王俊歡,李先軍,吳巍,樊雙虎,賈陽,王嘉翼,閆艷春
研究報告
閆艷春 中國農業(yè)科學院研究生院教授,博士生導師,國務院政府特殊津貼獲得者。1982年畢業(yè)于北京師范大學化學系。從教38年來,始終工作在教學一線,先后給1萬余名本科生、研究生開設多門課程。長期從事環(huán)境微生物學領域的研究工作,已完成國家級、省部級課題7項,獲得國家發(fā)明專利和省部級科技成果獎勵7項。在其所研究領域有影響力的學術期刊發(fā)表論文90余篇,其中SCI收錄論文51篇,專著1部;獲已授權發(fā)明專利5項。
混合菌群YC-BJ1對有機磷阻燃劑的降解及16S rRNA基因多樣性分析
王俊歡,李先軍,吳巍,樊雙虎,賈陽,王嘉翼,閆艷春
中國農業(yè)科學院研究生院,北京 100081
作為阻燃劑,有機磷酸酯廣泛應用于工業(yè)制品和人類生活用品中,是一種全球性的環(huán)境污染物,因其具有特殊的理化性質,自然條件下很難水解。因此,對有機磷酸酯的微生物降解成了當下的研究熱點。通過持續(xù)逐級富集,從北京某垃圾處理廠滲透液中富集到一個混合菌群 (編號為YC-BJ1),并在降解特性、底物譜以及物種組成多樣性3個方面對其進行定性鑒定。該菌群能夠高效降解磷酸三苯酯 (Triphenyl phosphate, TPhP) 和磷酸三甲苯酯 (Tricresyl phosphate, TCrP),培養(yǎng)4 d能夠實現(xiàn)對100 mg/L TPhP和TCrP的基本降解,降解率分別為99.8%和91.9%。降解特性研究發(fā)現(xiàn),該混合菌群具有出色的環(huán)境適應能力,能夠在較寬的環(huán)境條件下 (溫度15–40 ℃, pH 5.0–12.0, 0%–4%鹽) 保持對TPhP的降解能力。底物譜分析發(fā)現(xiàn),混合菌群YC-BJ1能夠降解部分含氯有機磷阻燃劑,培養(yǎng)4 d,對磷酸三(1,3-二氯異丙基) 酯 (Tris(1,3-dichloroisopropyl) phosphate, TDCPP) 和磷酸三(2-氯乙基) 酯 (Tris(2-chloroethyl) phosphate, TCEP) 的降解率分別為16.5%和22.0%。16S rRNA基因物種多樣性分析發(fā)現(xiàn),混合菌群YC-BJ1中物種豐度最高的3個菌屬分別是生絲微菌屬(38.80%)、金黃桿菌屬(17.57%) 和鞘氨醇盒菌屬(17.46%)。與目前已報道的有機磷阻燃劑降解菌和菌群相比,混合菌群在降解效率和環(huán)境適應能力方面都具有極大的優(yōu)勢,有較廣泛的應用空間。高效降解菌群的富集能夠為有機磷阻燃劑的降解及其環(huán)境污染生物修復提供微生物資源,并為其降解機理的探索提供支持。
有機磷阻燃劑,磷酸三苯酯,生物降解,混合菌,16S rRNA基因多樣性分析
有機磷酸酯 (Organophosphorus esters, OPEs)是一類典型的有機磷阻燃劑 (Organophosphorus flame retardants, OPFRs)。作為阻燃劑和增塑劑,OPEs廣泛應用于多種產品中,包括塑料、紡織品、家具、電子產品、車輛以及建筑用品等。常用的OPFRs分為三類:烷基磷酸酯,如磷酸三(丁氧基乙基) 酯 (Tris(2-butoxyethyl) phosphate, TBEP)和磷酸三辛酯 (Tris(2-ethylhexyl) phosphate, TEHP);含氯磷酸酯,常用的有磷酸三(2-氯丙基)酯 (Tris(1-chloro-2-propyl) phosphate, TCPP)、磷酸三(2-氯乙基) 酯 (Tris(2-chloroethyl) phosphate, TCEP) 和磷酸三(1,3-二氯異丙基)酯 (Tris(1,3-dichloroisopropyl) phosphate, TDCPP);以及芳基磷酸酯,如磷酸三苯酯 (Triphenyl phosphate, TPhP) 和磷酸三甲苯酯 (Tricresyl phosphate, TCrP)[1-3]。因其持久性和危害性,2009年起,多溴聯(lián)苯醚 (Polybrominated diphenyl ethers, PBDEs) 已禁止使用,作為替代物的OPFRs的使用量持續(xù)增長[4]。
