董照鋒, 程光祿, 曹秀榮

(1.商洛市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全檢驗(yàn)檢測(cè)中心， 陜西 商洛 726000； 2.鎮(zhèn)安縣達(dá)仁鎮(zhèn)農(nóng)業(yè)綜合服務(wù)站， 陜西 鎮(zhèn)安 711507)

商洛位于秦嶺南麓，地處暖溫帶向亞熱帶過(guò)渡帶，屬于暖溫帶半濕潤(rùn)季風(fēng)氣候，是中國(guó)最北端茶區(qū)。特殊的生態(tài)環(huán)境、立地條件和耕作方式，形成了獨(dú)特的有害生物群體。2016—2017年，筆者所在課題組對(duì)商洛茶區(qū)病蟲(chóng)害種類開(kāi)展普查，弄清了茶樹(shù)病蟲(chóng)害種類及主要病蟲(chóng)害發(fā)生規(guī)律[1]，相繼開(kāi)展茶云紋葉枯病、茶輪斑病、茶芽枯病的防治試驗(yàn)[2]。茶赤葉斑病(病原PhyllostictatheicolaPetch)是商洛茶園的重要病害，該病為高溫高濕性的病害，在商洛常年5—6月發(fā)病，盛發(fā)期為7—8月，夏季高溫干旱、秋天多雨有利于病害的發(fā)生流行。目前，對(duì)該病防治技術(shù)研究的文獻(xiàn)較少，胡淑霞等[3-4]研究表明，茶樹(shù)益微TBM對(duì)茶赤葉斑病的抑制可達(dá)到66.28%，500倍多抗霉素對(duì)茶赤葉斑病的抑制率為51.90%。王瑾等[5]研究表明，糖苷類和順-3-己烯醇、水楊酸甲酯、苯甲醇、苯乙醇、芳樟醇氧化物、香葉醇和芳樟醇7類物質(zhì)對(duì)茶赤葉斑病菌都有明顯的抑制作用，其中香葉醇的抑制作用最強(qiáng)，抑制率和物質(zhì)濃度有著明顯的線性關(guān)系。張華艷[6]研究表明，咖啡堿對(duì)茶赤葉斑病具有明顯的抑制，當(dāng)咖啡堿濃度在1～10 mg/mL,其抑制率為33.0%～100%。為有效控制茶赤葉斑病的危害，選取武夷菌素、多抗霉素、枯草芽孢桿菌、春雷霉素、戊唑醇5種藥劑開(kāi)展茶赤葉斑病病菌的體外抑制試驗(yàn)，篩選優(yōu)質(zhì)、高效、低殘留的農(nóng)藥，以期為大田防治茶赤葉斑病提供有效依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 供試材料

1.1.1 藥劑 2%武夷菌素AS，山東濰坊萬(wàn)勝生物農(nóng)藥有限公司，2018年5月10日生產(chǎn)；3%多抗霉素AS，績(jī)溪農(nóng)華生物科技有限公司，2018年3月1日生產(chǎn)；6%春雷霉素WP，山東利邦農(nóng)化有限公司，2018年6月23日生產(chǎn)；100億芽孢/g枯草芽孢桿菌WP，德強(qiáng)生物股份有限公司，2018年2月22日生產(chǎn)；430 g/L戊唑醇SC，西安鼎盛生物化工有限公司，2018年1月2日生產(chǎn)。

1.1.2 培養(yǎng)基 1) 茶葉粉PDA培養(yǎng)基：自來(lái)水1 000 mL、馬鈴薯(去皮)200 g、葡萄糖20 g、茶葉粉(80目)15 g、瓊脂粉15 g。2) 清水瓊脂培養(yǎng)基：自來(lái)水1 000 mL、瓊脂粉15 g。

1.1.3 菌種 供試的病原菌由商洛市農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全中心實(shí)驗(yàn)室提供，于2017年10月23日從山陽(yáng)縣漫川鎮(zhèn)娘娘廟村賀家?guī)X萬(wàn)福茶廠千畝有機(jī)茶園采集的典型癥狀新鮮病葉，進(jìn)行室內(nèi)分離、培養(yǎng)、鑒定后于4℃保存，每3個(gè)月對(duì)菌種活化1次。

