胡 晟 鄒 浩 周 磊 邱嵐茜 張小文

膽管惡性腫瘤(biliary tract cancers, BTCs)預(yù)后較差，其特點(diǎn)是早期侵犯淋巴結(jié)和全身轉(zhuǎn)移[1]。這類疾病包括膽囊癌(gallbladder cancer, GBC)和膽管癌(cholangiocarcinoma, CCA)，分為肝內(nèi)膽管癌(intrahepatic cholangiocarcinoma, iCCA)和肝外膽管癌(extrahepatic cholangiocarcinoma, eCCA)。目前，手術(shù)切除仍是治療BTCs的主要方法，輔助性放化療并不是這些惡性腫瘤的首選。此外，在行根治性手術(shù)后許多患者仍會(huì)復(fù)發(fā)，復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移性BTCs患者的預(yù)后通常較差。因此，有必要對(duì)BTCs潛在生物學(xué)標(biāo)志物進(jìn)行進(jìn)一步的研究，以便對(duì)BTCs行早期診斷、進(jìn)行綜合性治療及判斷患者預(yù)后。最近的研究已經(jīng)將微RNA(microRNA，miRNA)描述為某些惡性腫瘤的潛在生物學(xué)標(biāo)志物。然而，miRNA的表達(dá)及其如何對(duì)BTCs的診斷、預(yù)后和治療產(chǎn)生影響的機(jī)制尚未清楚。雖然miRNA是一種非編碼小RNA(19～23個(gè)核苷酸)，但其在調(diào)控大量重要的生物學(xué)功能方面發(fā)揮了重要作用，研究miRNA有利于BTCs的診斷、預(yù)后和治療。miRNA通過與mRNA3′非編碼區(qū)(3′UTRs)的結(jié)合調(diào)控并表達(dá)特異的靶基因，這些表達(dá)對(duì)于不同類型的惡性腫瘤的疾病發(fā)展起著至關(guān)重要的作用，包括腫瘤細(xì)胞的增殖、分化、凋亡、遷移和侵襲。

一、miRNA的調(diào)控機(jī)制及其靶向基因

目前有關(guān)miRNA生物起源和成熟的研究模型表明，該過程首先在細(xì)胞核中進(jìn)行，然后在細(xì)胞質(zhì)中進(jìn)行[2]。miRNA的生物起源的最關(guān)鍵一步是miRNA的前體pri-miRNA的形成,通常由RNA聚合酶Ⅱ轉(zhuǎn)錄生成，其長度一般為幾千個(gè)核苷酸[3]。盡管如此，pri-miRNA通常包含4個(gè)尿嘧啶，其轉(zhuǎn)錄過程將被轉(zhuǎn)錄酶Ⅲ終止。由核糖核酸酶Ⅲ催化，促使pre-miRNA分裂，形成了由70個(gè)核苷酸左右組成的前體miRNA(pre-miRNA)。由于雙鏈RNA結(jié)合域(dsRBD)和狄喬治氏相關(guān)蛋白8抗體(DGCR8)蛋白的作用，所以pri-miRNA轉(zhuǎn)化為pre-miRNA的過程是高效的。隨后，pre-miRNA通過結(jié)合一個(gè)稱為輸出蛋白5的核出口因子，將前miRNA運(yùn)輸?shù)郊?xì)胞質(zhì)中，并在Dicer酶的催化下形成成熟的雙鏈miRNA[4]。該成熟miRNA的功能鏈主要參與RNA誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(RNA-induced silencing complex，RISC)的形成，它通過降解相應(yīng)的mRNA或抑制編碼蛋白的合成，對(duì)靶基因的表達(dá)產(chǎn)生負(fù)性作用。通過miRNA和mRNA的靶向基因3UTR近乎完美的堿基互補(bǔ)，轉(zhuǎn)錄后的基因可以保持沉默[5]。

