馬震珠，魏倩倩，李尚瑋，楊文權，寇建村

（1.西北農(nóng)林科技大學 草業(yè)與草原學院，陜西 楊凌712100；2.西北農(nóng)林科技大學 生命科學學院，陜西 楊凌712100）

中國是世界蘋果生產(chǎn)第一大國，據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計，2017中國蘋果產(chǎn)區(qū)面積達2.22×105hm2，占世界蘋果產(chǎn)區(qū)總面積的45%［1］。黃土高原位居中國蘋果生產(chǎn)四大產(chǎn)區(qū)之首，且近幾年種植面積還在不斷擴大，是中國蘋果產(chǎn)業(yè)的主力［2］。但許多果園建于干旱少雨、土壤瘠薄的高原溝壑地帶，土壤有機質(zhì)含量偏低、土壤穩(wěn)定供水供肥能力較低［3］，加之近幾年農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整，傳統(tǒng)有機肥減少而商品有機肥成本較高，導致蘋果生產(chǎn)主要依賴化肥。而化肥的過量施用不但使肥料利用率降低，還造成了果園土壤和蘋果質(zhì)量的下降以及環(huán)境污染等問題［4-5］。在一些發(fā)達國家，普遍采用果園生草模式，近些年在中國也大力推廣［6］。因為果園生草不僅可以提高土壤保水能力、減少水土流失、環(huán)境污染，還可以通過牧草降解改善果園土壤質(zhì)量，提高土壤有機質(zhì)，為果園提供穩(wěn)定的有機肥源［7-8］。

土壤中的微生物是整個土壤生態(tài)系統(tǒng)里最為活躍的組成，對土壤質(zhì)量，肥力功能以及可持續(xù)發(fā)展都存在著不容忽視的作用［9］。土壤細菌約占土壤微生物的70%～90%［10］，它們直接參與土壤中有機質(zhì)的分解、合成等各項生物循環(huán)［11］。對土壤細菌的傳統(tǒng)研究是通過室內(nèi)培養(yǎng)來進行的，但土壤中存在許多不可培養(yǎng)的細菌，因此傳統(tǒng)研究下得到的土壤細菌信息量較少。高通量測序是目前使用廣泛的現(xiàn)代生物技術之一，尤其在土壤微生物的相關研究中運用較多，采用此種技術不用像傳統(tǒng)手段一樣依賴細菌的分離培養(yǎng)，從環(huán)境中即可獲取基因信息，能夠快速、高效、準確且全面地反映土壤細菌多樣性的真實情況［12］。

植物殘體回歸土壤會引起土壤生態(tài)以及肥力變化，這些變化必然對土壤細菌產(chǎn)生影響，這類研究多見于森林及農(nóng)田生態(tài)系統(tǒng)［13-14］。有關果園白三葉返還蘋果園土壤對細菌多樣性的研究未見報道，本研究將蘋果園白三葉分別以覆蓋和埋置兩種方式返園，探究在不同降解時期果園土壤細菌多樣性的變化，以期為白三葉在果園中更好的利用及果園生草模式的推廣提供一定的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗地概況

試驗地選自陜西省延安市洛川縣無公害蘋果示范園，該地區(qū)地處東經(jīng)109°13′，北緯35°26′。該地區(qū)位于黃土高原腹地海拔1 100 m，氣候?qū)儆谂瘻貛О霛駶櫚敫珊荡箨懶约撅L氣候，年平均氣溫9.2°C，年平均降水622 mm，降水主要集中在5—9月，全年無霜期167 d。日照時數(shù)達2 448.6 h，日照充足，晝夜溫差大。土壤為黑壚土，質(zhì)地為中壤，土層深厚。試驗區(qū)地勢、地貌、土質(zhì)等自然條件一致，試驗果園種植半矮化紅富士，采用旱作耕作模式。

1.2 試驗設計

2014年5月27日，將蘋果樹行間的白三葉刈割后分裝于20 cm×20 cm 的尼龍袋中，每袋裝新鮮莖葉200 g。在果樹行間等距離挖深40 cm 寬30 cm 的溝，將挖出土壤均勻混合，備用。試驗設2 個處理。（1）覆蓋。將備用土壤分裝于30 cm×30 cm×40 cm的軟塑料盆中，放入溝內(nèi)，與地面持平，將裝有白三葉的尼龍袋覆蓋于花盆土壤表面，壓平；

