轉(zhuǎn)運(yùn)到葉片葉肉細(xì)胞中，在硝酸還原酶的作用下被還原為NO2-，并進(jìn)一步在亞硝酸還原酶的作用下被還原為NH4+，之后進(jìn)入葉綠體，在谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的作用下NH4+被進(jìn)一步同化為谷氨酰胺和谷氨酸[3-7]。當(dāng)外界持續(xù)供氮不足時(shí)，易導(dǎo)致葉綠體的衰老降解，葉綠體衰老降解的同時(shí)，NO3-通過(guò)韌皮部轉(zhuǎn)運(yùn)至生長(zhǎng)旺盛的部位，但是氮的吸收和同化能力顯著減弱[8]。因此與氮同化和再活化相關(guān)的關(guān)鍵酶，包括硝酸還原酶 (NR)、亞硝酸還原酶 (NiR)、谷氨酰胺合成酶 (GS) 和谷氨酸合酶(GOGAT) 等活性受到衰老、脅迫等影響時(shí)將直接影響葉綠體的穩(wěn)定性[9]。在這些酶中NR 是氮同化的主要限速酶[10]，GS 是氮同化和再活化的關(guān)鍵酶[11]。外界供氮水平將直接影響這些酶的活性[12]。在氮素虧缺條件下，過(guò)表達(dá)NR和NiR 基因可以提高植物對(duì)氮的吸收和同化，減少葉片中硝酸鹽含量，盡管這種轉(zhuǎn)錄調(diào)控作用不能促進(jìn)植物的生長(zhǎng)，但是氮素的利用效率卻顯著提高[13-14]。在煙草中沉默NR 基因的表達(dá)，植株NR 活性降低，NO3-在葉片中積累，影響了植株的生長(zhǎng)發(fā)育[15]，所以植物體內(nèi)自身氮素含量也可以調(diào)控植物的生長(zhǎng)，NR 在調(diào)控過(guò)程中起主要作用[16]。

氮是果樹(shù)生長(zhǎng)發(fā)育必需的礦質(zhì)元素之一。但是過(guò)量施氮加劇了環(huán)境的壓力，造成土壤污染和水污染等[17-18]，當(dāng)前的一些研究主要集中在氮素虧缺對(duì)蘋果實(shí)生幼苗及結(jié)果大苗生長(zhǎng)發(fā)育的影響[19-20]，而氮素虧缺對(duì)植物干細(xì)胞愈傷組織生長(zhǎng)發(fā)育及氮素同化吸收方面的研究較少，因此本試驗(yàn)采用蘋果葉片的愈傷組織為試材，利用非損傷微測(cè)以及實(shí)時(shí)熒光定量PCR 技術(shù)在硝態(tài)氮虧缺和正常供氮的條件下，研究蘋果葉片愈傷組織中硝態(tài)氮的含量變化、硝態(tài)氮同化酶活性及相關(guān)基因表達(dá)的差異，旨在明確蘋果葉片愈傷組織中硝態(tài)氮吸收、同化的生理機(jī)制和分子基礎(chǔ)，豐富蘋果葉片吸收氮素的理論。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料與設(shè)計(jì)

試驗(yàn)材料為 ‘嘎拉3’(Malus x domestica ‘Gala 3’ )組培苗葉片傷口分化的愈傷組織。于2018 年5 月3 日在作物學(xué)國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室、山東農(nóng)業(yè)大學(xué)園藝科學(xué)與工程學(xué)院取繼代后一個(gè)月且長(zhǎng)勢(shì)均勻一致的‘嘎拉3’組培苗，取完全展開(kāi)的功能葉片，用滅菌的手術(shù)刀片沿垂直葉脈方向劃傷葉片并去掉葉尖和葉柄，葉背向上平鋪于MS 分化培養(yǎng)基中，每個(gè)平板10 片葉片，黑暗條件下預(yù)培養(yǎng)3 天，然后轉(zhuǎn)至光下培養(yǎng)7 天，葉片傷口處長(zhǎng)出愈傷組織。將長(zhǎng)出愈傷組織的葉片分別轉(zhuǎn)移至MS 蘋果分化培養(yǎng)基(CK，NO3-濃度 0.039 mol/L，總N 濃度 0.060 mol/L)，以及用NH4Cl、KCl 分別代替NH4NO3、KNO3的MS 硝態(tài)氮虧缺分化培養(yǎng)基 (T，NO3-濃度 0 mol/L，總N 濃度 0.021 mol/L)，培養(yǎng)3 周。人工氣候室的培養(yǎng)條件為14 h 光照 (24℃)、10 h 黑暗 (22℃)，相對(duì)濕度約為70%，光照強(qiáng)度為20000 lx。在轉(zhuǎn)板第0、1、3、7、14、21 天后分別取葉片傷口處的愈傷組織，測(cè)定硝態(tài)氮含量、NO3-流速、氮素同化酶活性和氮素同化酶基因相對(duì)表達(dá)量，每處理3 次重復(fù)。

