楊式華， 劉祥義， 徐濟(jì)倉(cāng)， 楊 蕾， 鄧國(guó)賓， 侯 英*， 楊慶嬌

(1.云南佩林科技有限公司，云南 昆明 650201； 2.西南林業(yè)大學(xué)， 云南 昆明 650224； 3.云南中煙技術(shù)中心， 云南 昆明 650231； 4.云南空港物流有限公司， 云南 昆明 650100)

天麻(GastrodiaelataBl.)是我國(guó)傳統(tǒng)名貴中藥材，為蘭科天麻屬多年生草本植物，藥用部位為天麻的干燥塊莖，對(duì)于失眠、高血壓、偏頭痛、神經(jīng)病變及心腦血管疾病等有較好的治療效果[1-3]，常用于治病、滋補(bǔ)及保健有機(jī)結(jié)合的藥膳，極具營(yíng)養(yǎng)價(jià)值。天麻中含有多種活性成分，有機(jī)酸即是其中一類[4]。研究表明，中藥有機(jī)酸類成分多為非揮發(fā)性有機(jī)酸(Nonvolatile Organic Acids , NVOAs)，具有抗氧化、保肝、免疫調(diào)節(jié)、抑菌、抗病毒等藥理作用[5]。特別是天麻NVOAs中的檸檬酸，其與巴利森苷(Parishins)及其衍生物有關(guān)。巴利森苷是天麻的主要有效成分，是天麻素與一分子檸檬酸縮合而成的酯類結(jié)構(gòu)[6]，因而，準(zhǔn)確測(cè)定天麻中有機(jī)酸含量，對(duì)評(píng)價(jià)天麻的藥用價(jià)值與食用價(jià)值，特別是測(cè)定天麻中檸檬酸含量對(duì)研究巴利森苷及其衍生物在不同條件下的降解規(guī)律具有重要意義。目前，天麻品質(zhì)的評(píng)價(jià)主要集中于天麻素的含量和活性研究[7-8]，天麻中有機(jī)酸的研究多為定性分析[9]，僅見(jiàn)檸檬酸的定量分析[4]，未見(jiàn)天麻中多種非揮發(fā)性有機(jī)酸的快速定量測(cè)定方法。因此，采用樣品衍生化、GC-MS技術(shù)，建立快速定量測(cè)定天麻中6種非揮發(fā)性有機(jī)酸(草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸)含量的方法，以期為天麻品質(zhì)的鑒定、藥用價(jià)值及食用價(jià)值的評(píng)價(jià)提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品 10份天麻樣品為2017年采集，其中1～8號(hào)樣采自云南昭通，9號(hào)樣采自湖北宜昌，10號(hào)樣采自陜西漢中，并經(jīng)西南林業(yè)大學(xué)劉祥義教授鑒定。樣品采集后用自來(lái)水洗凈塊莖部位，再用蒸餾水沖洗3次，隔水蒸透心，60℃烘箱干燥。粉碎后過(guò)60目篩，編號(hào)存放于自封袋中備用。

1.1.2 儀器及設(shè)備 Agilent 6890-5973N氣質(zhì)聯(lián)用儀(美國(guó)Agilent公司)，JP-040S型超聲波萃取儀(深圳市潔盟清洗設(shè)備有限公司)，MS204E型電子天平(感量0.000 1 g，瑞士METTLER TOLEDO 公司)，Ф13 mm×0.2 μm微濾膜過(guò)濾器(天津騰達(dá)過(guò)濾器件廠)，Milli-Q 純水儀(美國(guó)Millipore公司)。

1.1.3 試劑 甲醇、正己烷(德國(guó)Merck公司)，濃硫酸、對(duì)甲基苯磺酸(PTSA)均為色譜純(國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司)。對(duì)照品：草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸均為分析純，純度均大于98%(Fluka公司)。內(nèi)標(biāo)：己二酸(純度大于98.5%，F(xiàn)luka公司)；內(nèi)標(biāo)溶液：用己二酸配制相應(yīng)的內(nèi)標(biāo)甲醇溶液。衍生化試劑(H2SO4/ PTSA /CH3OH)：配制含10%濃硫酸和5%對(duì)甲苯磺酸的甲醇溶液。

1.2 方法

1.2.1 非揮發(fā)性有機(jī)酸的提取及測(cè)定條件的優(yōu)化

1) PTSA濃度。選擇10%硫酸+PTSA的甲醇溶液體系作為有機(jī)酸的衍生化(酯化)試劑。稱樣品1.00 g，加內(nèi)標(biāo)溶液1.0 mL、衍生化試劑8.0 mL，分別用PTSA濃度為1%、2%、5%、10%、15%的甲醇(含10%硫酸)酯化試劑對(duì)同一樣品在50℃下酯化45 min，考察不同PTSA濃度下的非揮發(fā)性有機(jī)酸含量。

