劉琳琳，吳 晶，王 輝，劉錦榮，吳維霖，唐愛東，蔣貽平，胡成全

0引言

翼狀胬肉是結(jié)膜纖維血管組織異常增生侵犯角膜的一種眼表疾病，其發(fā)病人群主要集中于常年在戶外工作者[1]?，F(xiàn)有研究表明，胬肉的發(fā)病機(jī)制涉及基因表達(dá)、凋亡機(jī)制及細(xì)胞分子生物學(xué)等[2]。角膜緣干細(xì)胞的高增殖對結(jié)膜上皮具有抑制作用，若角膜緣干細(xì)胞發(fā)生損害，則人翼狀胬肉成纖維細(xì)胞(human pterygium fibroblasts，HPF)增殖與凋亡平衡機(jī)制將會(huì)被打破而導(dǎo)致異常增生[3-4]。調(diào)查顯示，正常情況下，翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)率為19.4%～75%，術(shù)后給予絲裂霉素C(mitomycin C，MMC)治療后，復(fù)發(fā)率降為10.3%[5]。MMC可通過抑制DNA的合成以抑制HPF的增殖[6]，從而抑制翼狀胬肉的復(fù)發(fā)，但使用MMC的患者容易引起角膜溶解、鞏膜溶解及干眼等并發(fā)癥[7]。

圖1倒置相差顯微鏡下觀察翼狀胬肉HPF細(xì)胞A：原代細(xì)胞(×40)；B：第一代細(xì)胞(×200)；C：第二代細(xì)胞(×100)；D：第三代細(xì)胞(×100)。

有研究表明，橙皮苷可通過阻斷細(xì)胞周期從而抑制癌細(xì)胞的增殖[8]，周期蛋白D(cyclin D)主要在細(xì)胞G1期早期產(chǎn)生，到G1期晚期時(shí)達(dá)到高峰，在與CDK4/CDK6結(jié)合后進(jìn)入細(xì)胞核，形成cyclin D-CDK4/CDK6復(fù)合體使Rb蛋白、P107蛋白及P130蛋白磷酸化，解除對E2F等轉(zhuǎn)錄因子的抑制作用，啟動(dòng)細(xì)胞基因轉(zhuǎn)錄，從而啟動(dòng)細(xì)胞周期[9]。本研究就橙皮苷對翼狀胬肉HPF細(xì)胞的增殖抑制作用及cyclin D蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行探討。

1材料和方法

1.1材料

1.1.1標(biāo)本取材選取原發(fā)性翼狀胬肉患者30例30眼，其中男15例，女15例，年齡30～60歲。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)符合原發(fā)性翼狀胬肉的診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)胬肉頭端侵入角膜上皮約2.5～3.5mm。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)復(fù)發(fā)及假性翼狀胬肉；(2)翼狀胬肉伴其他結(jié)膜疾病；(3)既往有眼部手術(shù)；(4)有活動(dòng)性眼部炎癥性病變。本研究通過倫理委員會(huì)審查。所有患者均于手術(shù)室無菌條件下取胬肉組織進(jìn)行原代及傳代培養(yǎng)，術(shù)前均與患者簽訂手術(shù)知情同意書。

1.1.2主要試劑和設(shè)備1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、胰蛋白酶(美國Gibco公司)，抗青-鏈霉素(北京索萊寶科技有限公司)，免疫熒光試劑盒、Annexin V-FITC細(xì)胞凋亡檢測試劑盒、cyclin D蛋白抗體、β-actin蛋白抗體、鼠源波形蛋白抗體(vimentin mouse monoclonal antibody)試劑盒(上海碧云天生物技術(shù)有限公司)，MTT檢測試劑盒、DMSO、酶標(biāo)儀、橙皮苷(成都德瑞克公司)，細(xì)胞周期檢測試劑盒(美國BD Pharmingen公司)，MMC針劑(北京百奧萊博科技有限公司)；共聚焦顯微鏡(美國蔡司 880)，倒置熒光顯微鏡(日本OLYMPUS IX71)，電泳儀、凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)(英國Biorad公司)。

1.2方法

1.2.1原代細(xì)胞培養(yǎng)無菌條件下取原發(fā)性翼狀胬肉組織置于冰上，PBS緩沖液沖洗2～3次，將組織中血細(xì)胞盡量沖洗盡，再將胬肉組織剪碎成大小約0.5mm×0.5mm×0.5mm。接種于斜口培養(yǎng)瓶中，組織塊之間間隔0.5cm，加入含12%胎牛血清的1640培養(yǎng)基至剛好沒過組織塊，2～3d后可見長梭形細(xì)胞從組織塊邊緣爬出，約1wk后可長滿培養(yǎng)瓶，胰酶消化后接種于培養(yǎng)瓶中，每2d換1次液，以后每4～6d可傳代一次，取第三代細(xì)胞進(jìn)行實(shí)驗(yàn)(圖1)。

