宋 莎， 馮建文， 吳亞維， 羅昌國， 韓秀梅

(貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 果樹科學(xué)研究所， 貴州 貴陽 550006)

花紅(MalusasiaticaNakai.)為薔薇科(Rosaceae)蘋果屬(Malus)落葉喬木，果實(shí)與蘋果相似，果較小，營養(yǎng)價(jià)值高，是集花果并賞的樹種，我國大部分地區(qū)均有分布，在南方可作蘋果砧木[1]，通過對(duì)貴州省蘋果屬資源調(diào)查[2]和親緣關(guān)系分析[3]等發(fā)現(xiàn)，花紅是貴州省重要的蘋果屬種質(zhì)資源。

近年來，多種分子標(biāo)記被開發(fā)，蘋果集群分離、全基因組關(guān)聯(lián)分析及功能基因等方面也取得一定進(jìn)展[4]。巴巧瑞等[5]利用SSR引物和SRAP引物可有效揭示37個(gè)品種的遺傳多樣性；王曉英等[6]利用AFLP分子標(biāo)記對(duì)4個(gè)蘋果品種進(jìn)行遺傳分析發(fā)現(xiàn)，聚類結(jié)果與表型特征相符；應(yīng)用微衛(wèi)星DNA(SSR)分子標(biāo)記進(jìn)行蘋果屬種質(zhì)資源鑒定[7-9]和群體遺傳分析[10-11]的文獻(xiàn)報(bào)道也較多。RAD-seq(restriction-site associated DNA sequencing)技術(shù)是在二代測序基礎(chǔ)上基于全基因組酶切位點(diǎn)的一項(xiàng)簡化基因組測序技術(shù)，基因組研究熱點(diǎn)領(lǐng)域如構(gòu)建高密度遺傳圖譜、精確定位重要性狀、組裝輔助基因組序列、群體基因組學(xué)以及系統(tǒng)發(fā)生學(xué)等應(yīng)用RAD-seq技術(shù)也較多[12]。應(yīng)用分子標(biāo)記對(duì)貴州花紅進(jìn)行種質(zhì)鑒定，對(duì)保護(hù)和利用花紅資源具有重大意義。因此，以10份花紅資源為材料，利用RAD-seq技術(shù)對(duì)其進(jìn)行簡化基因組測序，并全面分析花紅的SSR信息，以便為花紅新型分子標(biāo)記引物的篩選提供序列參考。

1 材料與方法

1.1 材料

2016年收集花紅10份(表1)，以實(shí)生苗方式保存。2018年從每份材料選取嫩葉5片，液氮速凍，-80℃保存。委托廣州基迪奧生物科技有限公司進(jìn)行RAD-Seq轉(zhuǎn)錄組測序(無參)。

表1 供試花紅的編號(hào)及來源

1.2 DNA提取及質(zhì)量檢測

采用CTAB(十六烷基三甲基溴化銨)法提取材料DNA，NanoDrop微量分光光度計(jì)法和1%瓊脂糖凝膠電泳法檢測DNA質(zhì)量，以保證其總量和純度。

1.3 文庫構(gòu)建

利用NEBNextDNA雙鏈片段化酶，根據(jù)不同作用時(shí)間將dsDNA切割成50～1 000 bp片段。按End Prep 混合酶 3 μL、End Repair Reaction Buffer 6.5 μL、Fragmented DNA 55.5 μL、Total volume 65 μL的反應(yīng)體系加入試劑進(jìn)行PCR反應(yīng)，進(jìn)行末端修復(fù)、磷酸化并加A。按體系Blunt/TA Ligase Master Mix 15 μL、NEBNext Adaptor for Illumina 2.5 μL、Ligation Enhancer 1 μL、Total volume 83.5 μL配制試劑，20℃ PCR反應(yīng)15 min后，在混合液中加入3 μL USER 酶37℃反應(yīng)15 min，加上P1接頭。帶有不同P1接頭的樣品混合，利用超聲或酶切將其打斷成300～700 bp的序列，加上P2接頭。PCR擴(kuò)增富集RAD標(biāo)記。用AMPure XP Beads純化PCR反應(yīng)，文庫質(zhì)檢。

1.4 信息分析

對(duì)每個(gè)樣品中PE reads的read1進(jìn)行比對(duì)和聚類，得到個(gè)體的stacks信息。將多個(gè)樣本的stacks聚類，得到群體stacks的一致性序列信息。根據(jù)群體stacks聚類的結(jié)果對(duì)read2進(jìn)行分類，將所有樣本來源同一個(gè)等位基因位點(diǎn)的read2歸為一類。然后對(duì)每個(gè)等位基因位點(diǎn)的read2進(jìn)行組裝拼接，得到基于reads2拼接的重疊群；將read1聚類得到stacks的一致性序列和read2拼接得到的重疊群進(jìn)行連接。若兩者有重疊，則根據(jù)重疊序列進(jìn)行合并，若兩者無重疊，則在中間以N補(bǔ)充。最終得到基于RAD聚類和拼接的RAD標(biāo)記。以群體RAD 標(biāo)記為參考序列，重新進(jìn)行個(gè)體的序列比對(duì)和變異檢測，并進(jìn)行其他下游高級(jí)分析。