盡管miRNA的生物起源已越來越確定，但其潛在的調(diào)控機(jī)制仍然不太清楚[6]。大量的研究證據(jù)表明，miRNA表達(dá)的調(diào)控機(jī)制包括轉(zhuǎn)錄解控、表觀遺傳學(xué)改變、突變、DNA復(fù)制異常以及miRNA在其生物起源中存在的缺陷，這些機(jī)制可能與人類癌癥中miRNA的解控機(jī)制密切相關(guān)[7]。此外，研究的重點(diǎn)是miRNA表達(dá)的表觀遺傳學(xué)改變和甲基化和組蛋白修飾對(duì)miRNA的表達(dá)，這兩者都是表觀遺傳基因調(diào)控的標(biāo)志[8]。例如,在膽管癌(cholangiocarcinoma, CCA)細(xì)胞中，miR-370作為一種抑癌基因可抑制原癌基因的致敏蛋白激酶8 (MAP3K8)[9]。此外，白介素-6 (IL-6)過表達(dá)CCA通過DNA超甲基化降低miR-370表達(dá)，同時(shí)恢復(fù)MAP3K8表達(dá)，這有助于腫瘤細(xì)胞生長，促進(jìn)CCA的進(jìn)展。另一項(xiàng)研究表明，miR-370的免疫球蛋白-二甲基甲酰胺(IG-DMR)表達(dá)反應(yīng)了IL-6在人類CCA誘導(dǎo)的高甲基化調(diào)控[10]。

據(jù)報(bào)道，幾種轉(zhuǎn)錄因子通過與miRNA的調(diào)控區(qū)域結(jié)合，促進(jìn)miRNA的轉(zhuǎn)錄進(jìn)而促進(jìn)miRNA的表達(dá)。例如，螺旋-環(huán)-螺旋型亮氨酸的轉(zhuǎn)錄因子(c-Myc)的表達(dá)增加，可以直接結(jié)合miR-17的調(diào)控區(qū)域來促進(jìn)miRNA的表達(dá)[11]。miRNA的上調(diào)可能是由于擴(kuò)增、轉(zhuǎn)錄因子的失調(diào)和CpG島在人類癌癥特異性miRNA基因啟動(dòng)子區(qū)域的脫甲基作用。此外，單核苷酸多態(tài)性(single nucleotide polymorphism，SNPs)普遍存在于miRNA基因中，可以調(diào)節(jié)miRNA的數(shù)量使其具有多種功能，這可能與腫瘤的發(fā)生和發(fā)展有密切關(guān)系[12]。

miRNA可以作為腫瘤致癌基因或抑癌基因，這在很大程度上取決于其靶基因的作用。一個(gè)miRNA可以調(diào)節(jié)許多不同的靶mRNA，相反地，幾個(gè)不同的miRNA可以對(duì)一個(gè)目標(biāo)mRNA進(jìn)行聯(lián)合調(diào)控。因此，miRNA及其靶向基因?qū)⑿纬蓮?fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)。在癌癥中上調(diào)的miRNA可作為腫瘤致癌基因，通過抑制抑癌基因的表達(dá)和抑制參與細(xì)胞增殖或凋亡的基因來促進(jìn)癌癥的發(fā)生，而下調(diào)的miRNA可作為腫瘤抑癌基因從而抑制癌癥的發(fā)生。最近，越來越多的研究者對(duì)癌癥潛在的基因變異進(jìn)行了深入研究，例如癌基因和抑癌基因在人類BTCs發(fā)病機(jī)制中的作用[13]。

二、miRNA在膽管惡性腫瘤中的作用及臨床意義

根據(jù)目標(biāo)mRNA的作用，大量解控的miRNA被歸類為原癌基因miRNA和抑癌基因miRNA。在BTCs中，研究較為透徹的miRNA是hsa-miR-21，它通常被認(rèn)為是一種原癌基因miRNA，因?yàn)樗倪^表達(dá)與腫瘤細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移有關(guān)[14]。Liu等[15]觀察到hsa-miR-21在過表達(dá)后可顯著促進(jìn)腫瘤細(xì)胞遷移、侵襲并能夠?qū)⑵滢D(zhuǎn)化為CCA細(xì)胞系(QBC939和RBE)。此外，在hsa-miR-21過表達(dá)后可表現(xiàn)出E-cadherin表達(dá)減少、N-cadherin和波形蛋白表達(dá)增加。因此，hsa-miR-21可誘導(dǎo)CCA的上皮細(xì)胞間質(zhì)化(EMT)。在這一過程中，上皮細(xì)胞失去了細(xì)胞極性和細(xì)胞黏附功能，這可能是由于E-cadherin表達(dá)的減少，使得細(xì)胞可以遷移和侵襲周圍組織；E-cadherin表達(dá)減少或缺失在腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移過程中起著關(guān)鍵的作用。

