朱麗莉， 李冬光， 綦世金， 陶宇航， 韓 雪， 伍革民*

(1.貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院 畜牧獸醫(yī)研究所， 貴州 貴陽 550005； 2.銅仁職業(yè)技術(shù)學(xué)院， 貴州 銅仁 554300)

貴州省地方雞遺傳資源豐富，普遍具有耐粗飼、抗逆性強(qiáng)、適應(yīng)性強(qiáng)、肉質(zhì)鮮美細(xì)嫩等特性，是培育我國優(yōu)質(zhì)雞的重要遺傳材料，但受限于繁殖性能和品種綜合性狀水平不高而未被廣泛應(yīng)用于育種生產(chǎn)中。家禽繁殖活動(dòng)是由多因素調(diào)控的復(fù)雜過程，主要受遺傳、環(huán)境、營養(yǎng)等因素綜合影響，其中在環(huán)境因子與繁殖性能互作關(guān)系研究中發(fā)現(xiàn)，光照是極為重要的影響因素之一。光照是驅(qū)動(dòng)生物體生物節(jié)律的原始動(dòng)力，其激發(fā)的中心節(jié)律維系了生物機(jī)體組織器官的正常活動(dòng)[1]和調(diào)控家禽繁殖活動(dòng)[2-4]。

ONECUT基因家族包括ONECUT1、ONECUT2和ONECUT3，是根據(jù)基因含有單獨(dú)的CUT域和同源域的結(jié)構(gòu)特征而命名[5-6]。ONECUT基因家族編碼的蛋白質(zhì)產(chǎn)物在神經(jīng)發(fā)育、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)、光色素基因表達(dá)調(diào)控等方面發(fā)揮重要作用。ONECUT1又名哺乳動(dòng)物肝細(xì)胞核因子(Hepatocyte Nuclear Factor-6,HNF-6)，屬于組織特異性轉(zhuǎn)錄因子，調(diào)節(jié)胚胎期消化器官肝臟、原腸、神經(jīng)器官的生長發(fā)育，通過控制代謝基因轉(zhuǎn)錄參與調(diào)控糖代謝過程[6]。研究發(fā)現(xiàn)，秀麗隱桿線蟲、果蠅、海膽、斑馬魚和小鼠的ONECUT1基因與神經(jīng)發(fā)育有關(guān)[7-11]。JACQUEMIN等[12-13]研究表明，ONECUTl基因在哺乳動(dòng)物肝臟、膽管和胰腺中均有表達(dá)，影響其膽汁的分泌，參與調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)。郭正陽等[14]發(fā)現(xiàn)，ONECUT與雌性特異性和二態(tài)性有關(guān)，可促進(jìn)肝細(xì)胞增殖，參與腫瘤發(fā)生、組織再生等生理過程。WU等[15]研究表明，ONECUTl基因是小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育的主要調(diào)控基因，可能與視網(wǎng)膜神經(jīng)元水平細(xì)胞中起源和維持有關(guān)。GOETZ等[16]對小鼠視網(wǎng)膜神經(jīng)元細(xì)胞發(fā)育的調(diào)控因子進(jìn)行研究表明，在小鼠視網(wǎng)膜發(fā)育階段ONECUT1基因表達(dá)量較高；在敲除了ONECUT1基因的個(gè)體中發(fā)現(xiàn)黑視蛋白(光敏感神經(jīng)節(jié)細(xì)胞中光色素)和光色素基因的表達(dá)上調(diào)，說明ONECUT1基因可能與視網(wǎng)膜的感光作用相關(guān)。

目前，ONECUT1基因的研究主要集中在軟體動(dòng)物和部分哺乳動(dòng)物中，關(guān)于該基因家族的DNA序列變異、基因表達(dá)與調(diào)控,以及該基因編碼的蛋白質(zhì)的生理功能等方面的研究在豬、牛、羊以及雞中等均未見報(bào)道。因此，選用貴州省地方雞種荔波瑤山雞、長順綠殼蛋雞、赤水烏骨雞、水西烏骨雞、廣西烏骨雞為研究材料，分析ONECUT1基因在5個(gè)貴州地方雞品種或群體間的序列差異性，為ONECUT1基因在貴州地方品種雞中的進(jìn)一步研究奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)雞群

荔波瑤山雞選自貴州省貴陽市烏當(dāng)區(qū)百宜鄉(xiāng)洛壩村種雞場，長順綠殼蛋雞選自長順縣綠殼蛋雞養(yǎng)殖場，赤水烏骨雞、水西烏骨雞、廣西烏骨雞均選自貴州省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所動(dòng)物試驗(yàn)場。樣本選擇要求群體健康、一致性較好、性能較為穩(wěn)定?；静捎贸Ｒ?guī)飼養(yǎng)管理方式，個(gè)體籠養(yǎng)。各品種或遺傳群體隨機(jī)選擇30只雞，翅下靜脈采血1～1.5 mL，加EDTA-Na2抗凝，-20℃保存，用于提取基因組DNA。

1.2 基因組 DNA提取及引物設(shè)計(jì)

采用TIANamp Blood DNA Kit試劑盒提取血樣中的DNA。根據(jù)GenBank中雞的ONECUTl基因序列(NM_205243.1)，合成4對引物檢測ONECUT1基因在各品種或遺傳群體個(gè)體中的基因型遺傳變異情況。檢測的位點(diǎn)、引物序列、擴(kuò)增長度以及檢測方法如表1。所有引物由天根生化科技有限公司合成。