OPFRs作為添加劑,并沒有與產品基質通過化學鍵連接,在生產、運輸以及使用的過程中有大量的OPFRs釋放到環(huán)境中[5-6]。因此,OPFRs在不同的環(huán)境介質中都有分布,比如室內環(huán)境[7-8]、水環(huán)境如飲用水[9]、地表水[10]以及江河湖海[11-13]、大氣[14-15]、土壤和沉積物[16-17]以及生物體[18]。甚至在極地和遠洋環(huán)境中,都有OPFRs檢出,說明OPFRs具有遠程運輸能力并在全球范圍內普遍存在[19-20]。
在所有的OPFRs中,含氯的TCPP和TDCPP疑似有致癌性[6],磷酸三丁酯 (Tri-n-butyl phosphate, TnBP)、TBEP和TCEP則對斑馬魚幼蟲具有神經毒性[21]。人類細胞系和斑馬魚的實驗表明,一些OPFRs (TDCPP、TPhP、TCrP) 具有內分泌干擾潛能并能夠影響性荷爾蒙平衡[22]。一些毒理學實驗表明OPFRs對斑馬魚胚胎具有心臟毒性[23]、發(fā)育毒性[24]以及生殖毒性[25]。500 μg/L TPhP的長期暴露對大型蚤具有發(fā)育以及生殖毒性[26]。有報道指出TDCPP暴露會損害人類角膜[27]。因此,環(huán)境中無處不在的OPFRs對人類健康是一大威脅。
已報道的OPFRs去除方法有光催化[28]、高級氧化工藝[29]、動物分解[30]和微生物降解[31]等多種。其中,生物修復具有極大的優(yōu)勢,高效、成本低、環(huán)境友好。目前,已報道的OPFRs降解菌不多,且多為混合菌群[31-37],單菌只有幾種,玫瑰桿菌屬[38]、鞘氨醇單胞菌和鞘脂菌屬[39-40]以及短短芽孢桿菌[41],表1列舉了部分已報道的混合菌群以及純菌,包括來源、可降解底物以及降解能力。表1列舉的7篇混合菌群降解OPFRs的報道中,只有3篇提到了具體的降解率,其中最高的為分離自美國污水處理廠的活性淤泥,28 h內能夠將20 mg/L的TPhP降解99.0%±24.3%[37];表1列舉了已報道的全部5株OPFRs降解菌,其中活性最高的是一株sp.,能夠在63 h內降解超過90%的TnBP (100 mg/L),并且是已報道的唯一一株能夠利用OPFRs作為唯一碳源生長的菌株[40];分離自日本的sp. TCM1和sp. TDK1能夠降解TDCPP和TCEP,作為唯一磷源,培養(yǎng)6 h能夠100%降解TCEP (5.7 mg/L) 和TDCPP (8.6 mg/L)[39]。目前已報道的OPFRs降解微生物不僅活性較低,亦缺乏對其降解能力的綜合評估,尤其是對環(huán)境變化的耐受能力。
表1 已報道的有機磷阻燃劑降解微生物
因此,本研究的主要目的是富集能夠高效降解OPFRs的微生物,并關注可能影響降解效率的環(huán)境因子。從北京某垃圾場滲濾液中富集到一個混合菌群YC-BJ1,能夠高效降解OPFRs,并對它的降解特性、底物譜以及物種組成進行了分析。
1.1.1 藥品和試劑
所有化學品均購自商業(yè)來源。表2列出了本研究中涉及的OPFRs。標準品TnBP (99.25%)、TBEP (93.0%)、TEHP(98.74%)、TCEP (98.73%)、TDCPP (95.44%)、TCPP (99.65%)、TCrP (98.6%) 和TPhP (98%) 購自Dr. Ehrenstorfer GmbH公司 (德國,奧格斯堡),溶于甲醇或者乙腈 (色譜純),配制成濃度為2×104mg/L的母液。