1.2.2細(xì)胞鑒別將直徑為1.5cm無菌圓形玻片置于6孔板底部，取對數(shù)期細(xì)胞接種于6孔板中，每孔2mL，接種密度為1×104個(gè)/mL。待細(xì)胞長滿圓形玻片后用PBS緩沖液輕柔沖洗玻片，將細(xì)胞爬片放入-20℃冰甲醇固定5min，PBST(0.1% Tween20/PBS)清洗2次，加入500μL blocking buffer(2% BSA、0.1% Tween20/PBS)室溫?fù)u勻靜置30min，再用鼠源波形蛋白抗體試劑盒及免疫熒光試劑盒-抗小鼠FITC對細(xì)胞進(jìn)行染色，在共聚焦顯微鏡下以492nm波長進(jìn)行激發(fā)，用4，6-聯(lián)脒-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)對細(xì)胞核進(jìn)行染色，以358nm波長進(jìn)行激發(fā)。著染細(xì)胞為扁平紡錘形或星形，核呈規(guī)則的卵圓形，則符合HPF的形態(tài)學(xué)特征。

1.2.3 MTT法檢測細(xì)胞增殖抑制率取對數(shù)期生長細(xì)胞接種于96孔板中，接種密度為3×104個(gè)/mL，每孔加入細(xì)胞懸液100μL，每板均設(shè)空白對照組、無處理細(xì)胞對照組、不同濃度MMC組(1.5、7.5、30.0μmol/L)、不同濃度橙皮苷組(24、48、64、72、96、120μmol/L)；每個(gè)組設(shè)5個(gè)復(fù)孔。待細(xì)胞貼壁后更換含12%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)12h，分別加入各組濃度藥物培養(yǎng)于24、48、72h，每孔加入20μL MTT溶液再培養(yǎng)4h后將混合液吸盡，每孔再加入150μL DMSO，避光低速震蕩10min后酶標(biāo)儀570nm波長檢測光密度(OD)值。計(jì)算細(xì)胞增殖抑制率，篩選橙皮苷和MMC作用濃度和時(shí)間。細(xì)胞增殖抑制率=[1-(加藥組OD值-空白對照組OD值)/(無處理細(xì)胞對照組OD值-空白對照組OD值)]×100%。

1.2.4 Western blot法檢測cyclin D的表達(dá)將對數(shù)期生長細(xì)胞接種于60cm培養(yǎng)皿中，接種密度為5×104個(gè)/mL，每皿加入4mL細(xì)胞懸液，設(shè)空白對照組(正常培養(yǎng))、MMC組(7.5μmol/L)、橙皮苷組(48、72μmol/L)，待細(xì)胞貼壁后更換含12%胎牛血清的1640培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，加入各組濃度藥物培養(yǎng)48h后吸盡培養(yǎng)液，3mL預(yù)冷PBS緩沖液清洗2次，加入細(xì)胞裂解液(RIPA)200μL和苯甲基磺酰氟(PMSF)2μL，搖勻置于冰上30min，細(xì)胞刮收裂解液，4℃下1 200r/min離心5min，取上清分裝至0.5mL離心管中。BSA法測蛋白濃度，每孔上樣202μg蛋白總量，80V電泳2h，200mA轉(zhuǎn)膜70min，脫脂奶粉封閉抗體1h，4℃孵育一抗(稀釋比例1∶200)過夜，常溫孵育二抗(稀釋比例1∶1000)1h，加入顯影劑放入凝膠數(shù)字成像系統(tǒng)曝光成像。

圖2免疫熒光染色法鑒定翼狀胬肉HPF細(xì)胞(×630)A：翼狀胬肉HPF細(xì)胞呈波形蛋白陽性表達(dá)；B：細(xì)胞核DAPI染色呈陽性表達(dá)；C：細(xì)胞骨架和核染共同顯色。

濃度(μmol/L)作用時(shí)間(h)244872249.91±1.3131.78±4.3414.51±3.434817.80±1.8745.58±2.4920.81±3.096433.62±13.3151.82±0.7127.24±1.357235.03±4.7369.44±2.7451.70±1.099639.98±1.5578.31±0.6764.00±4.9912044.87±1.1481.83±0.5767.09±0.62

注：F濃度=220.192，P濃度=0.002；F時(shí)間=94.648，P時(shí)間=0.005；F濃度×?xí)r間=9.835，P濃度×?xí)r間=0.062。

濃度(μmol/L)作用時(shí)間(h)2448721.512.85±1.7139.55±1.3354.71±3.597.526.35±2.7272.57±3.2384.45±1.3530.048.70±1.8384.82±0.8690.04±0.90

