郭向陽，陳建軍，衛(wèi)曉軼，吳 迅，祝云芳，王安貴，劉鵬飛，湯繼華，陳澤輝*，羅紅兵

（1 湖南農業(yè)大學農學院，湖南長沙 410128；2 貴州省農業(yè)科學院旱糧研究所，貴陽 550006；3 河南省新鄉(xiāng)市農業(yè)科學院，河南新鄉(xiāng) 453002；4 河南農業(yè)大學農學院，河南鄭州 450002）

玉米是我國三大主要糧食作物之一，保障玉米安全生產關系到我國糧食安全[1-2]。隨著世界人口的不斷增長，全球范圍內對玉米的需求量也日益增加[3-4]。在玉米的諸多增產因素中，除選育高產品種外，增施氮肥也是提高玉米產量最關鍵的措施之一[5-6]。然而，大量氮肥的施用在獲得玉米高產的同時，對環(huán)境造成了嚴重污染，如水體富營養(yǎng)化等[7]。在許多地區(qū)玉米生產中的實際施氮量已遠遠超過最佳經濟施肥量，由于施肥方法不當、環(huán)境脅迫等原因嚴重降低了氮肥的利用效率，凈效益比下降[8]。因此，根據(jù)土壤養(yǎng)分狀況，最大限度地發(fā)揮氮肥利用效率，選育氮高效吸收利用的玉米品種，從而減少田間氮肥施用量已成為玉米育種的重要目標之一。玉米的氮素利用效率 (nitrogen use efficiency，NUE) 受品種、氮肥施用量、氮肥施用方法和土壤含氮量等多種因素的影響[9]。目前，玉米的氮肥利用效率平均在30%以下[10]。因此，提高玉米氮肥利用效率是一項非常迫切而重要的研究課題。利用現(xiàn)代生物技術，挖掘與氮高效基因位點緊密關聯(lián)的分子標記，分析其遺傳效應，可促進玉米耐低氮分子標記輔助選擇體系的建立，是培育耐低氮玉米新品種的有效途徑之一[11-12]，其顯著的經濟效益和生態(tài)效益，已逐漸成為玉米育種的方向。

前人曾利用不同的技術手段對植物株型性狀在氮高效利用方面的評價做了大量研究。Rogerio 等[13]研究指出，提高施氮水平將增加葉綠素含量、氨基酸總量、植物干物質中氮含量、株高、分蘗和子粒產量，降低植物干物質中糖含量。Miklos 等[14]認為，玉米葉色的深淺取決于葉綠素的積累，不同的施肥水平和基因型的差異都會明顯影響葉綠素的含量。劉宗華等[15]以農大108 的203 個F2:3 家系為材料，在施氮 (N+) 和不施氮 (N-) 2 種條件下對拔節(jié)期到灌漿期的株高變化進行了動態(tài)QTL 分析。在N-條件下拔節(jié)期至喇叭口期、開花期至灌漿期分別定位了1 和5 個條件QTL；在N+條件下的相應時期分別定位1 和4 個條件QTL。近年來，前人同時通過玉米氮響應相關突變體的研究和QTL 定位等方法鑒定了多個與NUE 相關的基因及位點[16-18]。

葉片是光合作用的重要器官，玉米吐絲前同化物對籽粒產量的貢獻率小于10%，吐絲后葉片光合同化產物是玉米產量的主要來源[19]。因此，研究作物光合特性對低氮脅迫的響應機理，通過提高葉片的光合作用提高作物在低氮脅迫下的產量，改善土壤中氮肥的吸收利用效率，在經濟效益和環(huán)境效益上都具有非常重大的意義。前人通過植物形態(tài)學、生理生化和分子生物學等方法對玉米葉片相關性狀進行了大量研究。Agrama 等[20]首次報道了玉米葉面積QTL。隨后，Reymond 等[21]利用RFLP 標記定位了玉米葉長和葉寬的QTL，并發(fā)現(xiàn)不同環(huán)境下葉夾角和葉長比葉寬更容易受環(huán)境影響。在隨后的研究中，科研工作者利用不同群體在不同環(huán)境下檢測到大量葉形相關性狀的QTL[22-27]。Lian 等[28]利用表達譜芯片全基因組分析水稻苗期低氮脅迫基因表達，結果表明，在低氮脅迫下水稻根系光合相關基因的表達水平被下調了，而在葉片中的表達水平變化很小，推測可能是由于脅迫時間或脅迫程度還未影響葉片基因的表達。趙明輝等[29]研究表明，在低氮脅迫下，2個水稻劍葉的葉綠素含量和凈光合速率都受到了影響，但影響程度在 2 個水稻中有顯著的不同，超綠水稻劍葉的這 2 個指標對低氮脅迫的反應較微弱。郭書磊等[30]通過對620 個葉形QTL 進行整合，利用元分析發(fā)掘出22 個葉長、22 個葉寬、12 個葉面積以及17 個葉夾角mQTL；進一步確定了44 個與葉片發(fā)育密切相關的候選基因。然而，以葉形相關性狀作為研究目標，探究氮素脅迫條件的遺傳機制則少有報道。以玉米單片段代換系為材料，采用施氮和不施氮兩種處理，鑒定不同施氮水平下的葉片相關性狀變異情況，并利用復合區(qū)間作圖法定位控制葉形相關性狀的QTL。通過對兩種施氮條件下的玉米葉形相關性狀進行QTL 定位，發(fā)掘控制玉米葉形相關的遺傳區(qū)段，借助不同條件下的定位結果一致性分析，鑒定出與氮素吸收利用顯著相關的候選遺傳區(qū)段，為揭示玉米氮素效率利用差異以及分子輔助的提高玉米氮利用效率育種提供分子遺傳學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