1.1.2 培養(yǎng)基
富集用培養(yǎng)基TEM配方:1.0 L無菌水中添加2.0 g (NH4)2SO4、1.5 g Na2HPO4·12H2O、1.5 g K2HPO4、0.2 g MgSO4·7H2O、0.01 g CaCl2和100 μL TES儲存液。TES儲存液包含F(xiàn)eSO4·7H2O (5 g/L)、ZnSO4·7H2O (2.2 g/L)、CuSO4·5H2O (0.3 g/L)、MnSO4·2H2O (14.3 g/L)、CoSO4·7H2O (1.2 g/L)、Na2MoO4·2H2O (0.2 g/L) 和Na2WO4·2H2O (2.3 g/L)。用NaOH或者HCl (2 mol/L) 調節(jié)培養(yǎng)基pH為7.2±0.2,或者其他需要的pH。所有培養(yǎng)基在121 ℃下高壓滅菌20 min。降解實驗中,在TEM培養(yǎng)基中添加OPFRs作為唯一碳源。
1.2.1 細胞生長檢測
使用紫外-可見分光光度計 (美國,馬薩諸塞州,賽默科技) 檢測600 nm下的光密度 (600),以此衡量細胞生長。
1.2.2 高效液相色譜
使用高效液相色譜儀 (美國,加州,安捷倫)檢測TPhP濃度,具體配置如下:C18柱 (Agilent Eclipse XDB, 5 μm, 4.6 mm×150 mm),二極管陣列檢測器,205 nm,進樣量10 μL,流動相 (乙腈和水9︰1),流速1 mL/min,柱溫25 ℃。因為TPhP的溶解度極低,所以在水相中加入等體積的乙腈,混勻,0.22 μm膜 (上海,安譜) 過濾后使用液相檢測。
表2 本研究中涉及的有機磷阻燃劑
1.2.3 氣相色譜
表2列舉的其余OPFRs則使用氣相色譜儀檢測,日本島津GC-2010系統(tǒng),配置如下,HP-5毛細管柱 (內徑0.25 mm,長度30 m,膜厚0.25 μm),火焰離子檢測器 (300 ℃),進樣量5 μL,載體N2,流速1.51 mL/min,柱溫以10 ℃/min的速度從160 ℃逐漸增加到280 ℃,并在280 ℃保持 4 min,檢測器的載氣為H2(40 mL/min) 和空氣 (400 mL/min)。水相中的OPFRs首先需要用等體積正己烷萃取到有機相,然后使用氣相檢測。
1.2.4 OPFRs降解菌的富集
從北京某垃圾處理廠采集滲透液,4 ℃儲存。在100 mL的錐形瓶中,加入30 mL的TEM培養(yǎng)基,添加20 mg/L的TPhP和5 mL水樣,30 ℃、180 r/min培養(yǎng)7 d,取1 mL該培養(yǎng)液,轉接到新鮮的TEM培養(yǎng)基中并添加40 mg/L的TPhP,相同條件下繼續(xù)培養(yǎng)7 d。如此重復5次,至TPhP的濃度增加至100 mg/L。為盡可能減少母液中溶劑的干擾,富集過程中交替使用溶于甲醇和乙腈的母液。經過35 d的富集和馴化,得到了一瓶培養(yǎng)液,根據(jù)它的來源命名YC-BJ1,儲存在4 ℃以備使用。在后續(xù)的降解實驗中,該富集培養(yǎng)液作為種子液,接種比例為1%。
將富集培養(yǎng)液1%接種到含有100 mg/L OPFRs的10 mL TEM培養(yǎng)基中,30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)4 d。每個處理組設3個重復,對照不接菌,并根據(jù)1.2.2和1.2.3描述的方法檢測底物濃度。因為色譜信號與OPFRs的濃度具有線性關系 (數(shù)據(jù)未列出),所以OPFRs的降解率根據(jù)對照和實驗組之間的色譜信號比率計算。
1.2.5 TPhP降解酶的細胞定位