注：F濃度=317.660，P濃度<0.001；F時(shí)間=1173.218，P時(shí)間<0.001；F濃度×?xí)r間=192.491，P濃度×?xí)r間=0.001。

2結(jié)果

2.1細(xì)胞鑒別波形蛋白為細(xì)胞的骨架蛋白，免疫熒光染色結(jié)果顯示，鼠源波形蛋白抗體對人翼狀胬肉HPF細(xì)胞波形蛋白染色呈陽性，共聚焦顯微鏡下呈綠色，細(xì)胞呈紡錘形、長梭形或星形扁平狀結(jié)構(gòu)；DAPI可穿透細(xì)胞膜與細(xì)胞核中DNA雙鏈結(jié)合，共聚焦顯微鏡下呈藍(lán)色卵圓形，符合HPF細(xì)胞形態(tài)結(jié)構(gòu)(圖2)。

2.2橙皮苷對翼狀胬肉HPF細(xì)胞增殖的抑制MTT檢測結(jié)果顯示，橙皮苷對翼狀胬肉HPF細(xì)胞的增殖抑制率隨橙皮苷作用濃度的增加而升高，隨橙皮苷作用時(shí)間的延長先升高后降低，但橙皮苷作用濃度與時(shí)間之間無交互效應(yīng)(表1)。MMC對翼狀胬肉HPF細(xì)胞的增殖抑制率隨MMC濃度增加而升高，隨MMC作用時(shí)間的延長逐漸增加，且MMC作用濃度與時(shí)間之間存在交互效應(yīng)(表2)。通過橙皮苷和MMC對細(xì)胞增殖抑制率的檢測結(jié)果進(jìn)行初篩，后續(xù)實(shí)驗(yàn)根據(jù)藥物的半抑制率(IC50)選擇藥物干預(yù)劑量，橙皮苷濃度為48、72μmol/L，MMC濃度為7.5μmol/L，作用時(shí)間選擇48h。

圖3Western blot法檢測橙皮苷對cyclin D表達(dá)的影響。

2.3橙皮苷對翼狀胬肉HPF細(xì)胞cyclin D表達(dá)的影響Western blot檢測結(jié)果顯示(圖3)，空白對照組、MMC組(7.5μmol/L)、橙皮苷組(48、72μmol/L)細(xì)胞cyclin D蛋白相對表達(dá)量分別為1.20±0.02、0.60±0.03、0.54±0.02、0.45±0.07，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=73.025，P=0.001)，MMC組和橙皮苷組(48、72μmol/L)細(xì)胞cyclin D蛋白相對表達(dá)量均低于空白對照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，MMC組和橙皮苷組(48、72μmol/L)細(xì)胞cyclin D蛋白相對表達(dá)量差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

3討論

翼狀胬肉是一種眼表疾病，發(fā)病率高，主要癥狀為球結(jié)膜組織增生，侵及角膜，朝其中央生長，頭部多為三角狀，?，F(xiàn)于鼻側(cè)，偶有位于顳側(cè)。不但給患者帶來容貌的困擾，若增生的球結(jié)膜將瞳孔覆蓋，則明顯影響視力，嚴(yán)重者可致盲[10]。翼狀胬肉的主要發(fā)病機(jī)制尚無定論，但近年研究表明，紫外線等多種致病因素在翼狀胬肉的形成過程中發(fā)揮著重要作用。有研究發(fā)現(xiàn)，翼狀胬肉的發(fā)病機(jī)制類似于腫瘤，其表皮細(xì)胞活性十分高，增殖速度快[11]。陳祎祎等[12]觀察翼狀胬肉復(fù)發(fā)與病理組織變化的關(guān)系發(fā)現(xiàn)，復(fù)發(fā)的胬肉病理組織變化多以細(xì)胞增生為主。目前，翼狀胬肉治療仍然主張以手術(shù)為主，藥物及其他治療為輔的聯(lián)合療法。傳統(tǒng)手術(shù)切除的復(fù)發(fā)率相當(dāng)高，國外報(bào)道的復(fù)發(fā)率為24%～89%[13]，國內(nèi)報(bào)道的為20%～70%[14]。為了抑制翼狀胬肉復(fù)發(fā)，很多學(xué)者進(jìn)行了相關(guān)研究。在手術(shù)治療方面，有學(xué)者提出羊膜移植、自體角膜緣聯(lián)合干細(xì)胞結(jié)膜移植等改良方法[15]；在藥物治療方面，聯(lián)合激素或抗代謝藥物(如MMC)進(jìn)行輔助藥物治療，雖然有效降低了翼狀胬肉的術(shù)后復(fù)發(fā)率，但是改良手術(shù)對正常的眼表組織有一定的損傷，抗代謝藥物對眼表的毒性作用較強(qiáng)，容易引起角結(jié)膜上皮修復(fù)不良及角膜鞏膜溶解等嚴(yán)重并發(fā)癥，并不能完全抑制胬肉的復(fù)發(fā)。臨床上較常用的抗代謝藥物MMC可有效抑制細(xì)胞DNA的增殖及復(fù)制等，同時(shí)具有殺傷作用[16]。因此，在翼狀胬肉手術(shù)過程中使用MMC可通過其藥理特征清理殘留的胬肉組織，顯著降低翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)率。但其對眼表的毒性作用較強(qiáng)，且持續(xù)時(shí)間較長，需要引起重視。此外，史偉云等[10]認(rèn)為翼狀胬肉術(shù)后并發(fā)癥與MMC誘發(fā)局部細(xì)胞凋亡及鞏膜和角鞏膜緣缺血有密切的關(guān)系。因此，尋找一種既能抑制翼狀胬肉增生復(fù)發(fā)，又對眼表組織無毒副作用的藥物至關(guān)重要。