1.2 方法

1.2.1 培養(yǎng)基的篩選 采用直接測(cè)量法測(cè)定菌落直徑，篩選最適宜的培養(yǎng)基。把菌種分別接種到PDA、茶葉粉5 g/L+PDA、茶葉粉10 g/L+PDA和茶葉粉15 g/L+PDA 4種培養(yǎng)基上。通過(guò)測(cè)量不同培養(yǎng)基菌絲直徑選出最適宜的培養(yǎng)基。

1.2.2 藥劑試驗(yàn)設(shè)計(jì) 試驗(yàn)共6個(gè)處理，4次重復(fù)，不同處理濃度按照藥劑使用說(shuō)明推薦用量確定。處理1：430 g/L戊唑醇SC 90 μg/mL；處理2：6%春雷霉素WP 100 μg/mL；處理3：枯草芽孢桿菌WP 500萬(wàn)芽孢/mL；處理4：2%武夷菌素AS 40 μg/mL；處理5：3%多抗霉素AS 60 μg/mL；處理6(CK)：滅菌水對(duì)照。將茶赤葉斑病菌絲或孢子接種于不同處理配置的含藥培養(yǎng)基中，于25℃、濕度90%恒溫恒濕條件下培養(yǎng)，測(cè)定5種藥劑對(duì)茶赤葉斑病菌絲及分生孢子的抑制效果。

1.2.3 藥劑對(duì)茶赤葉斑病菌絲及分生孢子抑制效果的測(cè)定 采用菌絲生長(zhǎng)速率法[7-8]測(cè)定5種供試藥劑對(duì)菌絲的抑制作用。采用孢子萌發(fā)法[9-10]測(cè)定5種供試藥劑對(duì)孢子萌發(fā)的抑制作用。

1.2.4 含藥培養(yǎng)基制備及菌絲接種 為避免培養(yǎng)基快速冷卻，確保每個(gè)培養(yǎng)皿中可以加入足夠多的含藥培養(yǎng)基，在實(shí)際操作時(shí)，各處理一次性多配制2份含藥培養(yǎng)基。先將5個(gè)藥劑處理按照以下濃度配置，430 g/L戊唑醇SC 900 μg/mL、6%春雷霉素WP 1 000μg/mL、枯草芽孢桿菌5 000萬(wàn)芽孢/mL、2%武夷菌素AS 400 μg/mL、3%多抗霉素AS 600 μg/mL。準(zhǔn)備好已滅菌的燒杯、培養(yǎng)皿、PDA培養(yǎng)基，無(wú)菌環(huán)境下用10 mL一次性注射器注入稀釋好的藥液6 mL于100 mL燒杯中，當(dāng)PDA培養(yǎng)基冷卻到500C左右時(shí)，再向燒杯中注入培養(yǎng)基54 mL，多次推拉注射器讓藥液充分混合均勻，最后用一次性注射器向9 cm培養(yǎng)皿中注入含藥培養(yǎng)基10 mL，制成含藥平板培養(yǎng)基，此時(shí)藥劑濃度為原濃度1/10?？瞻讓?duì)照組為6 mL滅菌水和54 mL茶葉粉PDA培養(yǎng)基[11]。

選取在25℃、濕度90%恒溫培養(yǎng)5 d的活化菌種，在菌落周邊生長(zhǎng)茂盛、均勻一致處用打孔器制備直徑6 mm菌餅，每皿1塊，植入茶葉粉PDA平板培養(yǎng)基中間位置，接種完畢，將各處理置入25 ℃、濕度90%恒溫恒濕條件下培養(yǎng)，分別于72 h、96 h、120 h、144 h、168 h用十字交叉法測(cè)量各皿菌落直徑，計(jì)算菌絲生長(zhǎng)擬制率。