1.2 分析項(xiàng)目與方法

1.2.1 葉片愈傷組織外觀和細(xì)胞形態(tài)的觀察 葉片愈傷組織的外觀形態(tài)使用Canon EOS 60d 相機(jī)拍攝。取轉(zhuǎn)板后的蘋果葉片愈傷組織，沿生長(zhǎng)點(diǎn)方向縱切成0.5 cm3左右的小塊，F(xiàn)AA 固定液固定后用真空機(jī)抽真空，制作石蠟切片[21]。將愈傷組織切至8 μm 厚度的薄片，在Leica 光學(xué)顯微鏡下觀察愈傷組織的顯微結(jié)構(gòu)并拍照。

1.2.2 硝態(tài)氮含量及硝態(tài)氮同化酶活性的測(cè)定 硝態(tài)氮含量的測(cè)定采用任同輝[22]的方法。硝態(tài)氮同化酶活性的測(cè)定使用試劑盒法，取蘋果葉片愈傷組織，稱取1 g，進(jìn)行三次生物學(xué)重復(fù)，用液氮將標(biāo)本研磨充分，加入9 g pH 7.2～7.4 的1 × PBS 緩沖液充分沖洗研缽。離心20 min(3000 r/min)，仔細(xì)收集上清。硝酸還原酶、亞硝酸還原酶、谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶試劑盒均采自上海通蔚 (貨號(hào)分別為ml48521j、ml69312j、ml15789j、ml25784j)，以空白孔調(diào)零，在450 nm 波長(zhǎng)下用酶標(biāo)儀 (iMARKTM Microplate Reader) 依序測(cè)量各孔的吸光度 (OD 值)。測(cè)定在加終止液15 分鐘以內(nèi)進(jìn)行。

1.2.3 愈傷組織NO3-流速的測(cè)定 采用山東農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院非損傷微測(cè)系統(tǒng) (NMT100 Series, YoungerUSA LLC, Amherst, MA 01002, USA) 測(cè)定葉片和愈傷組織連接處的NO3-動(dòng)態(tài)流速，選取葉片傷口處著生的愈傷組織，切除多余的葉片，保持切面平整光滑。將愈傷組織置于培養(yǎng)皿底部，用樹(shù)脂固定好，浸泡于含0.1 mmol/L KNO3、0.1 mmol/L CaCl2、pH 5.8 測(cè)試液中，平衡30 min。更換測(cè)試液，將傳感器尖端置于距離愈傷組織與葉片接觸點(diǎn)的切面約50 μm 處，開(kāi)始檢測(cè)。每一個(gè)愈傷組織測(cè)試5 min，獲取NO3-流速數(shù)據(jù)[23-24]。每組 (不同時(shí)期) 進(jìn)行6 個(gè)生物學(xué)重復(fù)。得到的NO3-流速值，正值代表外排，負(fù)值為內(nèi)吸。

1.2.4 硝態(tài)氮同化酶基因的表達(dá)分析 分別取處理后第0、1、3、7、14、21 天的愈傷組織，置于液氮中速凍，放入-80℃冰箱備用?？俁NA 的提取用TIANGEN(天根) 試劑盒，然后進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，證實(shí)RNA 有18S 和28S 兩條明顯的完整條帶。使用反轉(zhuǎn)錄試劑盒PrimeScriptTM RT reagent Kit withg DNA Eraser (Perfect Real Time，TaKaRa) 獲得cDNA，使用SYBR? Premix Ex TaqTM(Tli RNaseH Plus) 試劑盒 (寶生物) 進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)。在NCBI 中找到基因的序列，使用DNAMAN 軟件設(shè)計(jì)熒光定量特異性引物 (表1)。最終采用Comparative CT(2-ΔΔCt) 法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析[25]。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)的整理與統(tǒng)計(jì)使用Excel 2003，用Spss20.0進(jìn)行數(shù)據(jù)差異性分析，用Photoshop 和Graphpad Prism 6 作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 硝態(tài)氮虧缺對(duì)蘋果愈傷組織外觀形態(tài)的影響