本研究所用的160 份玉米單片段代換系由河南農業(yè)大學湯繼華教授課題組提供。該群體是以優(yōu)良玉米自交系綜3 為供體親本、許178 為受體親本，通過雜交、回交、自交，結合SSR 分子標記輔助選擇的方法構建而成。綜3 和許178 作為中國玉米育種中的骨干自交系材料，以這兩個材料為親本之一的玉米雜交種豫玉22 號 (綜3 × 87-1) 和農大108 (黃C × 許178) 先后在我國玉米生產上得到了大面積推廣應用。

1.2 試驗區(qū)條件與試驗設計

試驗采用裂區(qū)設計，不同氮處理水平作為主區(qū)，設施氮 (N+) 和不施氮 (N-) 兩個水平，單片段代換系群體 (SSSLs) 作為副區(qū)。2015 年分別在貴州省德江縣 (北緯28°15′51″、東經108°06′39″)、貴陽市 (北緯26°34′13″、東經106°42′39″) 和云南省羅平縣 (北緯24°31′、東經103°57′) 進行田間試驗。小區(qū)行長4.0 m，寬行0.7 m，單行區(qū)，每行17 株，株距0.235 m，密度為52500 plant/hm2，每個處理2 次重復。對代表葉片相關性狀葉面積 (cm2)、葉綠素含量(mg/g) 和穗下綠葉數(shù) (片) 進行田間測定。每個試點的表層土壤基礎肥力狀況見表1。

施氮 (N+) 處理:在苗期增施尿素375 kg/hm2、過磷酸鈣375 kg/hm2、硫酸鉀187.5 kg/hm2，大喇叭口期增施尿素375 kg/hm2。不施氮 (N-) 處理:除不施尿素外，所施P、K 肥與施氮 (N+) 處理完全相同，其它田間管理措施同大田。

葉面積測量從小區(qū)內隨機調查5 株穗位葉:

葉面積 (cm2) = 長 (cm) × 寬 (cm) × 0.75

在玉米灌漿初期，利用Yaxin-1260 葉綠素儀測定玉米穗位葉距離葉柄1/3 處的葉綠素含量，每處理測定5 株，取平均值。穗下綠葉數(shù)在玉米灌漿初期每處理測定5 株，取平均值。采用目測計數(shù)，記為0～1，如，半片綠葉記為0.5。

表 1 供試土壤表層基礎肥力Table 1 Basic fertility of tested soils in 0-20 cm depth

1.3 表型數(shù)據(jù)分析與QTL 定位

采用SPSS17.0 統(tǒng)計軟件，對160 份SSSLs 的開花期進行單因素方差分析和Duncan’s 多重比較。利用復合區(qū)間作圖法對葉形相關性狀QTL 進行定位[31]，若某一性狀與許178 在P ＜ 0.05 水平上差異顯著，則認為該單片段代換系代換片段上存在一個QTL，并同時估算各個QTL 的加性效應值及貢獻率[32]。