菌絲生長(zhǎng)抑制率=[(對(duì)照菌落直徑-處理菌落直徑)/(對(duì)照菌落直徑-菌餅直徑) ]×100%

1.2.5 孢子懸浮液制備及接種 取蒸餾水600 mL于1 000 mL燒杯中，用棉塞塞好并用繩子包扎好于121℃高壓蒸氣滅菌30 min，保存?zhèn)溆?。選用培養(yǎng)好的茶赤葉斑病原菌(培養(yǎng)20 d，已產(chǎn)生分生孢子)平板培養(yǎng)物1～2皿，在無(wú)菌環(huán)境下，用一次性注射器注入10 mL滅菌水。用一次性接種鏟輕刮菌落表面，用力按壓分生孢子器讓其破裂。將2張擦鏡紙放在滅過(guò)菌口徑為7 cm的小漏斗上，將孢子懸浮液過(guò)濾在滅菌的50 mL錐形瓶?jī)?nèi)，重復(fù)過(guò)濾2次。在顯微鏡下觀察孢子懸浮液的孢子量，加滅菌水調(diào)節(jié)孢子濃度，當(dāng)每個(gè)視野能觀察到80～100個(gè)孢子時(shí)，孢子懸浮液制備完成[12]。

分生孢子采用水瓊脂培養(yǎng)法。為避免培養(yǎng)基快速冷卻，各處理制成4份含藥培養(yǎng)基。用一次性注射器吸取稀釋好的藥液4 mL于100 mL已滅菌的燒杯中，加入經(jīng)高壓蒸氣滅菌并冷卻到50 ℃左右的清水瓊脂培養(yǎng)基36 mL，讓藥液充分混合均勻，然后用一次性注射器吸取10 mL含藥培養(yǎng)基2份，分別注入2個(gè)滅菌的9 cm培養(yǎng)皿中，制成含藥平板培養(yǎng)基。空白對(duì)照組為4 mL滅菌水和36 mL清水瓊脂培養(yǎng)基，按上述方法制作2個(gè)對(duì)照平板培養(yǎng)基。平板培養(yǎng)基制好后，在每個(gè)培養(yǎng)皿背面用記號(hào)筆畫3個(gè)小圓圈標(biāo)記孢子懸浮液滴入點(diǎn)位置以便觀察。在3個(gè)小圈內(nèi)，每點(diǎn)滴1滴孢子懸浮液，即為3次重復(fù)。將各處理置于25 ℃、濕度90%恒溫恒濕條件下培養(yǎng)，在對(duì)照組80%～90%孢子萌發(fā)時(shí)，將對(duì)應(yīng)處理組全部取出立即放入4 ℃冰箱冷藏，終止孢子繼續(xù)萌發(fā)。然后逐一取出鏡檢統(tǒng)計(jì)各處理孢子萌發(fā)情況。每個(gè)點(diǎn)(即1個(gè)重復(fù))檢查3個(gè)視野，并對(duì)孢子萌發(fā)狀況進(jìn)行顯微拍照。

孢子萌發(fā)率=(孢子萌發(fā)數(shù)量/觀察孢子數(shù)量)×100%

孢子萌發(fā)抑制率=[(對(duì)照孢子萌發(fā)率-處理孢子萌發(fā)率)/ (對(duì)照孢子萌發(fā)率) ]×100%

1.2.6 殺菌劑不同濃度處理對(duì)菌絲的抑制試驗(yàn) 根據(jù)不同藥劑對(duì)茶赤葉斑病菌絲和分生孢子的抑制效果，篩選出抑菌效果較好的武夷菌素、枯草芽孢桿菌2種藥劑進(jìn)行濃度梯度試驗(yàn)，測(cè)定篩選藥劑的抑制作用。

1) 不同濃度武夷菌素對(duì)菌絲的抑制作用。試驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)處理，各處理4次重復(fù)。處理A：65 μg/mL；處理B:40 μg/mL；處理C:30 μg/mL；處理D:20 μg/mL；處理E:10 μg/mL；處理F(CK)：滅菌水對(duì)照。含藥培養(yǎng)基的配制參照1.2.4進(jìn)行。