2) 酯化溫度。稱樣品1.00 g，加內(nèi)標(biāo)1.0 mL、衍生化試劑8.0 mL，酯化時(shí)間45 min，考察酯化溫度分別為40℃、45℃、50℃、55℃和60℃的非揮發(fā)性有機(jī)酸含量。

3) 酯化時(shí)間。稱樣品1.00 g，加內(nèi)標(biāo)1.0 mL、衍生化試劑8.0 mL，酯化溫度50℃，分別考察酯化時(shí)間為15 min、30 min、45 min、60 min、75 min的非揮性有機(jī)酸含量。

4) 萃取方式和時(shí)間。采用超聲萃取和振蕩萃取樣品中的有機(jī)酸酯，比較不同萃取方式對(duì)樣品中非揮發(fā)性有機(jī)酸的提取效果。在最佳提取方式下，考察萃取時(shí)間分別為5 min、10 min、15 min、20 min和25 min的非揮發(fā)性有機(jī)酸含量。

1.2.2 GC-MS儀器分析條件 載氣，He；載氣流速1.2 mL/min；色譜柱：HP-5MS(30 m× 0.25 mm× 0.25 μm)，進(jìn)樣量1.0 μL，分流比20∶1，恒流模式；接口溫度275℃，離子源溫度230℃ ，電離能70 eV，質(zhì)量掃描范圍：30～400 amu，進(jìn)樣口溫度270℃。程序升溫：60℃下保持1 min，以6℃/min的速率升至270℃，保持8 min。

1.2.3 標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 分別稱取草酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸100 mg，蘋果酸、檸檬酸1 000 mg于50 mL容量瓶，用甲醇定容至刻度，母液濃度：草酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸濃度為2 mg/mL，蘋果酸、檸檬酸濃度為20 mg/mL。

依次移取上述母液0.5 mL、1 mL、1.5 mL、2 mL、2.5 mL于10 mL容量瓶中，用甲醇定容至刻度，即為系列濃度標(biāo)準(zhǔn)工作溶液。分別取上述標(biāo)準(zhǔn)工作溶液1 mL，加1.0 mL內(nèi)標(biāo)溶液、8.0 mL衍生化試劑，于優(yōu)化的條件下酯化，冷至室溫，加20 mL正己烷，稱重；在優(yōu)化的提取條件下提取NVOAs，用GC-MS儀器測(cè)定，以濃度為橫坐標(biāo)，響應(yīng)值為縱坐標(biāo)，建立標(biāo)準(zhǔn)曲線。

1.2.4 重現(xiàn)性及回收率的測(cè)定 昭通天麻是目前國(guó)內(nèi)品質(zhì)最好的天麻之一，選擇2號(hào)昭通天麻樣品考察方法的重現(xiàn)性和回收率。分別稱取2號(hào)樣品6份，采用優(yōu)化的前處理?xiàng)l件對(duì)樣品進(jìn)行處理后，用GC-MS儀器測(cè)定，計(jì)算方法的重現(xiàn)性。另稱取7份同一樣品，其中6份加入不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)品溶液1.0 mL(蘋果酸和檸檬酸濃度低、中、高依次為1.0 mg/mL、2.0 mg/mL、4.0 mg/mL，其余有機(jī)酸濃度依次為0.1 mg/mL、0.2 mg/mL、0.4 mg/mL)，采用優(yōu)化的前處理?xiàng)l件對(duì)樣品進(jìn)行處理后，用GC-MS儀器測(cè)定，計(jì)算方法的回收率。

1.2.5 樣品的測(cè)定 稱取1.00 g樣品于具塞錐形瓶中，加1.0 mL內(nèi)標(biāo)溶液、8.0 mL衍生化試劑，于優(yōu)化的酯化溫度下酯化，冷至室溫，加20 mL正己烷，稱重；在優(yōu)化的提取條件下提取非揮發(fā)性有機(jī)酸，靜置分層后，加正己烷補(bǔ)足重量；吸取上層正己烷清液2 mL，用濾膜過(guò)濾器過(guò)濾，棄去前0.5 mL后，濾入進(jìn)樣瓶中，進(jìn)GC-MS儀器進(jìn)行分離和鑒定；采用質(zhì)譜定性、內(nèi)標(biāo)法定量測(cè)定及校正曲線的制作。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同因素對(duì)非揮發(fā)性有機(jī)酸酯化及提取效果的影響

2.1.1 PTSA濃度 從圖1可知，有機(jī)酸測(cè)定值隨PTSA濃度增加而升高，當(dāng)PTSA濃度達(dá)5%，草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸及油酸均酯化反應(yīng)完全，增加PTSA濃度非揮發(fā)性有機(jī)酸含量沒(méi)有明顯變化，故選擇濃度為硫酸10%和PTSA5%的甲醇溶液作為酯化試劑。