加性效應值 (A) = (單片段代換系的表型值-對照的表型值)/2；

貢獻率 (R%) = (加性效應值/對照的表型值) ×100。

2 結果與分析

2.1 玉米葉片相關性狀的表型分析

葉片相關性狀在兩種氮水平下均表現(xiàn)出豐富的表型變異，在施氮條件下，SSSLs 群體的葉面積在貴陽的變異范圍為292～599 cm2，平均值為 (471 ±60) cm2(表2)；在德江和羅平的變異范圍分別為307～621 cm2和354～648 cm2；SSSLs 群體的葉綠素含量在貴陽、德江和羅平的變異范圍分別為32.9～46.1 mg/g、32.8～51.7 mg/g 和39.8～54.7 mg/g。在玉米灌漿初期，SSSLs 群體的穗下綠葉數(shù)在貴陽、德江和羅平的變異范圍分別為1.47～5.35 片、0.60～4.11 片和1.36～4.61 片。

在缺氮條件下，SSSLs 群體葉面積在貴陽、德江和羅平的變化范圍分別為252～504 cm2、166～480 cm2、212～572 cm2；葉綠素含量的變化范圍分別為26.6～45.2 mg/g、21.1～49.2 mg/g、27.9～50.5 mg/g；在玉米灌漿初期，穗下綠葉數(shù)的變化范圍分別為1.15～5.14 片、0.15～3.61 片、0.98～4.40 片。

2.2 玉米葉片相關性狀的QTL 分析

在施氮 (N+) 和不施氮 (N-) 兩種處理條件下，利用復合區(qū)間作圖法共檢測到42 個葉片相關性狀QTL，分布于10 條染色體上 (表3、表4、圖1)，單個QTL可解釋目標表型變異的變幅為6.2%～33.65%，其中在德江點共檢測到19 個QTL，在貴陽點共檢測到16 個QTL，在羅平點共檢測到17 個QTL。

表 2 不同品種及SSSLs 群體葉片相關性狀平均值Table 2 Phenotypic value of SSSLs population in three experimental sites

表 3 施氮處理葉片相關性狀的QTLs Table 3 The leaf traits related QTLs under nitrogen application

表 4 不施氮處理葉片相關性狀的QTLs Table 4 The leaf traits related QTLs under no N supply

圖 1 兩種施氮條件下檢測到的玉米葉片相關性狀QTLFig. 1 The QTL identified for leaf traits in different developing stages under N+ and N- conditions

在施氮 (N+) 條件下，在3 個地點共檢測出8 個葉面積的QTL，其中，qLAI1b 在3 個環(huán)境中同時被檢測到 (表3)。qLAI1b 在德江、貴陽和羅平點對葉面積的貢獻率分別為14.4%、14.5%和16.4%；來自于綜3 的等位基因起增效作用。qLAI3b 在德江和貴陽2 個環(huán)境中檢測到，對葉面積的貢獻率分別為23.7%和16.2%；其余6 個QTL 僅在一個環(huán)境中檢測到。在施氮 (N+) 條件下，在3 個地點共檢測出5 個穗下綠葉數(shù)的QTL，分布在第1、2、7 和9 染色體上，有2 個QTL (qLN7a 和qLN7b) 在3 個環(huán)境中同時被檢測到。qLN7a 在德江、貴陽和羅平點對穗下綠葉數(shù)的貢獻率分別為22.24%、19.12% 和25.8%；而qLN7b 在德江、貴陽和羅平點對穗下綠葉數(shù)的貢獻率分別為18.8%、14.5%和19.5%。在施氮(N+) 條件下，在德江、貴陽、羅平分別檢測到4、2、2 個葉綠素QTL。在德江檢測到的4 個QTL 分布在第3、5、7 染色體上。在貴陽檢測到的2 個QTL分布在第7、10 染色體上。在羅平檢測到的2 個QTL 分布在第3 染色體上。

在氮脅迫 (N-) 條件下，3 個環(huán)境中共檢測出9 個葉面積QTL，分布于第1、2、3、4 和9 染色體上，單個QTL 可解釋的表型變異介于12.5%～27.9%之間，其中qLAI3b 在3 個試驗環(huán)境中同時被檢測到，位于第3 染色體上的bin3.08，在德江、貴陽和羅平的貢獻率分別為20.4%、12.8%和13.2%，來自于許178 的等位基因起增效作用。5 個QTL 在2 個環(huán)境中同時被檢測到。在不施氮 (N-) 條件下共檢測出7 個穗下綠葉數(shù)QTL，其中有2 個QTL 在3 個環(huán)境中重復檢出，其貢獻率在12.6%～29.8%之間。在3 個試驗環(huán)境中重復檢出、效應較大且一致的玉米穗下綠葉數(shù)QTL 主要有bin7.01 區(qū)的qLN7a (umc1642～umc2160～umc1929)，bin 9.01 區(qū)的qLN9 (umc1957～umc1867～umc2078)。

