蘇云娟，陳鐵紅，申海靜，陳 雪，劉冰洋，韓 旭，李 崢

0引言

角膜水腫是一種臨床癥狀，其特征是由于多余的水積聚到基質(zhì)層而導(dǎo)致角膜厚度增加，通常繼發(fā)于角膜內(nèi)皮功能下降等疾病，包括Fuchs角膜內(nèi)皮營養(yǎng)不良(FED)晚期和手術(shù)創(chuàng)傷(通常與白內(nèi)障手術(shù)有關(guān))。大泡性角膜病變是慢性角膜水腫的晚期，在此階段，角膜上皮受到影響，并出現(xiàn)多個(gè)大小不等的水泡，稱為大泡。積聚的水可以在上皮內(nèi)，也可以在上皮下，位于上皮下的可以導(dǎo)致基底細(xì)胞層與Bowman膜(BZ)分離。雖然對(duì)于角膜內(nèi)皮功能失代償引起角膜水腫的治療方法很多，但是角膜移植仍然是大多數(shù)患者的最佳選擇[1]。目前常用的手術(shù)方式有穿透性角膜移植術(shù)(PRK)、角膜后彈力層內(nèi)皮移植術(shù)(DMEK)、飛秒激光制備內(nèi)皮植片的深板層角膜內(nèi)皮移植術(shù)(DLEK)等[2-7]。角膜內(nèi)皮移植手術(shù)目的是恢復(fù)角膜內(nèi)皮的功能，功能正常的角膜內(nèi)皮可以去除角膜基質(zhì)層中多余的水分。有研究表明，角膜內(nèi)皮移植術(shù)的臨床效果優(yōu)于PRK[8-9]。PRK是將角膜基質(zhì)、BZ和角膜上皮及角膜內(nèi)皮全部替換。與PRK相比，角膜內(nèi)皮移植術(shù)后引起的角膜不規(guī)則散光小，患者視力較好[10-11]。另外，Descemet膜去除的角膜內(nèi)皮移植術(shù)(DSAEK)后角膜排斥率低于PRK[12]。角膜內(nèi)皮移植術(shù)是假設(shè)通過恢復(fù)角膜內(nèi)皮功能改善角膜基質(zhì)水腫后角膜會(huì)變得清晰，然而，部分慢性角膜水腫的患者角膜內(nèi)皮移植術(shù)后患者視力恢復(fù)不理想，角膜介質(zhì)不透明被認(rèn)為是導(dǎo)致手術(shù)失敗的原因[13]。我們關(guān)注慢性角膜水腫的臨床過程，特別是基質(zhì)水腫的持續(xù)時(shí)間，試圖確定角膜內(nèi)皮移植術(shù)后可能影響視力的因素。因此，觀察慢性角膜水腫引起的角膜各層變化是很重要的。共焦顯微鏡(IVCM)是一種非侵入性成像工具，用于研究各種角膜疾病中的細(xì)胞變化。在這項(xiàng)研究中，我們利用IVCM觀察水腫角膜的各層，確定和記錄角膜各層的具體變化，這些變化將為進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

圖1慢性角膜水腫患者前節(jié)照相及IVCM圖像A:前節(jié)照相;B、C:上皮層可見大泡;D:上皮細(xì)胞出現(xiàn)高反射的無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的片狀區(qū)域和瘢痕;E:可見上皮下神經(jīng)密度顯著降低;F、G:可見BZ呈分支狀的、細(xì)的、黑線狀;H:可見前基質(zhì)表現(xiàn)為細(xì)顆粒或粗顆粒;I:可見角膜基質(zhì)細(xì)胞密度降低;J:角膜內(nèi)皮正常六邊形結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞邊界不清。

1對(duì)象和方法

1.1對(duì)象選取2017-03/2018-02到我院就診的慢性角膜水腫的患者21例21眼,其中女14例14眼，男7例7眼，年齡48～85(平均68.75±13.15) 歲，根據(jù)病史、裂隙燈和角膜厚度檢查確診為慢性角膜水腫，其中FED患者5眼和內(nèi)眼手術(shù)患者16眼(白內(nèi)障術(shù)后11眼，青光眼聯(lián)合白內(nèi)障術(shù)后5眼)，病程2～12mo。對(duì)照組為擬行白內(nèi)障手術(shù)的角膜正常的患者5例5眼，其中男4例4眼，女1例1眼，年齡56～81歲。