利用Treebest 1.9.2構(gòu)建進(jìn)化樹對(duì)樣品進(jìn)行聚類分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAD-seq測序的質(zhì)量評(píng)估

簡化基因組測序結(jié)果(表2)顯示，花紅樣品的原始數(shù)據(jù)(Clean date)為1 043 992 564～1 775 387 156個(gè)，10個(gè)樣品共獲得13 976 968 360個(gè)原始數(shù)據(jù)；過濾后獲得的高質(zhì)量原始數(shù)據(jù)占總量的98.18%，Q20為97.31%～97.57%，Q30為93.24%～94.04%，GC含量為38.66%～43.38%，過濾前后的數(shù)據(jù)差異較小，且Q30處于較高水平，GC含量處于較低水平，表明樣本數(shù)據(jù)量足夠，測序數(shù)據(jù)合格可靠，建庫測序成功。

2.2 序列的拼接組裝

Reads拼接組裝后，重疊群組裝總數(shù)為628 413，重疊群N50為346 bp，最大長度1 015 bp，最小長度200 bp(圖1)，平均長度為331 bp。將得到的重疊群繼續(xù)與reads進(jìn)行連接構(gòu)建RAD標(biāo)記，重疊群組裝總數(shù)為784 572 bp，重疊群的長度N50=501 bp，最大長度2 210 bp，最小長度156 bp，平均長度為417 bp，可作為后續(xù)變異檢測和高級(jí)分析的參考序列。

表2 RAD-seq基因組測序的花紅數(shù)據(jù)

圖1Reads組裝后長度分布

Fig.1 Contig length of the reads after assembly

2.3 SSR位點(diǎn)及其引物信息

經(jīng)搜索最終獲得SSR位點(diǎn)40 623個(gè)，成功設(shè)計(jì)37 141對(duì)SSR引物，成功設(shè)計(jì)率為91.43%。經(jīng)SSR檢測成功設(shè)計(jì)引物SSR位點(diǎn)的重復(fù)序列長度為16～141 bp，其中最多的是二核苷酸(25 293條)，占總數(shù)的68.1%；其次是三核苷酸(6 543條)，占總數(shù)的17.6%；其余依次為四核苷酸(3 380條)、五核苷酸(1 333條)和六核苷酸(592條)。SSR引物基序的重復(fù)次數(shù)為4～13次，通過梯度退火溫度PCR，從10對(duì)備選SSR引物中篩選出可在花紅中成功擴(kuò)增并表現(xiàn)出多態(tài)性的引物7對(duì)，分別為1、2、5、6、8、9、10號(hào)，并確定這7對(duì)引物的最佳退火溫度(表3)。

表3 花紅10對(duì)引物的特性

2.4 構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹

由圖2可見，10份花紅材料可分為兩大類，其中貴州的8份材料聚為一類，云南的M-0916和M-0916_2聚為一類。貴州的8份材料中，安龍的M-0708與羅甸的M-0712親緣關(guān)系最近，其余依次為貴陽的JZ、威寧的M-0710、貴陽的M-0706_2、鎮(zhèn)寧的M-0702、興仁的M-0704、興義的M-0706。

圖2 10份花紅的系統(tǒng)進(jìn)化樹

3 結(jié)論與討論

種質(zhì)鑒定的方法有形態(tài)學(xué)、同工酶、分子標(biāo)記等。試驗(yàn)采用RAD-seq技術(shù)對(duì)花紅進(jìn)行簡化基因組測序，獲得了花紅基因組水平上的序列信息，經(jīng)聚類和組裝后也有較高的準(zhǔn)確性，可代表花紅部分基因組。對(duì)獲得的序列進(jìn)行過濾，獲得的SSR位點(diǎn)有40 623個(gè)，成功設(shè)計(jì)引物37 141對(duì)，從10對(duì)備選SSR引物中篩選出可在花紅中成功擴(kuò)增的引物有7對(duì)。通過系統(tǒng)進(jìn)化樹對(duì)10份花紅樣品進(jìn)行聚類分析，可將貴州和云南的材料分開，也能明顯看出貴州的8份材料親緣關(guān)系的遠(yuǎn)近，表明可利用RAD-seq技術(shù)進(jìn)行種質(zhì)鑒定工作，與異形花[13]和煙草[14]等物種開展的SSR信息研究相類似，RAD-seq技術(shù)具有性價(jià)比高、數(shù)據(jù)利用率高、準(zhǔn)確性高、不受基因組序列限制等優(yōu)勢[12]。

貴州省屬于典型的喀斯特地貌，由于特殊的地理環(huán)境，野生果樹資源豐富，蘊(yùn)藏著豐富的基因資源，可能存在值得挖掘的種質(zhì)?；t是貴州省較常見的資源，但為零星分布，近些年受一些因素的不利影響。貴州省花紅資源具有某些獨(dú)特的基因，與云南省的花紅資源易區(qū)分，有助于揭示其遺傳信息，對(duì)未來貴州省花紅資源的收集評(píng)價(jià)及對(duì)資源的利用和改良有重要參考價(jià)值。但有些花紅果實(shí)品質(zhì)良好，經(jīng)過了較多的人為干預(yù)，其具體價(jià)值有待進(jìn)一步研究探討。