硝態(tài)氮虧缺和正常供氮條件下的蘋果葉片愈傷組織如圖1 所示。結(jié)果表明，相對(duì)于對(duì)照組，轉(zhuǎn)到硝態(tài)氮虧缺的培養(yǎng)基中第7 天 (培養(yǎng)10 天后轉(zhuǎn)到新板7 天) 時(shí)，葉片切口處的愈傷組織和葉緣變黃，愈傷組織相對(duì)于對(duì)照組發(fā)育遲緩；轉(zhuǎn)板至14 天時(shí)，靠近培養(yǎng)基一側(cè)的葉片由葉緣向主葉脈變黃，愈傷組織發(fā)育停滯，靠近切口的愈傷組織出現(xiàn)黃化；轉(zhuǎn)板至21 天時(shí)，葉片嚴(yán)重失綠，愈傷組織黃化并失去分化能力，無(wú)法分化出幼苗。

表 1 RT-PCR 所用引物Table 1 Primers used for quantitative RT-PCR analysis

2.2 硝態(tài)氮虧缺對(duì)蘋果愈傷組織細(xì)胞形態(tài)的影響

細(xì)胞形態(tài)的規(guī)則性和完整性是硝態(tài)氮吸收同化的基礎(chǔ)，硝態(tài)氮虧缺處理對(duì)愈傷組織細(xì)胞形態(tài)的影響較大 (圖2)。轉(zhuǎn)板至3 天時(shí)，硝態(tài)氮虧缺處理的細(xì)胞體積變小、細(xì)胞間隙變大、排列疏松。轉(zhuǎn)板至7 天時(shí)，處理組細(xì)胞排列雜亂，細(xì)胞變長(zhǎng)、間隙變小，無(wú)明顯細(xì)胞輪廓，此時(shí)與培養(yǎng)基接觸的愈傷組織由淺綠變?yōu)辄S綠 (圖1)。轉(zhuǎn)板至14 天時(shí)，細(xì)胞變形，無(wú)細(xì)胞特征，細(xì)胞排列緊密，此時(shí)葉片萎蔫，愈傷組織黃化且體積無(wú)明顯變化。轉(zhuǎn)板至21 天時(shí)，硝態(tài)氮虧缺的愈傷組織細(xì)胞變化持續(xù)加重。

2.3 硝態(tài)氮虧缺對(duì)蘋果愈傷組織和葉片硝態(tài)氮含量的影響

圖3 結(jié)果表明，硝態(tài)氮虧缺處理后，蘋果葉片硝態(tài)氮含量在第14 天達(dá)到小高峰1.66 mg/g，在處理周期內(nèi)無(wú)顯著差異。而正常供氮條件下，葉片中硝態(tài)氮含量呈逐漸降低的變化趨勢(shì)，且處理3 天后，處理組的蘋果葉片硝態(tài)氮含量顯著高于對(duì)照組。

硝態(tài)氮虧缺處理后，蘋果愈傷組織硝態(tài)氮含量呈先增加后降低的變化趨勢(shì)，第7 天達(dá)到峰值1.54 mg/g，相比于處理前，硝態(tài)氮含量增加了0.16 mg/g，與對(duì)照呈顯著性差異。最大降幅出現(xiàn)在7 天后，為13.64%，隨后呈相對(duì)穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，與葉片中硝態(tài)氮含量的變化相對(duì)應(yīng)。

以上結(jié)果表明，在正常供氮條件下，葉片中的氮素含量逐漸降低，供應(yīng)給生長(zhǎng)旺盛的愈傷組織；而在硝態(tài)氮虧缺條件下處理7 天后，氮素由愈傷組織流向葉片。