1.2方法所有的患者術(shù)前均進(jìn)行常規(guī)的視力檢查、裂隙燈、角膜厚度及共焦顯微鏡檢查。本研究使用的共焦顯微鏡為HRT3激光IVCM，激光波長670nm，放大倍率為800倍，橫向與縱向分辨率均為1μm，觀察視野400μm×400μm角膜的面積。檢查方法：待檢眼用5g/L鹽酸丙美卡因表面麻醉3次；在顯微鏡頭的前表面滴一大滴卡波姆滴眼液，將一次性無菌角膜接觸帽蓋于物鏡上，使接觸帽內(nèi)表面與物鏡表面通過凝膠相貼附。轉(zhuǎn)動(dòng)角膜顯微物鏡，直到左邊的屏幕中出現(xiàn)明亮的激光反射，設(shè)此時(shí)焦點(diǎn)位置的深度為0μm。通過調(diào)整共焦鏡下頜托和前額托的位置，將受檢者的下頜與前額分別固定在下頜托與前額托上，并使受檢眼外眥與檢查標(biāo)記線對(duì)齊。之后旋轉(zhuǎn)調(diào)鈕前移物鏡，在前進(jìn)至靠近角膜表面時(shí)，調(diào)整物鏡位置，使掃描頭對(duì)準(zhǔn)角膜中心，囑受檢者盡量睜大眼，前移物鏡至角膜接觸帽觸及到受檢者的角膜，通過前后及水平轉(zhuǎn)動(dòng)物鏡探頭位置，以獲得不同深度和不同層次的角膜細(xì)胞和神經(jīng)的圖像，共焦顯微鏡掃描角膜中央3～4mm范圍，然后移動(dòng)到上、下、顳側(cè)和鼻側(cè)象限，同時(shí)踩下按鈕，將圖像進(jìn)行保存。

2結(jié)果

慢性角膜水腫患者表現(xiàn)為視力逐漸下降，晨起時(shí)視物模糊最明顯。其中5例患者表現(xiàn)為有疼痛癥狀的慢性角膜水腫，其余患者無明顯的疼痛癥狀。所有患者術(shù)前最佳矯正視力為0.5～指數(shù)/眼前，角膜厚度為559～763(平均655±57)μm。裂隙燈顯微鏡觀察僅4例患者有角膜瘢痕，其余患者未見明顯角膜瘢痕。

IVCM表現(xiàn)：(1)所有患者上皮層均可見大泡，上皮大泡表現(xiàn)為黑色、圓形、邊緣清晰，位于上皮層間及上皮下。13眼(62%)中可見基底細(xì)胞層完整，偶可見上皮層與BZ分離。(2)18眼(86%)患者上皮細(xì)胞出現(xiàn)高反射的無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的片狀區(qū)域和瘢痕。(3)12眼(57%)患者中央?yún)^(qū)角膜上皮下未發(fā)現(xiàn)神經(jīng)纖維，9眼(43%)患者平均中央角膜上皮下神經(jīng)密度顯著降低。當(dāng)水腫呈扇形時(shí)，非水腫部位可見上皮下神經(jīng)，而水腫部位未見上皮下神經(jīng)。(4)IVCM上所有患者BZ表現(xiàn)為明顯的異常，除了上述相關(guān)的瘢痕外，BZ呈分支狀的、細(xì)的、黑線狀。此外，在21眼中有13眼(62%)患者前基質(zhì)表現(xiàn)為細(xì)顆?；虼诸w粒，且反光不同。(5)在IVCM上，全部患者角膜基質(zhì)細(xì)胞密度降低。(6)全部患者角膜內(nèi)皮正常的形態(tài)不能在IVCM上看到,表現(xiàn)為正常六邊形結(jié)構(gòu)消失，細(xì)胞邊界不清。對(duì)照組IVCM表現(xiàn)為形態(tài)正常的角膜上皮細(xì)胞、上皮下神經(jīng)纖維、BZ、基質(zhì)細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞，見圖1,2。