表1 不同雞基因型檢測的引物序列

1.3 PCR擴(kuò)增及測序

PCR反應(yīng)體系20 μL:DNA模板1 μL，上下游引物各1 μL，2×Taq PCR Master Mix試劑10 μL，加ddH2O至20 μL。PCR反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性6 min；95℃變性30 s，特定溫度(各引物的退火溫度見表1)退火30 s，72℃延伸45 s，30個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10 min。PCR產(chǎn)物用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測。PCR產(chǎn)物委托諾賽基因組研究中心有限公司純化回收后進(jìn)行雙向測序。

1.4 數(shù)據(jù)處理

使用DNAstar對測序結(jié)果進(jìn)行校正，進(jìn)入基因庫網(wǎng)站采用BLAST分析序列SNPs，采用DNAMAN分析SNPs變異導(dǎo)致蛋白質(zhì)編碼變異情況。Excel統(tǒng)計(jì)試驗(yàn)雞ONECUTl基因分型情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同雞品種的多態(tài)位點(diǎn)

由表2可見，4對引物僅有1對引物檢測出4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，其余3對引物均未檢測多態(tài)位點(diǎn)。與雞的全基因組序列(gallus 5版)比對發(fā)現(xiàn)，4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)均位于內(nèi)含子上，分別是16 369位置C→A，16 517位置C→T，16 587位置C→G，16 639位置C→T。

表2 雞品種檢測出的 4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)

2.2 多態(tài)位點(diǎn)品種間的差異

由表2可知，在ONECUTl基因16 369位置上，瑤山雞、長順綠殼蛋雞、赤水烏骨雞、水西烏骨雞和廣西烏骨雞均在該序列位置為A，而NCBI登錄序列該位置為堿基C；在16 517位置上，長順綠殼蛋雞與NCBI登錄序列一致，該位置堿基為C，其他4個(gè)雞品種在該序列位置均為堿基T；在16 587位置上，瑤山雞和赤水烏骨雞在該位置檢測出多態(tài)性(C或G，圖1)，其他3個(gè)品種雞在該序列位置為堿基C，無序列變異；16 639位置上，瑤山雞和赤水烏骨雞在該位置檢測出多態(tài)性(C或T)，其他3個(gè)品種雞在該序列位置無變異，均為堿基C。

圖1 不同雞品種雜合子的波峰

3 結(jié)論與討論

雞ONECUT1基因定位于10號(hào)染色體上，全長12 072 bp，mRNA包括2個(gè)外顯子和1個(gè)內(nèi)含子，編碼450個(gè)氨基酸。通過GenBank數(shù)據(jù)庫檢索，到目前為止，共檢索到ONECUT1基因8 626個(gè)SNP，這些SNP主要分布于人中，在雞中尚未有該基因SNP的登錄信息，通過文獻(xiàn)檢索也未發(fā)現(xiàn)該基因在雞中的序列變異報(bào)道。試驗(yàn)主要針對該基因的外顯子區(qū)域設(shè)計(jì)引物，在5個(gè)地方雞品種的序列變異檢測出4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)，均分布在第一內(nèi)含子上，分別為16 369位、16 517位、16 587位和16 639位。從4個(gè)多態(tài)位點(diǎn)在5個(gè)地方雞品種的分布看，長順綠殼蛋雞在16 517位置為堿基C，與GenBank參照序列一致，而瑤山雞、赤水烏骨雞、水西烏骨雞和廣西烏骨雞在該位置為堿基T；瑤山雞和赤水烏骨雞在16 587位置和16 639位置檢測出多態(tài)(C/G和C/T)，長順綠殼蛋雞、水西烏骨雞和廣西烏骨則與GenBank參照序列一致，為堿基C。研究表明，該基因序列變異具有品種特異性，與品種的進(jìn)化選擇有關(guān)。在許多疾病相關(guān)基因中位于deep內(nèi)含子內(nèi)的突變影響pre-mRNA的剪接過程[17]。最常見的剪接突變形式是通過產(chǎn)生或增強(qiáng)剪接位點(diǎn)或產(chǎn)生新的分支點(diǎn)而導(dǎo)致異常剪接。在特定的內(nèi)含子中，突變可以創(chuàng)造新的剪接位點(diǎn)，成為新外顯子的邊界，從而使新產(chǎn)生的外顯子被包含在成熟的mRNA產(chǎn)物中。但并不是所有位于內(nèi)含子的突變均產(chǎn)生或增強(qiáng)剪接位點(diǎn)，提示有其他未知的剪接調(diào)控元件。試驗(yàn)4個(gè)突變點(diǎn)是否能改變剪接機(jī)制處理內(nèi)含子的方式，進(jìn)而參與到動(dòng)物機(jī)體的生理調(diào)控機(jī)制中，又在其中發(fā)揮何種作用；4個(gè)位點(diǎn)在不同地方雞品種間的差異性是否為其品種特異性，或與重要經(jīng)濟(jì)性狀有關(guān)有待進(jìn)一步的研究。ONECUT1基因在5個(gè)地方雞品種在外顯子區(qū)域無序列差異，說明該基因蛋白質(zhì)編碼區(qū)域序列保守。雞ONECUT1基因序列全長12 072 bp，大部分內(nèi)含子區(qū)域在試驗(yàn)中未檢測到，內(nèi)含子區(qū)域的序列變異，以及變異與品種特異性和該基因的功能關(guān)聯(lián)還有待進(jìn)一步深入研究。