檢測上清液和細胞提取液的降解能力。取1 mL培養(yǎng)5 d的富集培養(yǎng)液,12 000 r/min離心5 min,使用0.22 μm的膜過濾上清并于4 ℃保存,菌體重懸浮在1 mL新鮮的TEM培養(yǎng)基中,超聲破碎細胞至液體澄清,12 000 r/min離心5 min,此上清即為細胞提取液。在上清和細胞提取液中加入 20 mg/L TPhP,30 ℃、180 r/min振蕩培養(yǎng)12 h,對照為添加等量底物的新鮮TEM培養(yǎng)基。每組設3個重復。按1.2.2所述方法檢測底物濃度。
1.2.6 環(huán)境因子對TPhP降解的影響
為評估環(huán)境耐受性,檢測不同環(huán)境因子對TPhP (100 mg/L) 的降解影響,包括溫度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃)、pH (4、5、6、7、8、9、10、11、12) 和鹽度(0%、2%、4%、6%、8% g/mL NaCl添加)。培養(yǎng)4 d,每組設3個重復。按1.2.2所述方法檢測底物濃度。
1.2.7 高通量測序分析富集培養(yǎng)液菌落結構
使用TaKaRa總基因組提取試劑盒 (中國,大連,寶日醫(yī)生物技術) 提取混合菌群總DNA,共 3個重復,分開測序。擴增16S rRNA基因的可變保守區(qū)域 (V3+V4),構建雙端小片段文庫,通過Illumina HiSeq 2500高通量測序平臺測序。通過拼接 (UCHIME v4.2)、過濾 (Trimmomatic v0.33) 和嵌合體去除 (UCHIME v4.2),從原始下機雙端序列中獲得最終的有效序列。使用QIIME[42](version 1.8.0) 中的UCLUST聚類有效序列,以97%的相似性獲得運算分類單位 (Operational taxonomic units, OTUs)?;赟ilva (細菌分類數(shù)據(jù)庫) 對OTUs進行分類和注釋。使用Mothur (version v.1.30)軟件進行alpha多樣性分析。
將混合菌群YC-BJ1的16S rRNA基因多樣性分析數(shù)據(jù)上傳到NCBI數(shù)據(jù)庫,序列號為SRS4436212。
本研究從北京某垃圾處理廠滲透液中富集到一個混合菌群,根據(jù)環(huán)境樣品來源命名為YC-BJ1。降解研究發(fā)現(xiàn),混合菌群YC-BJ1能夠高效降解TPhP (100 mg/L),培養(yǎng)4 d的降解率高達99.55%,1 d內就有超過一半的TPhP被降解 (圖1)。
能夠降解TPhP的混合菌群已有報道。一個富集自加拿大的混合群落能夠利用TPhP作為唯一碳源生長,但沒有提到具體的降解率[31]。一個自然形成的混合微生物群落能夠在7 d內降解濃度高達91 mg/L的TPhP,降解率為93%±11%[32]。有報道稱活性淤泥能夠在28 h內將TPhP (20 mg/L) 完全礦化并釋放CO2,降解率高于60%[37]。與已報道的微生物群落相比,本研究中的混合菌群YC-BJ1顯然具有更高的TPhP降解活性,只需要4 d就能夠實現(xiàn)對100 mg/L TPhP的降解,降解率高于99%。
HPLC檢測底物TPhP的減少,以此比較上清和細胞提取液的酯酶活性。與細胞提取液相比,上清對TPhP幾乎沒有降解 (表3),表明混合菌群YC-BJ1中的TPhP水解酶并沒有釋放到細胞外。以往的研究發(fā)現(xiàn),TPhP水解酶既有胞外酶,又有胞內酶。sp. YS-57中的TPhP水解酶為胞外酶[38],而富集自加拿大的TPhP降解菌群中的水解酶則為胞內酶[31]。除了簡單的定位,關于TPhP水解酶需要更深入的研究,包括純化、催化動力學分析以及機理研究。
圖1 混合菌群YC-BJ1對TPhP (100 mg/L) 的降解
表3 混合菌群YC-BJ1中TPhP水解酶的定位
a: each value represents average (=3) ± STEDV.