（2）埋置。在容器內(nèi)裝入15～20 cm 備用土，將裝有白三葉的尼龍袋平放至上層，壓平，覆土至裝滿容器，容器頂端與地面持平。對照組不放白三葉，僅用備用土裝滿容器。每個處理5次重復。

1.3 土壤樣品采集

在白三葉降解1，3，6和12個月分別時采集土壤樣品。采樣時，將容器內(nèi)土壤混合均勻，去除雜質(zhì)，采用四分法留取土樣。部分裝入鋁盒內(nèi)用于土壤含水量測定，其余部分過20目篩、混合均勻后密封，儲存于－80 ℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 土壤微生物總DNA 提取及檢測

稱取1 g 土樣，使用E.Z.N.A.土壤基因組DNA 試劑盒（Omega公司，美國）按試劑盒操作說明，進行土壤微生物總基因組DNA 提取和純化。采用紫外分光光度計法檢測DNA 濃度及純度，用0.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測DNA 樣品的完整性。

1.5 PCR擴增及產(chǎn)物純化

以20 ng DNA 為模板，使用引物：515F（5-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3）和806R（5-GGACTACVSGGGTATCTAAT-3）擴增土壤細菌16S r DNA上的V4 高度可變區(qū)。聚合酶鏈反應（polymerase chain reaction，PCR）擴 增 條 件 為：98 ℃5min；98 ℃30 s，50 ℃30 s，72 ℃30 s，27 個循環(huán)；72 ℃延伸5 min。完成PCR 擴增后，對產(chǎn)物進行檢測，合格產(chǎn)物用AxyPrep DNA 凝膠回收試劑盒（Axygen公司，美國）進行切膠回收，并做純化。另外，通過PCR 向16S rDNA 的PCR 產(chǎn)物末端加上帶有Index 的接頭，以便進行NGS測序。

所有數(shù)據(jù)均錄入SPSS19.0統(tǒng)計學軟件進行分析,計量資料以均數(shù)±標準差,采用t檢驗,以p<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

1.6 文庫質(zhì)檢及定量

使用Agilent 2100 生物分析儀（Agilent Technologies，Palo Alto，CA，USA）檢測文庫質(zhì)量，通過Qubit2.0 Fluorometer（Invitrogen，Carlsbad，CA）檢測文庫濃度。DNA 文庫混合后，使用Illumina MiSeq平臺進行測序。

1.7 數(shù)據(jù)分析

雙端測序得到的正反向reads首先進行兩兩組裝連接，過濾拼接結(jié)果中含N 的序列，保留序列長度大于200 bp的序列。經(jīng)過質(zhì)量過濾，去除嵌合體序列，最終得到的序列用于操作分類單元即OTU（operational taxonomic units）分析，使用Qiime（1.9.1）軟件RDP classifier貝葉斯算法對97%相似水平的OTU 代表序列進行分類學分析，比對參考數(shù)據(jù)庫，在各個水平統(tǒng)計每個樣本的群落組成。

用R 語言軟件生成不同分類水平上的物種分布圖，并將屬水平下TOP 20 物種豐度繪制為聚類熱圖。基于OTU 分析結(jié)果，統(tǒng)計不同分組共有和特有的OTU，繪制韋恩圖。根據(jù)OTU 列表中的各樣品物種豐度信息，應用Qiime中的alpha_diversity.py命令計算Shannon，ACE及Chao1等指數(shù)，并作稀釋曲線?；贐rary-Curtis樣本間距離矩陣用R 語言軟件進行PCA 分析并做圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 測序結(jié)果及土壤菌群多樣性分析

OTU（operational taxonomic units）即操作分類單元，是在群體遺傳學研究中，為了便于分析，人為設置的分類統(tǒng)一標志，通常在97%的相似水平下對所有序列進行OTU 劃分。本試驗中不同時期采集的各樣本OTU 數(shù)如表1所示。