2.4 硝態(tài)氮虧缺對(duì)蘋果葉片與愈傷組織連接處NO3-流速的影響

從圖4 可以看出，硝態(tài)氮虧缺處理中NO3-呈先內(nèi)吸后外排再內(nèi)吸的變化趨勢(shì)，轉(zhuǎn)板三天內(nèi)，愈傷組織對(duì)NO3-一直處于吸收狀態(tài)，最大吸收速率出現(xiàn)在處理前，為22.38 pmol/(cm2·s)。處理1 天后下降幅度最大為84.1%，第3 天到第7 天是NO3-由吸收到外排的重要分界點(diǎn)，逆差為24.45 pmol/(cm2·s)。在處理第14 天時(shí)外排速率最大，為29.18 pmol/(cm2·s)，隨后NO3-由外排到內(nèi)吸。對(duì)照處理NO3-呈現(xiàn)先內(nèi)吸后外排再內(nèi)吸再外排的變化趨勢(shì)，轉(zhuǎn)板一天后就出現(xiàn)外排現(xiàn)象，外排速率呈先升高后降低的變化趨勢(shì)，在第三天時(shí)外排速率最大，為94.52 pmol/(cm2·s)。以上結(jié)果表明，NO3-在葉片和愈傷組織之間呈動(dòng)態(tài)平衡，持續(xù)供氮會(huì)造成NO3-的外排，短期適時(shí)缺氮可以提高愈傷組織對(duì)NO3-的吸收速率。

2.5 硝態(tài)氮虧缺對(duì)蘋果愈傷組織硝態(tài)氮同化酶活性的影響

NR 作為一種氧化還原酶，可催化硝酸根離子還原成亞硝酸根離子。NiR 是一類可以催化亞硝酸鹽還原的酶，可以將亞硝酸根離子還原為銨根離子。由圖5 可以看出，硝態(tài)氮虧缺處理后，NR 活性降低，處理至14 天時(shí)快速增加，增幅為19.26%。此時(shí)，與對(duì)照相比差異最大，為0.075 U/g，處理至21 天達(dá)到與處理前無(wú)顯著差異的水平。NiR 活性在處理后降低，處理至第7 天時(shí)出現(xiàn)小高峰，處理結(jié)束后上升幅度最大，為21.83%，此時(shí)差異最大，為0.08 U/g。

GS 和GOGAT 主要在葉綠體中發(fā)揮同化作用，GS/GOGAT 循環(huán)將葉肉細(xì)胞中的NH4+最終還原為氨基酸，所以GS 的變化勢(shì)必會(huì)引起GOGAT 的變化。硝態(tài)氮虧缺后，GS 和GOGAT 活性均呈先下降然后緩慢回升并保持穩(wěn)定的變化趨勢(shì)，且在處理周期內(nèi)GS/GOGAT 活性均顯著低于對(duì)照。缺氮處理1 天后，GS 活性最低，為0.22 U/g，與處理第3、7 天時(shí)無(wú)顯著性差異，處理7 天后稍有增加，增幅為22.9%。GOGAT 活性在第3 天時(shí)最低，為0.088 U/g。隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)，酶活性增加并保持穩(wěn)定。綜上，硝態(tài)氮虧缺后，硝態(tài)氮同化酶活性均降低，但在處理7 天后回升，說(shuō)明此時(shí)是愈傷組織中氮素吸收同化的關(guān)鍵時(shí)期。

圖 1 硝態(tài)氮虧缺不同天數(shù)后葉片愈傷組織外觀形態(tài)Fig. 1 Effect of nitrate nitrogen deficient on the morphology of leaf callus at different days

2.6 硝態(tài)氮虧缺對(duì)蘋果愈傷組織氮素同化酶基因表達(dá)的影響

圖 2 硝態(tài)氮虧缺不同天數(shù)后愈傷組織解剖結(jié)構(gòu)Fig. 2 Anatomical structure of leaf callus after different days with nitrate nitrogen deficiency

從圖6 可以看出，硝態(tài)氮虧缺處理后，氮素同化酶基因MdNR2、MdNIR、MdGS2、MdGOGAT 的相對(duì)表達(dá)量基本呈升高的變化趨勢(shì)。處理1 天后，MdNR 基因的表達(dá)量升高；處理至3 天時(shí)，增幅為373%，此時(shí)MdNR 基因的表達(dá)量高于對(duì)照；處理7 天后，MdNR2 基因表達(dá)量穩(wěn)定并與處理14 天時(shí)無(wú)顯著差異。缺氮處理1 天后，MdNIR 基因的表達(dá)量開(kāi)始緩慢增加；處理至7 天時(shí)，高于對(duì)照，并與處理14 天時(shí)無(wú)顯著性差異；處理結(jié)束后，MdNIR 基因的表達(dá)量為對(duì)照的2.52 倍。缺氮處理1 天后，MdGS2 基因的表達(dá)量高于對(duì)照，處理7 天后達(dá)到高峰，之后有所下降，處理結(jié)束后，MdGS2 基因的表達(dá)量為對(duì)照的11.37倍。MdGOGAT 基因的表達(dá)量在處理3 天內(nèi)與對(duì)照無(wú)顯著性差異，隨后顯著上調(diào)，處理7 天時(shí)增幅為112%并與處理14 天時(shí)無(wú)顯著性差異；處理結(jié)束后，MdGOGAT 基因的表達(dá)量為對(duì)照的2.29 倍。以上結(jié)果表明硝態(tài)氮虧缺后，通過(guò)上調(diào)氮素同化酶基因的表達(dá)量來(lái)增強(qiáng)同化愈傷組織中的硝態(tài)氮，從而維持愈傷組織的正常生長(zhǎng)。