橙皮苷(hesperidin)是橙皮素與蕓香糖形成的糖苷，為二氫黃酮衍生物。橙皮苷是柑橘果肉和果皮的重要成分，其含量可達(dá)柑桔幼果鮮重的1.4%[17]。贛南臍橙產(chǎn)量富足，因此可作為獲取橙皮苷的主要原料。因橙皮苷在植物中分布較為廣泛，其藥理活性的研究一直得到人們的廣泛關(guān)注，且在中藥新藥的創(chuàng)制和研發(fā)中，橙皮苷常常被選為指標(biāo)成分而用于定性和定量研究。橙皮苷提取物天然無毒，具有抗氧化、抗炎、抑制前列腺素合成、抗癌變、對藥物代謝酶進(jìn)行調(diào)節(jié)、抗腫瘤等多種生物活性[18-19]。目前，橙皮苷抗腫瘤活性已受到廣泛關(guān)注，其能抑制多種癌細(xì)胞的增殖分化。羅曉婷等[20]研究贛南臍橙果皮提取物橙皮苷對人低分化鼻咽癌上皮細(xì)胞株細(xì)胞增殖與細(xì)胞周期的影響發(fā)現(xiàn)，橙皮苷能抑制細(xì)胞的分裂增殖，誘導(dǎo)細(xì)胞周期特異性的細(xì)胞凋亡。已有研究表明，橙皮苷通過阻滯TGF-β/Smad信號(hào)通路抑制細(xì)胞增殖[21]，而橙皮苷對正常的機(jī)體組織無明顯毒副作用。

目前，關(guān)于橙皮苷在眼科的應(yīng)用較少有研究報(bào)道。本研究通過觀察橙皮苷對體外培養(yǎng)的人翼狀胬肉HPF細(xì)胞增殖及cyclin D表達(dá)的影響，以期尋找輔助治療及預(yù)防翼狀胬肉復(fù)發(fā)的中醫(yī)中藥方法。本研究發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間和濃度的增加，橙皮苷對翼狀胬肉HPF細(xì)胞增殖的抑制逐漸增加，橙皮苷作用48h，濃度為48～72μmol/L時(shí)抑制效果增加最明顯，抑制率已快速達(dá)到50%及以上，說明橙皮苷對翼狀胬肉HPF的增殖具有抑制作用，隨著濃度的不斷增加，抑制率的增加幅度逐漸減慢，隨著時(shí)間的遷延抑制率逐漸降低。此外，我們發(fā)現(xiàn)，橙皮苷可降低人翼狀胬肉HPF細(xì)胞中cyclin D的表達(dá)，48、72μmol/L濃度橙皮苷對cyclin D表達(dá)均有明顯的抑制作用，其效果與7.5μmol/L MMC相當(dāng)。表明橙皮苷與MMC促凋亡作用機(jī)制具有相似性。由于橙皮苷具有天然無毒的優(yōu)勢，其應(yīng)用于臨床控制翼狀胬肉的生長及抑制翼狀胬肉術(shù)后復(fù)發(fā)具有更大的優(yōu)勢。

綜上所述，本研究證實(shí)橙皮苷對人翼狀胬肉HPF細(xì)胞具有較強(qiáng)的抗增殖作用，提示橙皮苷具有成為新型抗增殖藥物的可能，但尚需進(jìn)一步研究其對cyclin D的調(diào)控機(jī)制。鑒于藥物作用在體外有一定的差異，我們將進(jìn)一步觀察橙皮苷對活體的療效及毒理學(xué)研究，為尋找新的預(yù)防翼狀胬肉復(fù)發(fā)的方法提供科學(xué)依據(jù)。