本試驗中12個樣本隨著有效序列數(shù)的增加均表現(xiàn)為先快速增長，然后增速變緩，說明所有樣本的物種組成比較均勻。此外，當有效序列數(shù)達到5 000時，增速趨于平緩，所有樣本的有效序列數(shù)目均超過5 000（見圖1），說明測序數(shù)據(jù)量已經(jīng)足以真實反映樣品中所有的物種組成。

表1 測序獲得的土壤細菌OTU 數(shù)

2.2 土壤細菌OTU 概況

分別在不同降解時期，對土壤細菌OTU 進行對比分析。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在降解1，3，6，12 個月時，對照（CK）土壤細菌特有的OTU 數(shù)量分別為123，159，95，65，覆草處理（CG）特有的OTU 數(shù)量分別為131，102，90，171，埋草處理（BG）特有的OTU 數(shù)量分別為175，158，160，120（見圖1）。分析比對各處理在不同降解時期特有的OTU，發(fā)現(xiàn)對照、覆草處理和埋草處理中分別有338，324和378個不同降解時間特有的OTU，分別占不同處理特有OTU 的76%，66%，62%（見圖2）。

圖1 不同返園方式下土壤細菌群落OUT的韋恩圖

通過對不同降解時間特有OTU 對應物種的豐度分析發(fā)現(xiàn)，特有OTU 對應的土壤菌群在門水平上主要有以下幾種：厚壁菌門（Firmicutes）、浮霉菌門（Planctomycetes）、芽 單 胞 菌 門（Gemmatimonadetes）、變 形 菌 門 （Proteobacteria）、酸 桿 菌 門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、綠彎菌門（Chloroflexi）、藍細菌門（Cyanobacteria）以 及 疣 微 菌 門（Verrucomicrobia）（見表2）。值得注意的是，覆草降解一個月時，其土樣菌群中還存在一定量的梭桿菌門（Fusobacteria），而相同降解時間下的埋草處理和對照組中則未出現(xiàn)；埋草處理在降解1，3，12個月時土樣中均有廣古菌門（Euryarchaeota），且降解1 個月時還有泉古菌門（Crenarchaeota）。另外，在覆草和埋草處理中增加了硝化螺旋菌門（Nitrospira）和螺旋體門（Spirochaetes）。

表2 各處理在不同降解時間特有物種門水平分布 %

圖2 不同返園方式特有的OTU 在不同降解時期土壤細菌群落的韋恩圖

2.3 土壤細菌群落多樣性

ACE指數(shù)和Chao1指數(shù)是在生態(tài)學中估計物種總數(shù)的兩種常用指數(shù)，均由Chao最早提出［15］，兩種指數(shù)算法有所不同，但都能夠用來估計群落中OTU數(shù)目，反映菌群豐度。ACE 和Chao1 指數(shù)越大則表示土壤菌群豐度越高。在本試驗中降解1，3，6，12個月時，覆草和埋草的Chao1和ACE指數(shù)均高于對照。在降解1個月和3個月時，埋草處理的ACE 指數(shù)高于覆草處理，然而在降解6個月和12個月時，埋草處理的ACE 指數(shù)則低于覆草處理（見表3）。Shannon指數(shù)［16］用來估算樣本中的微生物多樣性。覆草和埋草處理的Shannon指數(shù)均高于對照，且埋草的Shannon指數(shù)比覆草的高（見表3）。

表3 土壤細菌豐富度和多樣性指數(shù)

2.4 土壤細菌群落物種豐度

本試驗對所有樣本在不同分類水平下的土壤菌群豐度進行了分析。從門水平來看，共有22種細菌被檢出，其中豐度較高的菌群有厚壁菌門（Firmicutes）、酸桿菌門（Acidobacteria）、擬桿菌門（Bacteroidetes）、放線菌門（Actinobacteria）、變形菌門（Proteobacteria）、藍 細 菌（Cyanobacteria）及 浮 菌 門（Planctomycetes）（見表4）。在不同處理下土壤主要菌群豐度存在差異，和對照相比，覆草和埋草處理的厚壁菌豐度降低；擬桿菌、藍細菌和變形菌豐度增高，且覆草處理高于埋草處理；埋草處理浮霉菌豐度增加。