圖 3 硝態(tài)氮虧缺對(duì)葉片和愈傷組織硝態(tài)氮含量的影響Fig. 3 The effects of nitrate-deficiency on nitrate contents in leaf and callus

圖 4 硝態(tài)氮虧缺對(duì)愈傷組織NO3-流速的影響Fig. 4 The effects of nitrate-deficiency on NO3-uptake flux in leaf callus

3 討論

3.1 硝態(tài)氮虧缺對(duì)蘋果愈傷組織生長(zhǎng)及細(xì)胞形態(tài)的影響

前人研究表明，植物的細(xì)胞形態(tài)與生理功能密切相關(guān)，正常的細(xì)胞形態(tài)和器官構(gòu)造是植物進(jìn)行正常生命活動(dòng)的基礎(chǔ)[26]。本研究在硝態(tài)氮虧缺處理7 天后，愈傷組織生長(zhǎng)受到抑制，細(xì)胞形態(tài)發(fā)生改變，這與前人研究結(jié)果一致[27]。不過(guò)處理3 天內(nèi)，愈傷組織細(xì)胞體積變小，細(xì)胞間隙變大，排列疏松，這種變化有利于細(xì)胞充分利用光能，增強(qiáng)蒸騰作用，并促進(jìn)NO3-向愈傷組織中遷移[28]。所以短期缺氮處理，增強(qiáng)了NO3-的流動(dòng)性，加速衰老器官中的NO3-向生長(zhǎng)旺盛的組織中轉(zhuǎn)移，促進(jìn)對(duì)NO3-的吸收，但是其分子機(jī)理還需要進(jìn)一步探討。

3.2 硝態(tài)氮虧缺對(duì)蘋果愈傷組織NO3-吸收同化的影響

硝態(tài)氮是植物最容易吸收的氮素營(yíng)養(yǎng)，其吸收和同化過(guò)程是植物正常生長(zhǎng)發(fā)育的基礎(chǔ)[29]。NO3-的吸收不僅受植株體內(nèi)氮豐缺狀況的調(diào)節(jié)還受到外界氮供應(yīng)狀況的影響[30]。在本研究中，NO3-虧缺處理三天內(nèi)，愈傷組織中NO3-吸收速率減小，但硝態(tài)氮含量增加。處理至第7 天時(shí)，NO3-由吸收變?yōu)橥馀?，硝態(tài)氮含量達(dá)到峰值，隨后硝態(tài)氮含量呈下降的變化趨勢(shì)。初步認(rèn)為愈傷組織中NO3-的營(yíng)養(yǎng)狀況對(duì)NO3-的吸收/外排起到負(fù)反饋的調(diào)節(jié)作用，這與前人在大麥幼苗上的研究結(jié)果一致[31]，但是處理21 天后NO3-由外排轉(zhuǎn)變?yōu)槲眨鯌B(tài)氮含量卻呈降低的變化趨勢(shì)，這可能與外界硝態(tài)氮虧缺有關(guān)，雖然愈傷組織吸收NO3-，但是NO3-的供應(yīng)不足，導(dǎo)致愈傷組織中的硝態(tài)氮含量減少。NR 是NO3-同化的關(guān)鍵酶，其活性直接影響氮素代謝的效率，而介質(zhì)中NO3-濃度直接影響NR 活性[32]。NO3-虧缺處理前期，愈傷組織中NR 活性降低，而在處理后期，NR 活性增加，NO3-可能轉(zhuǎn)化為其它形式的氮。NiR 和NR 活性的變化趨勢(shì)一致，但是NiR 活性的快速增加出現(xiàn)在處理后14 天，相比于NR 滯后一個(gè)時(shí)期，這與NO3-的同化過(guò)程相一致，NO3-在NR 的作用下被還原為NO2-，然后NO2-繼續(xù)被NiR 還原為NH4+。NO3-在葉肉細(xì)胞中被還原為NH4+后，進(jìn)入葉綠體中完成同化過(guò)程被吸收利用，GS 在GS/GOGAT 氨同化過(guò)程中起關(guān)鍵性作用，是催化氨同化過(guò)程的第一步[33]。硝態(tài)氮虧缺處理后，GS 活性下降，在處理周期內(nèi)無(wú)顯著性差異，而GOGAT 活性呈下降—升高—再下降的變化趨勢(shì)，且在第7 天出現(xiàn)峰值但是仍低于處理前活性，說(shuō)明缺氮處理后GS/GOGAT 循環(huán)受到抑制作用，這與前人的研究結(jié)果不一致，即施氮處理GOGAT 活性顯著低于缺氮處理[34]，其主要原因可能與處理植物器官的不同有關(guān)，根系與葉片吸收同化氮素差異的機(jī)理還需進(jìn)一步研究探討。