圖1 不同酯化及萃取條件下的非揮發(fā)性有機(jī)酸含量

2.1.2 酯化溫度 溫度是影響有機(jī)酸酯化的關(guān)鍵因素，溫度過(guò)低酯化反應(yīng)較慢且不完全。隨著酯化溫度的升高，非揮發(fā)性有機(jī)酸含量明顯增加，當(dāng)酯化溫度為50℃時(shí)，草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸及油酸均酯化完全，繼續(xù)升高溫度，非揮發(fā)性有機(jī)酸含量未見(jiàn)增加，故選擇酯化溫度為50℃(圖1)。

2.1.3 酯化時(shí)間 反應(yīng)時(shí)間對(duì)酯化完成度有明顯影響，隨著酯化時(shí)間增加，非揮發(fā)性有機(jī)酸含量明顯增加，在45 min時(shí)有機(jī)酸即完全酯化(圖1)，增加酯化時(shí)間，草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸及油酸含量未見(jiàn)明顯增加，酯化60 min非揮發(fā)性有機(jī)酸含量反而略有下降，故選擇酯化時(shí)間為45 min。

2.1.4 萃取方式和萃取時(shí)間 從圖1可看出振蕩萃取的草酸、蘋果酸、檸檬酸、亞油酸等含量低于超聲萃??；且超聲萃取10 min，草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸及油酸含量達(dá)到萃取平衡，故最佳提取方式為超聲萃取10 min。

2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線

從表1看出，草酸、蘋果酸、檸檬酸、棕櫚酸、亞油酸、油酸6種非揮發(fā)性有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)均大于0.999 0，檢出限為0.04～2.00 mg/g，方法具有良好的線性關(guān)系。

表1 非揮發(fā)性有機(jī)酸的回歸方程、相關(guān)系數(shù)和檢出限

注：AR為相對(duì)峰面積；CR為相對(duì)濃度。

Note: ARand CRrefer to relative peak areas and relative concentration respectively.

2.3 重現(xiàn)性和回收率

從表2可知，非揮發(fā)性有機(jī)酸 6次測(cè)定的RSD在1.04%～3.59%，能夠滿足樣品分析精密度要求。6種非揮發(fā)性有機(jī)酸酸的加標(biāo)回收率為89.2%～102.1%，表明該方法測(cè)定天麻非揮發(fā)性有機(jī)酸具有較好的回收率，可用于天麻樣品非揮發(fā)性有機(jī)酸的定量分析。

2.4 天麻樣品中6種非揮發(fā)性有機(jī)酸的含量

從表3可知，天麻中含有豐富的非揮發(fā)性有機(jī)酸，其中蘋果酸的含量最高，平均值為5.00 mg/g，其次是檸檬酸含量，平均值為3.47 mg/g，油酸的含量最低，平均值為0.13 mg/g。云南昭通天麻與湖北宜昌、陜西漢中的相比，檸檬酸含量較高，表明昭通天麻中有效成分較其他地區(qū)好。

表3 天麻樣品中非揮發(fā)性有機(jī)酸的含量

3 結(jié)論與討論

建立了衍生化GC-MS法快速定量測(cè)定天麻中非揮發(fā)性有機(jī)酸含量的方法，優(yōu)化的前處理?xiàng)l件為10%硫酸+5% PTSA的甲醇溶液，酯化溫度為50℃，酯化時(shí)間為45min，酯化完后采用超聲萃取10 min。方法評(píng)價(jià)結(jié)果顯示，6種非揮發(fā)性有機(jī)酸標(biāo)準(zhǔn)曲線的R2均大于0.999 0，檢出限為0.04～2.00 mg/g，6次測(cè)定的RSD在1.04%～3.59%，回收率為89.2%～102.1%。天麻中蘋果酸的含量最高，平均為5.00 mg/g；其次是檸檬酸含量，平均為3.47 mg/g；油酸含量最低，平均為0.13 mg/g。云南昭通天麻與湖北宜昌、陜西漢中的相比，檸檬酸含量較高[6]，表明昭通天麻中有效成分較其他地區(qū)的好。

所建立的方法簡(jiǎn)便、快速、重現(xiàn)性好，可應(yīng)用于天麻中非揮發(fā)性有機(jī)酸含量測(cè)定。由于其他省份天麻樣品數(shù)量較少，后續(xù)研究可增加云南省外的天麻樣品的測(cè)定數(shù)據(jù)，再進(jìn)行對(duì)比分析，進(jìn)而得出更為客觀的對(duì)比分析結(jié)果。