相似的，miRNA的異常表達(dá)同樣能誘導(dǎo)EMT并增強(qiáng)GBC細(xì)胞的遷移能力。Bao等[16]報(bào)道hsa-miR-101過表達(dá)可抑制GBC細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，誘導(dǎo)E-cadherin和β-catenin的表達(dá)增加，并導(dǎo)致波形蛋白表達(dá)減少。此外，研究者發(fā)現(xiàn)hsa-miR-101的下調(diào)與腫瘤直徑、侵襲、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、TNM分期以及GBC患者的生存率低有關(guān)。這些結(jié)果表明，hsa-miR-101在GBC中發(fā)揮了抑癌基因作用，減弱了EMT和細(xì)胞轉(zhuǎn)移。

越來越多的研究表明hsa-miR-146b-5p具有重要的抑癌作用[17]。與鄰近的非腫瘤組織相比，GBC組織的hsa-miR-146b-5p基因表達(dá)明顯下調(diào)。此外，SGC-996 GBC細(xì)胞系中hsa-miR-146b-5p的過表達(dá)可抑制細(xì)胞的生長、加速細(xì)胞凋亡、抑制G1期細(xì)胞生長。然而，表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor, EGFR)作為一種結(jié)合表皮生長因子(可誘導(dǎo)細(xì)胞增殖)的細(xì)胞表皮蛋白，其過量表達(dá)可逆轉(zhuǎn)hsa-miR-146b-5p抑制細(xì)胞增殖的能力。此外，hsa-miR-146b-5p的表達(dá)水平與腫瘤的直徑和腫瘤的進(jìn)展有顯著的相關(guān)性[18]。

最近的研究已經(jīng)將hsa-miR-135a-5p描述為具有抑癌作用的一類基因[19]。在GBC中，Zhou等[20]發(fā)現(xiàn)，與鄰近的非腫瘤膽囊組織相比，hsa-miR-135a-5p在腫瘤組織中的表達(dá)明顯下調(diào)，特別是在Ⅲ級(jí)和Ⅳ級(jí)腫瘤中。hsa-miR-135a-5p抑制GBC細(xì)胞在G1/S期的增殖和復(fù)制能力，這些研究提示hsa-miR-135a-5p可能抑制GBC細(xì)胞的增殖。

三、miRNAs作為膽管惡性腫瘤的生物學(xué)標(biāo)志物

在CCA患者血清中miRNA-106a表達(dá)明顯降低，與良性膽管疾病(benign biliary tract disease，BBD)和健康人群相比差異明顯，miRNA-106a下調(diào)與腫瘤淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和患者預(yù)后不佳密切相關(guān)。值得注意的是，miRNA-106a的血清表達(dá)水平逐漸下降，在健康個(gè)體中表達(dá)最高，在BBD患者中表達(dá)中等，在CCA患者中表達(dá)最低。

Meng等[21]描述了一種可作為膽管癌生物學(xué)標(biāo)志物的miRNA，他們發(fā)現(xiàn)miR-21和miR-200b與吉西他濱的敏感度或耐藥性有關(guān)。目前已有各種文獻(xiàn)報(bào)道了循環(huán)miRNA在BTCs中診斷和預(yù)后潛在的臨床價(jià)值，大多數(shù)miRNA在CCA中表達(dá)，而在GBC和壺腹腺癌中表達(dá)較少。Li等[22]分析了GBC患者循環(huán)miRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-21、miR-187和miR-202上調(diào);相比之下，在GBC患者和健康對(duì)照組(P<0.05)之間，miR-143和miR-335下調(diào)(P<0.05)，在組織和血液樣本中出現(xiàn)一致的表達(dá)。此外, 3種miRNA(miR-187、miR-143、miR-202)和淋巴轉(zhuǎn)移的差異表達(dá)之間存在顯著的關(guān)系，miR-21的過表達(dá)更與TNM分期的進(jìn)程密切相關(guān)，這意味著臨床醫(yī)師可以聯(lián)合利用CA19-9和miR-21來鑒別診斷BTCs和健康人群。術(shù)后循環(huán)miR-21表達(dá)下降。此外，miR-21在人的CCA組織和細(xì)胞系中均呈過度表達(dá)，其敏感度和特異性分別為95%和100%，足以區(qū)分CCA與正常組織[23]。