為了評估混合菌群YC-BJ1的環(huán)境適應性,按前所述,在不同的條件下進行了一系列的降解實驗,包括pH (4、5、6、7、8、9、10、11、12)、溫度(15 ℃、20 ℃、25 ℃、30 ℃、35 ℃、40 ℃) 和鹽度 (0%、2%、4%、6%、8% g/mL NaCl添加)。結合菌株生長以及降解數(shù)據(jù),發(fā)現(xiàn)混合菌群YC-BJ1降解TPhP的最適條件為pH 7、25 ℃,無鹽添加。并且混合菌群YC-BJ1表現(xiàn)出了優(yōu)越的環(huán)境適應性,能夠在較寬的環(huán)境范圍內保持較高的TPhP降解活性,pH (5.0–12.0)、溫度(15–40 ℃) 和鹽度(0%– 4%) (圖2)。在上述環(huán)境范圍內,混合菌群YC-BJ1對TPhP的降解率均維持在40%以上,表現(xiàn)出極強的環(huán)境耐受能力,說明其具有廣泛的應用潛能。
除了降解率的直接比較,我們還對圖2的降解數(shù)據(jù)作了兩個維度的顯著性分析:1) 與未接種的對照作比較,在pH 4–12、溫度 (15–40 ℃) 和鹽度 (0%–6%) 的廣泛條件下,培養(yǎng)4 d后,混合菌群YC-BJ1對TPhP有顯著降解 (One-way ANOVA,≤0.05);2) 對同一環(huán)境因子下的數(shù)據(jù)進行組內比對,發(fā)現(xiàn)該實驗條件下,在pH 6–10區(qū)間內 (圖2A,“c”標注),15–30 ℃溫度區(qū)間內 (圖2B,“a”標注),0%–2%的鹽度范圍內 (圖2C,“a”標注),混合菌群YC-BJ1對TPhP的降解沒有顯著差異。顯著性分析表明,混合菌群YC-BJ1不僅能夠在廣泛的環(huán)境條件下降解TPhP,更能夠保持較高的降解效率。
pH、溫度以及鹽度對微生物降解具有極強的影響力[43],但是目前還沒有環(huán)境因子影響群落對TPhP降解的報道。最近發(fā)表的一篇文章分析了一個富集自海水的混合菌群SWO的環(huán)境適應性,該群落能夠在pH 4.0–9.0、溫度25–37 ℃和鹽度0%–10%范圍內降解多環(huán)芳烴[44]。與混合菌群SWO相比,除了鹽度,混合菌群YC-BJ1對溫度和pH都有更寬的耐受范圍,考慮到SWO富集自海水,而YC-BJ1則富集自垃圾場滲濾液,對鹽度的適應能力弱于菌群SWO。
圖2 環(huán)境因子對混合菌群YC-BJ1降解TPhP的影響
將混合菌群YC-BJ1接種到含有100 mg/L不同的OPFRs的TEM培養(yǎng)基中,培養(yǎng)4 d后檢測底物降解,降解率結果見圖3?;旌暇篩C-BJ1表現(xiàn)出明顯的底物特異和偏好,能夠高效降解芳基磷酸酯,對TPhP和TCrP的降解率均在90%以上,對含氯磷酸酯的降解效率較低,對TCEP和TDCPP的降解率在20%左右,除了TEHP (10%降解),幾乎不能降解任何的烷基磷酸酯。在本研究的實驗條件下,未檢測到混合菌群YC-BJ1對TnBP、TBEP和TCPP的顯著降解。因為該菌群是在單一底物TPhP的脅迫下富集的,所以對芳基磷酸酯表現(xiàn)出了較明顯的底物偏好。
圖3 混合菌群YC-BJ1對不同有機磷阻燃劑的降解
通過16S rRNA基因V3+V4區(qū)域高通量測序分析混和菌群YC-BJ1的群落結構,α多樣性指數(shù)見表4。所有樣品的OTUs覆蓋率都在0.999 9以上,結合稀釋曲線 (圖4A),說明測序結果能夠真實地反映樣品的群落結構。在菌屬水平上,混合菌群YC-BJ1由生絲微菌屬(38.80%)、金黃桿菌屬(17.57%) 和鞘氨醇盒菌屬(17.46%) 主導 (圖4B)。其余含量較多 (>4%) 的菌屬有產堿桿菌屬、、叢毛單胞菌屬以及無色桿菌屬。
目前已報道的OPFRs降解純菌不多。在有葡萄糖作為補充碳源時,菌株sp. YS-57能夠在3 d內將0.5 mg/L的TCrP和TPhP降解99%以上[38]。sp. TDK1和sp. TCM1能夠利用TPhP、TCrP、TCEP和TDCPP作為唯一磷源生長,培養(yǎng)6 h可以將20 μmol/L的TCEP和TDCPP完全降解,遺憾的是,文章中沒有提供對TCrP和TPhP的降解率數(shù)據(jù)[39]。一株能夠降解3 μmol/L的TPhP, 降解率為92.1%[41]。一株分離自廣西省的sp.能夠利用TnBP作為唯一碳源生長,培養(yǎng)63 h對100 mg/L底物的降解率能夠達到90%,同時也是目前已報道的唯一一株能夠將OPFRs作為唯一碳源的菌[40]。因此,混合菌群YC-BJ1中包含未見報道的OPFRs降解菌,這也是我們下一步的研究計劃,希望能夠從中分離到新的OPFRs的高效降解菌,進行單菌或者多菌協(xié)同降解試驗。
表4 混合菌群YC-BJ1的物種多樣性
圖4 混合菌群YC-BJ1的物種多樣性及其組成
從北京垃圾場滲濾液中富集到一個混合菌群YC-BJ1,能夠高效降解芳基有機磷阻燃劑,可以耐受廣泛的環(huán)境變化(15–40 ℃, pH 5.0–12.0, 0%–4%鹽度),在OPFRs降解機理的揭示和其污染環(huán)境的生物修復中具有巨大的潛能。本研究只使用HPLC和GC檢測了底物的減少,未來的研究需要借助質譜檢測降解中間產物并推測可能的降解通路,從混合菌群中分離純化OPFRs高效降解菌也是下一步的研究重點。
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Characterization and 16S rRNA gene-based metagenomic analysis of the organophosphorous flame retardants degrading consortium YC-BJ1