1.4 觀察指標(biāo) ①根據(jù)Barthel指數(shù)和Harris髖關(guān)節(jié)評(píng)分比較患者干預(yù)前后功能康復(fù)情況［2］。②根據(jù)視覺(jué)模擬疼痛評(píng)分（VAS評(píng)分）比較患者干預(yù)前后疼痛程度［3］。③根據(jù)焦慮自評(píng)量表（SAS評(píng)分）、抑郁自評(píng)量表（SDS評(píng)分）比較患者心理狀態(tài)［4］。

2) 不同濃度枯草芽孢桿菌對(duì)菌絲抑制作用。試驗(yàn)共設(shè)置6個(gè)處理，4次重復(fù)。處理a:500萬(wàn)芽孢/mL；處理b:400萬(wàn)芽孢/mL；處理c:300萬(wàn)芽孢/mL；處理d:200萬(wàn)芽孢/mL；處理可e:100萬(wàn)芽孢/mL；處理f(CK)：滅菌水對(duì)照。含藥培養(yǎng)基的配制參照1.2.4進(jìn)行。

2 結(jié)果與分析

2.1 適宜培養(yǎng)基

在溫度25℃，濕度90%條件下培養(yǎng)168 h，PDA 培養(yǎng)基、茶葉粉5 g/L+PDA培養(yǎng)基、茶葉粉10 g/L+PDA培養(yǎng)基和茶葉粉15 g/L+PDA培養(yǎng)基4個(gè)處理的茶赤葉斑病菌的菌落直徑分別為45.4 mm、49.3 mm、43.9 mm和44.8 mm，經(jīng)差異顯著性分析，茶葉粉5 g/L+PDA培養(yǎng)基的菌落直徑極顯著高于其余處理，該處理的菌落生長(zhǎng)最快、長(zhǎng)勢(shì)最好。因此，茶葉粉5 g/L+PDA培養(yǎng)基為最優(yōu)組合，后續(xù)的試驗(yàn)采用該培養(yǎng)基組合。

2.2 5種殺菌劑對(duì)茶赤葉斑病菌絲的抑制作用

從表1可知，處理1的抑制作用持久、穩(wěn)定、效果最好，72～168 h抑制率均為100%。處理3對(duì)菌絲抑制效果隨著處理時(shí)間的延長(zhǎng)呈增強(qiáng)趨勢(shì)，在168 h的抑制率達(dá)94.43%。處理4在72～168 h抑制作用比較穩(wěn)定，抑制率為66.21%～69.57%。處理2和處理5的抑制作用較差。72～168 h，處理2和處理6(CK)的抑制作用差異均不顯著，與其余處理間的差異極顯著，處理1、3、4、5間的差異極顯著。

2.3 5種殺菌劑對(duì)茶赤葉斑病菌分生孢子的抑制作用

從表2看出，接種后22 h，處理6(CK)的孢子萌發(fā)率為55.07%。5個(gè)藥劑處理中，處理2對(duì)茶赤葉斑病菌分生孢子的抑制效果最好，抑制率為89.01%，萌發(fā)率為6.05%，與其余處理差異極顯著。處理5、處理1、處理3和處理4對(duì)茶赤葉斑病菌分生孢子的抑制率分別為47.90%、29.96%、28.57%和5.36%，抑制作用較差。處理2與其余處理分生孢子萌發(fā)率的差異達(dá)極顯著水平，處理1和3、處理4和6間差異不顯著。

表1 5種殺菌劑對(duì)茶赤葉斑病菌絲的抑制率

注：同列不同大小字母分別表示0.01、0.05水平差異顯著，下同。

Note: Different capital and lowercase letters in the same column indicate different difference at 0.01 and 0.05 levels respectively. The same below.