Plieskatt等[24]對(duì)iCCA腫瘤組織中的miRNA表達(dá)水平進(jìn)行了綜合分析，發(fā)現(xiàn)8個(gè)miRNA(miR-483-5p、miR-505-3p、miR-874、miR-885-5p、miR-320b、miR-92b-3p、miR-1275和miR-1307-3p)的表達(dá)僅在iCCA患者血漿樣本中檢測出，而未在對(duì)照組血漿中檢測出。此外，腫瘤組織中異常的miRNA表達(dá)與在血漿中觀察到的不相符，其中有15個(gè)高度管制的miRNA僅在腫瘤組織樣本中檢測到。故血漿中的這個(gè)表達(dá)譜可以作為早期診斷iCCA的生物學(xué)標(biāo)志物。Wang等[25]研究了miRNA在腫瘤組織和對(duì)照血漿樣本中的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)miR-150表達(dá)顯著，在ICC血漿患者中上調(diào)，在腫瘤組織中觀察到在組織中下調(diào)的相反結(jié)果。miR-150表達(dá)水平與患者年齡、性別和腫瘤分期比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Huang等發(fā)現(xiàn)miR-224在血清中明顯上調(diào)，與健康對(duì)照組相比CCA患者腫瘤組織中miR-224也有明顯地上調(diào)。此外，以miR-224干預(yù)人類CCA細(xì)胞系可增強(qiáng)細(xì)胞生長、侵襲性和遷移能力。Kojima等研究了大量的BTCs和胃腸道腫瘤病例，他們發(fā)現(xiàn)，66個(gè)miRNA在測試隊(duì)列中比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中30個(gè)miRNA被上調(diào)，36個(gè)miRNA在BTCs中下調(diào)。在BTCs和健康組的比較中，miR-125a-3p和miR-6893-5p的表達(dá)表現(xiàn)出最小的P值。同時(shí)，Que等對(duì)壺腹癌(ampullary carcinoma,AC)中部分循環(huán)miRNA的表達(dá)進(jìn)行了評(píng)價(jià)，選取了與胰腺腺癌(pancreatic adenocarcinoma,PA)相關(guān)的4個(gè)miRNA(miR-17-5p、miR-21、miR-155和miR-196a)，以評(píng)價(jià)血清體外miRNA水平。PA患者與AC患者的miR-21和miR-17-5p的表達(dá)水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，此外這些miRNA在AC中的表達(dá)往往高于健康對(duì)照組。根據(jù)這些結(jié)果，所選的miRNA對(duì)胰腺癌和BTCs比較，差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

Cheng等的另一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，與BBD患者或健康對(duì)照組相比，CCA患者的循環(huán)miR-106a下調(diào)。此外，CCA患者血清miR-21表達(dá)水平高于BBD對(duì)照組。利用血清miR-106a的曲線面積(area under the curve,AUC)從健康對(duì)照組區(qū)分CCA患者為0.89;該標(biāo)記的敏感度和特異性分別為81.6%和85.0%。這一結(jié)果的敏感度和特異性比血清CA19-9要高。與此同時(shí)，血清樣本中miR-106a的下調(diào)與CCA患者的淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和預(yù)后不佳有關(guān)。

四、展 望

miRNA具有巨大的科學(xué)和臨床意義，目前越來越清楚地認(rèn)識(shí)到這種非編碼RNA是導(dǎo)致惡性腫瘤的一個(gè)主要因素。miRNA不僅提示了作為BTCs新的治療靶點(diǎn)，并且利于我們更多地了解導(dǎo)致BTCs細(xì)胞癌變的病理過程。miRNA通過直接轉(zhuǎn)錄抑制已知的腫瘤抑制基因，直接促進(jìn)腫瘤細(xì)胞的增殖和侵襲性，是一種強(qiáng)有力的致癌基因。miRNA不僅能在細(xì)胞增殖、分化和凋亡等方面發(fā)揮重要的作用，而且還能作為癌基因、腫瘤抑制物、新生物學(xué)標(biāo)志物在診斷和預(yù)后中發(fā)揮作用，以及在BTCs中作為化療耐藥的增強(qiáng)劑。此外，miR-21、miR-187、miR-143和miR-202的表達(dá)與腫瘤進(jìn)展和淋巴轉(zhuǎn)移之間存在顯著的關(guān)系。綜上所述，這些研究反映出miRNA可作為臨床應(yīng)用的潛在生物學(xué)標(biāo)志物，用于BTCs的早期診斷及判斷其預(yù)后。因此利用miRNA作為早期診斷性生物學(xué)標(biāo)志物可能是改善BTCs患者預(yù)后的一個(gè)有效手段。然而，迄今為止很少有研究明確指出在miRNA在BTCs患者中的意義。故目前仍需要更多研究數(shù)據(jù)來確定哪些miRNA可作為BTCs的潛在治療靶點(diǎn)或診斷和預(yù)后生物學(xué)標(biāo)志物，所以進(jìn)一步研究循環(huán)miRNA在BTCs患者中的意義仍是以后科研及臨床的迫切需求。