Junhuan Wang, Xianjun Li, Wei Wu, Shuanghu Fan, Yang Jia, Jiayi Wang, and Yanchun Yan
,100081,
As flame retardants, organophosphate is recognized as a global environmental contaminant because of its wide application. This contaminant is hardly degradable by hydrolysis in the environment due to its special physicochemical properties. Therefore, it is of urgent needs to study the microbial degradation of organophosphate. Through continuous enrichment, we isolated one bacterial consortium, named YC-BJ1, from leachate of waste treatment plant in Beijing. The bacterial consortium YC-BJ1 could efficiently degrade 99.8% of triphenyl phosphate (TPhP) and 91.9% of tricresyl phosphate (TCrP) with the concentration of 100 mg/L within 4 days. Besides aryl phosphates, it could degrade chloro-phosphates, tris(1,3-dichloroisopropyl) phosphate (TDCPP) and tris(2-chloroethyl) phosphate (TCEP) by 16.5% and 22.0% respectively. The degradation of the consortium on TPhP was optimized through a broad range of temperature (15–40 ℃), pH (5.0–12.0) and salinity (0%–4%). 16S rRNA gene-based metagenomic analysis revealed that(38.80%),(17.57%) and(17.46%) were the dominant genera of the consortium YC-BJ1. Compared with the reported organophosphorus flame retardants (OPFRs) degrading bacteria and microflora, the mixed microflora YC-BJ1 exhibited great advantages in degradation efficiency and environmental adaptability, demonstrating its wide application potential. The enrichment and isolation of highly efficient degrading flora can provide abundant microbial resources for the degradation of OPFRs and the bioremediation towards OPFRs-contaminated environments, and also lay a solid foundation for the exploration of its degradation mechanism.
organophosphorus flame retardants, triphenyl phosphate, biodegradation, bacterial consortium, 16S rRNA gene-based metagenomic analysis
May14, 2019;
July17, 2019
National Natural Science Foundation of China (Nos. 31540067, 21876201), Basic Research Fund of Chinese Academy of Agricultural Sciences (Nos. 1610042017001, 1610042018005, 1610042018006).
Yanchun Yan. Tel: +86-10-82109685; E-mail: yanyanchun@caas.cn
王俊歡, 李先軍, 吳巍, 等. 混合菌群YC-BJ1對有機磷阻燃劑的降解及16S rRNA基因多樣性分析. 生物工程學報, 2019, 35(11): 2050–2060.
Wang JH, Li XJ, Wu W, et al. Characterization and 16S rRNA gene-based metagenomic analysis of the organophosphorous flame retardants degrading consortium YC-BJ1. Chin J Biotech, 2019, 35(11): 2050–2060.
國家自然科學基金 (Nos. 31540067, 21876201),中國農業(yè)科學院基本科研業(yè)務費 (Nos. 1610042017001, 1610042018005, 1610042018006) 資助。
(本文責編 陳宏宇)