圖 5 硝態(tài)氮虧缺對(duì)愈傷組織氮素同化酶活性的影響Fig. 5 The effects of nitrate-deficiency on nitrogen assimilation enzyme activities in leaf callus

3.3 硝態(tài)氮虧缺對(duì)蘋果愈傷組織氮同化關(guān)鍵酶基因表達(dá)的影響

NR 是一種適應(yīng)酶，對(duì)外界NO3-濃度的變化異常敏感。有研究表明在短時(shí)間缺氮條件下，NR 基因的表達(dá)量上升而較長(zhǎng)時(shí)間時(shí)表達(dá)量大幅度下降[35]。本研究中氮素虧缺處理后，氮素同化酶基因MdNR2、MdNiR 呈先降低后上升的變化趨勢(shì)，并在處理21 天時(shí)達(dá)到峰值，而對(duì)照中MdNR2、MdNiR 基因的表達(dá)相對(duì)穩(wěn)定，說(shuō)明氮素含量調(diào)節(jié)基因的表達(dá)。MdNR2基因的表達(dá)量在處理3 天后出現(xiàn)大幅度上升，而MdNiR 基因大幅度上調(diào)表達(dá)出現(xiàn)在處理后14 天，存在表達(dá)量滯后現(xiàn)象，說(shuō)明NR 和NiR 基因在愈傷組織中的表達(dá)存在一定的聯(lián)系。前人研究表明，增施氮素可以上調(diào)GS/GOGAT 基因的表達(dá)[36-37]，而在本研究中氮素虧缺處理后，GS/GOGAT 基因呈上調(diào)表達(dá)，在處理后21 天達(dá)到峰值。主要原因可能是隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)，愈傷組織中硝態(tài)氮和氨基酸含量不能維持愈傷組織的正常生長(zhǎng)，通過(guò)刺激GS/GOGAT基因的上調(diào)表達(dá)來(lái)提高谷氨酰胺合成酶和谷氨酸合酶的活性從而增加對(duì)NH4+的同化作用。在煙草的缺氮處理中發(fā)現(xiàn)，NO3-供應(yīng)不足會(huì)導(dǎo)致NH4+合成量減少，而植物體內(nèi)的蛋白質(zhì)通過(guò)降解產(chǎn)生較多的NH4+，誘導(dǎo)GS/GOGAT 基因上調(diào)表達(dá)，從而加強(qiáng)對(duì)NH4+的同化作用[38]。在本研究中氮素虧缺處理三天內(nèi)，氮素同化酶活性并沒(méi)有因酶基因的上調(diào)表達(dá)而增加，這可能是植物在氮素虧缺條件下基因的表達(dá)受到mRNA 加工、翻譯等的調(diào)控，但是具體的分子機(jī)制還需進(jìn)一步研究。

圖 6 硝態(tài)氮虧缺對(duì)愈傷組織氮素同化酶基因表達(dá)量的影響Fig. 6 The effects of nitrate-deficiency on the expression of nitrogen assimilase genes in callus

4 結(jié)論

硝態(tài)氮虧缺處理3 天內(nèi)細(xì)胞體積變小、細(xì)胞間隙變大，促進(jìn)了愈傷組織對(duì)NO3-的吸收，增加硝態(tài)氮含量。處理7 天后愈傷組織細(xì)胞變形，NO3-由吸收變?yōu)橥馀?，硝態(tài)氮含量降低，導(dǎo)致氮素代謝失衡，影響了愈傷組織的正常生長(zhǎng)發(fā)育。