3討論

IVCM的應(yīng)用可以對(duì)活體角膜進(jìn)行無損傷的光學(xué)斷層掃描成像，不需要切片、固定、染色等過程就能觀察到角膜內(nèi)各層細(xì)胞的形態(tài)結(jié)構(gòu)和動(dòng)態(tài)變化，得到類似于病理切片的圖像。近年國內(nèi)有一些關(guān)于應(yīng)用IVCM觀察水腫角膜的文獻(xiàn)報(bào)道[14-15]。本研究是應(yīng)用IVCM觀察持續(xù)的角膜水腫對(duì)角膜各層的病理學(xué)影響。

圖2對(duì)照組IVCM圖像A:角膜上皮細(xì)胞;B:上皮下神經(jīng)纖維;C:基質(zhì)細(xì)胞;D:內(nèi)皮細(xì)胞。

3.1角膜上皮的改變我們通過IVCM觀察到慢性角膜水腫的患者上皮可見大泡，表現(xiàn)為黑色、圓形、邊緣清晰，大多數(shù)是上皮內(nèi)的，位于上皮層間。這在以往的文獻(xiàn)中有過報(bào)道，Alomar等[16]應(yīng)用IVCM在FED晚期可以觀察到角膜上皮的改變，大泡可以被觀察到，類似大的黑環(huán)，這些發(fā)現(xiàn)與本研究結(jié)果一致。另外，Alomar等[16]應(yīng)用IVCM發(fā)現(xiàn)在慢性角膜水腫患者的基底細(xì)胞層和BZ之間發(fā)現(xiàn)了角化細(xì)胞源性細(xì)胞(KDCs)，確切的說是位于BZ內(nèi)或上皮內(nèi)延伸的纖維組織間隔內(nèi)，并組織學(xué)上也證實(shí)了共焦顯微鏡的觀察，并猜測這些細(xì)胞極有可能是上皮下成纖維細(xì)胞。另外，本研究發(fā)現(xiàn)角膜上皮細(xì)胞出現(xiàn)高反射的無細(xì)胞結(jié)構(gòu)的片狀區(qū)域，這在以往的文獻(xiàn)中也曾有報(bào)道。在晚期Fuchs角膜內(nèi)皮細(xì)胞營養(yǎng)不良患者中通常被發(fā)現(xiàn)上皮下高反光[16]，光學(xué)顯微鏡觀察角膜移植后切除的角膜組織證實(shí)在上皮細(xì)胞層和BZ之間有纖維結(jié)締組織的存在[17]，提示上皮下高反光為纖維結(jié)締組織，瘢痕形成。慢性角膜水腫與上皮下瘢痕形成有關(guān)[18]。Morishige等[13]報(bào)道雖然大泡性角膜病變的致病因素不會(huì)直接損傷角膜上皮，但是患者常表現(xiàn)為角膜上皮糜爛，這種上皮損傷可能是大泡性角膜病變角膜前部病變發(fā)展的關(guān)鍵因素，因?yàn)樗鼘?dǎo)致BZ和前基質(zhì)暴露在包括淚液在內(nèi)的外部環(huán)境中。淚液中含有多種細(xì)胞因子和生長因子(包括β-轉(zhuǎn)化生長因子)[19]，它們促進(jìn)大泡性角膜病變前部角膜的結(jié)構(gòu)改變。Morishige等[13]發(fā)現(xiàn)有上皮糜爛病史的大泡性角膜病變患者前基質(zhì)細(xì)胞成纖維化早于無此病史者。然而，上皮糜爛引起的角膜前部結(jié)構(gòu)的改變是可以被預(yù)測的，因此，慢性角膜水腫角膜上皮的及時(shí)治療對(duì)角膜內(nèi)皮移植術(shù)后的視力恢復(fù)是很重要[13]。