表2 5種殺菌劑對(duì)茶赤葉斑病菌分生孢子的抑制作用(接種22 h)

2.4 不同濃度武夷菌素和枯草芽孢桿菌對(duì)茶赤葉斑病菌絲的抑制作用

2.4.1 武夷菌素 從表3可知，5個(gè)濃度武夷菌素隨著時(shí)間的推移對(duì)茶赤葉斑病菌絲的抑制率呈逐漸下降趨勢(shì)，均在用藥72 h的抑制率最高，處理A、B和 C的抑制率都在60%以上。168 h 時(shí)，處理A、B、C、D、E的抑制率分別為69.55%、59.32%、48.82%、41.47%和35.70%，處理A的菌落直徑與其余處理差異極顯著?？傮w而言，高濃度的武夷菌素對(duì)菌絲抑制效果較好，但已超出了推薦使用的濃度。

表3 不同濃度武夷菌素和枯草芽孢桿菌對(duì)茶赤葉斑病菌絲的抑制率

2.4.2 枯草芽孢桿菌 5個(gè)濃度的枯草芽孢桿菌對(duì)茶赤葉斑病菌絲的抑制率隨著時(shí)間的推移呈增強(qiáng)趨勢(shì)，在168 h達(dá)到最高。在168 h，處理a、b、c、d和e對(duì)茶赤葉斑病菌絲的抑制率分別為94.49%、93.96%、93.44%、93.44%和92.39%，都具有較好的抑制作用。且5個(gè)處理的菌落直徑與對(duì)照差異極顯著，處理a和處理b差異不顯著；處理b、c和d間差異不顯著，與處理e差異顯著。

3 結(jié)論與討論

茶赤葉斑病菌的最佳培養(yǎng)基為茶葉粉5 g/L+PDA。430 g/L戊唑醇SC 90 μg/mL對(duì)茶赤葉斑病菌絲抑制作用最明顯，對(duì)病害控制見(jiàn)效快、效果明顯，在72～168 h抑制率均為100%。500萬(wàn)芽孢/mL和400萬(wàn)芽孢/mL枯草芽孢桿菌對(duì)菌絲抑制率達(dá)94.49%和93.96%，兩者之間差異不顯著。2%武夷菌素AS 65 μg/mL對(duì)菌絲抑制率為69.55%，也具有較好的抑制作用。6%春雷霉素WP 100 μg/mL對(duì)孢子抑制效果最好，22 h時(shí)抑制率達(dá)89.01%。春雷霉素主要用于茶赤葉斑病的早期預(yù)防，戊唑醇和枯草芽孢桿菌用于發(fā)病茶園的防治。對(duì)于茶赤葉斑病重發(fā)茶園，建議使用430 g/L SC戊唑醇90 μg/mL與6%春雷霉素WP 100 μg/mL混配進(jìn)行防治。董照鋒[12]研究表明，春雷霉素與枯草芽孢桿菌混配會(huì)降低枯草芽孢桿菌對(duì)菌絲的抑制作用，建議在茶赤葉斑病重發(fā)茶園防治時(shí)可采用400萬(wàn)芽孢/mL枯草芽孢桿菌與6%春雷霉素WP 100 μg/mL間隔10～15 d交替使用。

在試驗(yàn)中90 μg/mL戊唑醇430 g/L SC抑制率達(dá)100%，由于試驗(yàn)濃度遠(yuǎn)低于推薦使用濃度，因此未對(duì)其開(kāi)展梯度試驗(yàn)。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，多抗霉素水劑對(duì)茶赤葉斑病的分生孢子有致畸作用，其畸形率達(dá)16.66%，主要表現(xiàn)為芽管明顯偏短，部分芽管嚴(yán)重畸形，局部膨大似水葫蘆狀，關(guān)于其機(jī)理還需要進(jìn)一步試驗(yàn)研究。雖然高濃度的武夷菌素對(duì)茶赤葉斑病菌絲抑制作用較好，由于超出了推薦使用濃度，生產(chǎn)中不建議使用。茶赤葉斑病原菌體外抑制試驗(yàn)是在實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行的，因此，篩選出的防治藥劑或配方還需大田進(jìn)一步試驗(yàn)。