在氮脅迫 (N-) 條件下，在3 個環(huán)境中共檢測出8 個葉綠素QTL，分布在除第5、6、7、8 以外其他染色體上，有1 個QTL 在3 個環(huán)境中同時被檢測到，位于bin 4.08 的bnlg1444～phi 066～umc 2041染色體片段上，在德江、貴陽和羅平點對葉綠素含量的貢獻率分別為17.6%、10.6%和11.4%，且來自于親本綜3 的等位基因起減效作用。

3 討論

前人對玉米氮高效利用的QTL 定位研究已有報道[33-35]。劉宗華等[36]的研究結果表明，葉綠素含量的QTL 表達存在時空性，其中qchl4 和qchl5b 在整個生育時期均能檢測到。Gallais 等[37]在高氮和低氮水平下檢測到的QTL 有很大差別；本研究中，施氮條件下，在染色體bin1.03 區(qū)域檢測到QTL qLAI1b；前人在該區(qū)域檢測出與株型性狀和絲黑穗病抗性相關的QTL-qDH12[38-39]；檢測開花期相關的QTL qDTP1b、QTL qDTS1[33]，一定程度上反映出株型、抗病性和生育期重疊的“一因多效”的作用結果。因此，對玉米葉片相關性狀的QTL 分析，不僅有助于增加對其遺傳結構的了解，發(fā)掘更多候選基因，闡明葉形發(fā)育和形成的分子機制，還可為耐密理想株型的分子標記輔助選擇提供依據(jù)。不施氮條件下，在染色體bin3.08 區(qū)域檢測到1 個QTL qLAI3b；該區(qū)域存在抗大斑病QTL[40]、控制株高QTL[41]。在染色體bin7.01和bin 9.01 區(qū)域，分別檢測到QTL qLN7A 和QTL qLN9；在該區(qū)域檢測到玉米株型、品質和產量等相關性狀的QTL[42-44]。在染色體bin4.08 區(qū)域，檢測到1 個QTL qCHL4a。不同氮素處理下，共檢測出在 3 個試驗環(huán)境中均穩(wěn)定表達且效應較大的一致性QTLs，分別位于bin3.08 區(qū)域QTL qLAI3b、bin7.01 區(qū)域QTL qLN7a 和bin7.05 區(qū)域QTL qLN7b。雖然，該群體重要QTL 區(qū)段在玉米氮素吸收、轉運以及利用過程中的重要性的研究未見報道；但是，本研究結果證明了這些區(qū)段在玉米不同氮素處理過程中均起著重要作用，對于深入挖掘玉米氮素利用效率將提供更為可靠的分子遺傳學信息。

葉片是光合作用的重要器官，氮素供應顯著影響葉片的擴展，通過提高葉片的光合作用效率，從而達到提高作物在氮脅迫下的產量；Tian 等[45]研究發(fā)現(xiàn)，氮高效品種在葉片擴展方面具有明顯優(yōu)勢；在低氮條件下保持了較大的葉片面積，從而保證光合產物的生產用于籽粒灌漿[37]。在本研究中，氮脅迫下 共檢測到4 個葉型相關性狀QTL，分別為QTL qLAI3b、QTL qCHL4a、QTL qLN7A 和QTL qLN9。Bertin 等[46]研究發(fā)現(xiàn)，控制葉片衰老的位于第7 染色體的QTL 可以解釋表型變異的42%，是一個主效基因。氮脅迫條件下檢測到葉型相關性狀QTL 為氮高效分子標記輔助選擇育種提供支撐；但本試驗是在一年多點環(huán)境下，試驗結果仍需進一步驗證。本研究為揭示玉米氮素效率利用差異以及分子輔助的提高玉米氮利用效率育種提供分子遺傳學依據(jù)。

4 結論

在不同環(huán)境條件下，檢測出一些共有的玉米氮響應主效QTLs，如qLAI3b (umc1844～umc1320～bnlg1182)、qLN7a (umc1642～umc2160～umc1929)、qLN7b (phi328175)；在施氮和不施氮條件下均被檢測到；同時還存在一些特異性的QTLs 區(qū)段，如qCHL4a (bnlg1444～phi066～umc2041)、qLN9(umc1957～umc1867～umc2078) 僅在不施氮條件下被檢測到。這些染色體區(qū)段將為進一步改良玉米氮素利用效率以及株型相關候選基因的圖位克隆等提供更多的分子遺傳學支持。

致謝：貴州省旱糧研究所楊明倫老師在田間管理過程中給予幫助，在此表示感謝。