3.2角膜上皮下神經(jīng)叢的改變本研究發(fā)現(xiàn)慢性角膜水腫的角膜上皮下神經(jīng)纖維密度明顯減少或消失。之前的文獻(xiàn)有報(bào)道，輕度Fuchs患者角膜上皮下神經(jīng)纖維密度比對(duì)照組相比顯著降低[20]；一般來說，角膜厚度增加越多，上皮下神經(jīng)密度降低越大，神經(jīng)總長度就越短[20]。晚期Fuchs角膜內(nèi)皮細(xì)胞營養(yǎng)不良患者上皮下神經(jīng)可能完全缺失(占病例的0～40%)[16，21]。這些研究與本研究結(jié)果相一致。另外，有研究發(fā)現(xiàn)，慢性角膜水腫的患者，中央角膜敏感度明顯低于年齡相仿的對(duì)照組，角膜神經(jīng)表現(xiàn)為有異常分支的細(xì)小且稀疏的神經(jīng)片段[21]。據(jù)推測，內(nèi)皮細(xì)胞丟失可導(dǎo)致血管活性腸肽(VIP)或者其他神經(jīng)肽水平下降，從而影響角膜神經(jīng)密度或功能[20]。反之，角膜神經(jīng)的缺失可導(dǎo)致包括VIP在內(nèi)的神經(jīng)肽水平降低，進(jìn)而又導(dǎo)致內(nèi)皮細(xì)胞凋亡[20]。

3.3角膜基質(zhì)的改變本研究發(fā)現(xiàn)前基質(zhì)細(xì)胞密度明顯減少。Hecker等[22]通過IVCM及組織學(xué)觀察發(fā)現(xiàn)，與正常對(duì)照組相比，需要行穿透性角膜移植的晚期FECD患者前基質(zhì)細(xì)胞密度顯著降低，然而后基質(zhì)細(xì)胞密度無顯著差異。引起前部基質(zhì)細(xì)胞減少的確切機(jī)制尚不清楚，但是基質(zhì)細(xì)胞的凋亡有可能是上皮細(xì)胞因子釋放引起的。上皮細(xì)胞因子的釋放是一種已知的上皮對(duì)機(jī)械或病毒損傷后的反應(yīng)[23]。同樣，慢性角膜水腫中，上皮細(xì)胞破壞或大泡形成可導(dǎo)致上皮細(xì)胞因子的釋放，導(dǎo)致基質(zhì)細(xì)胞凋亡[22]。有證據(jù)表明，F(xiàn)ED患者角膜各層細(xì)胞均凋亡[24-25]。Li等[24]認(rèn)為基質(zhì)細(xì)胞對(duì)凋亡刺激高度敏感，基質(zhì)細(xì)胞的變化可能先于內(nèi)皮細(xì)胞和上皮細(xì)胞的變化。Szentmary等[25]在水腫角膜各層均發(fā)現(xiàn)凋亡細(xì)胞，提示基質(zhì)細(xì)胞凋亡可能是基質(zhì)細(xì)胞對(duì)任何原因引起基質(zhì)水腫的反應(yīng)。

3.4角膜內(nèi)皮的改變本研究正常的角膜內(nèi)皮細(xì)胞形態(tài)不能在IVCM上看到。這與之前的文獻(xiàn)報(bào)道一致。Alomar等[16]發(fā)現(xiàn)在光學(xué)顯微鏡下，所有FED角膜樣本中，Descemet膜(DM)均出現(xiàn)增厚和層疊，并伴有贅疣，內(nèi)皮細(xì)胞減少；在IVCM下，所有FED患者角膜內(nèi)皮細(xì)胞邊界完全模糊；在非FED患者，觀察到內(nèi)皮細(xì)胞的改變，包括特征性增生和明顯的高反射核，以及細(xì)胞密度降低。

Morishige等[13]研究發(fā)現(xiàn)大泡性角膜病變角膜水腫持續(xù)12mo以上患者角膜膠原結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，以及角膜基質(zhì)細(xì)胞向成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化，角膜發(fā)生不可逆的改變；另外，這些變化可能影響DSAEK術(shù)后患者的視力。同時(shí)，他們觀察了術(shù)前基質(zhì)水腫持續(xù)的時(shí)間與術(shù)后視力的關(guān)系，他們發(fā)現(xiàn)術(shù)前基質(zhì)水腫小于12mo的患者術(shù)后視力較好，他們提出大泡性角膜病變是一種進(jìn)行性疾病。

總之，大泡性角膜病變是一種臨床及病理上均進(jìn)展的疾病。這一概念對(duì)于DSAEK術(shù)前慢性角膜水腫患者的治療具有重要意義，值得進(jìn)一步研究。另外，不同病因引起的慢性角膜水腫的IVCM表現(xiàn)有何不同，目前尚無相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道，需要進(jìn)一步研究。