2.5 土壤細菌群落物種結(jié)構(gòu)

將屬水平TOP 20的物種分布繪制為聚類熱圖（見圖3），通過顏色差異可直觀顯示菌群的相似性和差異性，圖中由灰到黑代表菌群豐度由高到低。橫向為樣本分組聚類樹，不同分解時間分為兩類，降解1個月和3個月的所有樣本歸為一類，6個月和12個月歸為一類。縱向為物種聚類樹，TPO 20菌群被分為4 類，聚類Ⅰ由分支桿菌屬（Mycobɑcterium）、馬賽菌屬（Mɑssiliɑ）、假單胞菌屬（Pseudomonɑs）、節(jié)桿菌屬（Arthrobɑcter）、乳球菌屬（Lɑctococcus）以及（Solirubrobɑcte）組成；聚類Ⅱ由芽單胞菌屬（Gemmɑtimonɑs）、Opitutu、黃 桿 菌 屬（Flɑvobɑcterium）和Arenimonɑs組成；聚類Ⅲ由硝化螺旋菌屬（Nitrospirɑ）、奈瑟菌屬（Neisseriɑ）、Pirellulɑ 和Steroidobɑcter 組 成；聚 類Ⅳ由 鞘 氨 醇 單 胞 菌 屬（Sphingomonɑs）、溶桿菌屬（Lysobɑcter）、珊瑚球菌屬（Corɑllococcus）、Flɑvisolibɑcte、Adhɑeribɑcter 及Skermɑnellɑ 組成。

不同物種聚類的菌群豐度在不同降解時間存在差異，聚類Ⅰ在降解1個月、6個月和12個月時菌群豐度高，而3個月時其豐度低；聚類Ⅱ細菌的豐度隨著降解時間的增加而增加；聚類Ⅲ細菌在降解前期（1個月和3個月）豐度高，而降解后期（6 個月和12 個月）降低；聚類Ⅳ細菌在降解1個月時豐度最高。

表4 土壤細菌門水平菌群豐度 %

圖3 土壤細菌豐度前20個屬的聚類熱圖

2.6 土壤細菌群落主成分分析

本試驗對TOP 20菌群分布進行了主成分分析（見圖4）。結(jié)果表明，各處理多數(shù)樣本點分別集中到坐標圖的不同位置，說明不同處理下的土壤細菌結(jié)構(gòu)存在差異。從降解時間來看，降解1個月和3個月時的樣本點分別聚集，降解6個月和12個月的樣本點聚集到了一起。有9個屬的土壤菌群對PC1（第一主成分）貢獻較大（負載的絕對值大于0.2），主要來自變形菌門和放線菌門，有12 個屬對PC2（第二主成分）貢獻較大，主要來自變形菌門和擬桿菌門。

圖4 土壤細菌群落豐度前20屬主成分分析

3 討論

3.1 白三葉降解對土壤微生物群落結(jié)構(gòu)的影響

白三葉返園未對土壤微生物優(yōu)勢菌群種類產(chǎn)生顯著影響，不同處理組與對照間共有OTU 較多，但優(yōu)勢菌群的豐度在對照與兩種返園處理組間均存在顯著差異，并且出現(xiàn)了一些特有OTU，說明白三葉的兩種返園方式均對土壤細菌群落結(jié)構(gòu)產(chǎn)生了影響，這一結(jié)果與之前一些其他外源有機物返園研究結(jié)果一致［17］。白三葉返園后土壤中出現(xiàn)了梭桿菌門、廣古菌門、泉古菌門、螺旋體門和硝化螺旋菌門，說明這些菌與白三葉的降解高度相關。

兩種返園方式下特有OTU 分散在不同降解時間，同一時期重疊較少，推測這些菌群可能參與白三葉降解的不同過程。植物殘體在土壤中的分解轉(zhuǎn)化在不同時期的化學結(jié)構(gòu)存在較大的差異，降解前期主要分解一些容易被微生物代謝利用的碳水化合物，后期則是一些諸如木質(zhì)素、單寧等較難分解的物質(zhì)，這也是菌群在不同時期結(jié)構(gòu)有所不同的主要原因［18］。同時，覆草和埋草處理會對土壤環(huán)境造成一些影響，水分、溫度以及光照等因素也會對微生物的生長和有機物降解產(chǎn)生影響，對土壤肥力而言此類影響通常都是積極的［19］。不同降解時期不同菌群的增加，有助于果園各種植物殘體的分解利用。植物殘體是有機質(zhì)的重要來源［20］，植物殘體的分解速率決定著生態(tài)系統(tǒng)中各類養(yǎng)分循環(huán)的效率，對土壤養(yǎng)分有效性的高低有著重要影響［21］，因此，通過菌群變化可以判斷覆草和埋草均有利于果園土壤養(yǎng)分的積累和有效利用。

3.2 白三葉降解對土壤微生物群落物種分布及其豐度的影響

在蘋果園覆蓋或埋置白三葉對土壤細菌群落分布存在顯著影響，且不同降解時期存在差異。在兩種返園處理組中酸桿菌、擬桿菌、變形菌等細菌豐度提高。酸桿菌是土壤中一類重要的細菌類群，占土壤細菌總量的20%左右［22］，酸桿菌和擬桿菌門具有纖維素降解功能［23］，酸桿菌相對豐度與多糖含量、土壤理化性質(zhì)及肥力狀況密切相關［24］變形菌門是一種重要的固氮菌，其大多數(shù)細菌在土壤氮素循環(huán)、去磷以及有機物降解中有著重要的功能［25］。白三葉返園使得這些有益菌增多，說明兩種返園方式均可通過提高土壤有益細菌豐度，促進土壤有機質(zhì)的積累和轉(zhuǎn)化，培肥地力，優(yōu)化土壤理化性質(zhì)。一些研究發(fā)現(xiàn)厚壁菌門細菌能夠促進植物殘體分解，增強土壤肥力［26］。但在本研究中，白三葉返園后厚壁菌門豐度卻低于對照，這可能是由于植物殘體的種類、大小以及在土壤中位置的不同造成的［27］，此外，環(huán)境以及氣候條件等綜合因素也會影響微生物群落豐度［28］。

本研究發(fā)現(xiàn)在不同降解時期，屬水平TOP 20細菌豐度存在明顯差異，即隨著白三葉降解時間增加，芽單胞菌、黃 桿 菌、Opitutu 和Arenimonɑs 屬 的 細 菌豐度增高，而硝化螺旋菌屬、奈瑟菌屬、Pirellulɑ 和Steroidobɑcter 的相對豐度降低。焦奎寶［29］研究表明，土壤硝化螺旋菌的豐度與有機物含量有關。因此，白三葉隨著降解時間增長養(yǎng)分釋放量逐漸減少是造成這一現(xiàn)象的主要原因。此外，鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、珊瑚球菌屬、Flɑvisolibɑcte，Adhɑeribɑcter和Skermɑnell等菌群均大量存在于降解前期，可能與該時期土壤中存在易于降解的物質(zhì)以及前期降解過程中釋放出的大量可溶物質(zhì)有關［30］。

4 結(jié)論

（1）白三葉覆蓋和埋置返園處理下，蘋果園土壤微生物優(yōu)勢菌群種類未表現(xiàn)出顯著變化，豐度存在差異。返園處理組土壤中出現(xiàn)梭桿菌門、廣古菌門、泉古菌門、螺旋體門和硝化螺旋菌門等特有菌群，分散于不同降解時期，與白三葉降解過程高度相關。

（2）白三葉覆蓋和埋置返園，對蘋果園土壤細菌群落分布存在顯著影響，且不同降解時期存在差異，在兩種返園處理組中酸桿菌、擬桿菌、變形菌等細菌豐度增高，厚壁菌門豐度降低。

（3）隨著白三葉降解時間增加，芽單胞菌、黃桿菌、Opitutu和Arenimonɑs 屬的細菌豐度增高，硝化螺旋菌屬、奈瑟菌屬、Pirellulɑ 和Steroidobɑcter 的相對豐度降低；鞘氨醇單胞菌屬、溶桿菌屬、珊瑚球菌屬，F(xiàn)lɑvisolibɑcte，Adhɑeribɑcter 和Skermɑnell 等菌群均大量存在于降解前期。