周子康，崔潔，許平，唐鴻志

綜 述

唐鴻志 上海交通大學(xué)生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院/微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室教授、博士生導(dǎo)師 (2014年破格晉升)。2012年12月–2013年12月美國麻省理工學(xué)院訪問學(xué)者。研究方向?yàn)榄h(huán)境微生物學(xué)。目前擔(dān)任中國微生物學(xué)會(huì)-環(huán)境微生物專業(yè)委員會(huì)委員兼秘書。中國生物工程學(xué)會(huì)-合成生物學(xué)專業(yè)委員會(huì) (籌) 委員。2016年獲得教育部自然科學(xué)一等獎(jiǎng) (排名第二)，2013年獲得“明治乳業(yè)生命科學(xué)獎(jiǎng)”。曾獲得國家自然科學(xué)基金-優(yōu)秀青年基金、上海市曙光學(xué)者、上海市青年科技啟明星、上海市教委“晨光”計(jì)劃、上海交通大學(xué)“晨星計(jì)劃”、首屆“仲英青年學(xué)者”，已于、、、、、、、、等期刊發(fā)表SCI論文80篇(第一/通訊作者45篇)。

細(xì)菌降解低分子量多環(huán)芳烴的研究進(jìn)展

周子康1,2，崔潔1,2，許平1,2，唐鴻志1,2

1 上海交通大學(xué) 生命科學(xué)技術(shù)學(xué)院 微生物代謝國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，上海 200240 2 上海交通大學(xué) 代謝與發(fā)育科學(xué)國際聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，上海 200240

具有“三致”效應(yīng)的多環(huán)芳烴污染造成了巨大的環(huán)境危害，威脅人類健康和生存。目前能夠降解低分子量多環(huán)芳烴的細(xì)菌已有廣泛的研究。細(xì)菌通過多層次的調(diào)控分析和適應(yīng)性進(jìn)化提高它們的降解能力。本文基于國內(nèi)外文獻(xiàn)調(diào)研，簡要總結(jié)了生物修復(fù)在低分子量多環(huán)芳烴降解領(lǐng)域的研究進(jìn)展。擬通過多層次的調(diào)控分析和適應(yīng)性進(jìn)化來產(chǎn)生多種分解代謝途徑，為生物降解能力強(qiáng)化的未來降解技術(shù)提供支撐。

多環(huán)芳烴，低分子量多環(huán)芳烴，生物修復(fù)，芴

多環(huán)芳烴PAHs (Polycyclic aromatic hydrocarbons)是指由兩個(gè)或兩個(gè)以上苯環(huán)以線狀、角狀或簇狀排列的碳?xì)浠衔?，大多來源于有機(jī)物的不完全燃燒或高溫裂解[1]。PAHs廣泛存在于石油、煤炭中，具有潛在的致畸性、致癌性和基因毒性，且毒性隨著苯環(huán)的增加而增加[2-3]，對(duì)環(huán)境、生物體以及人類都有極大的危害。由于多環(huán)芳烴類化合物具有極低的水溶性，在環(huán)境中很難消除，因此，PAHs被美國環(huán)保局和歐共體同時(shí)確定為優(yōu)先控制的污染物，并選定其中的16種多環(huán)芳烴類化合物作為環(huán)境污染的監(jiān)測(cè)對(duì)象[4](表1)。

微生物扮演著生態(tài)系統(tǒng)中最重要的分解者的角色，可產(chǎn)生多種多樣的復(fù)合酶系，催化復(fù)雜化合物的降解，其代謝多環(huán)芳烴的能力較強(qiáng)，代謝速率較高。因其能將污染物進(jìn)行完全礦化，具有相比物化方法更低的處理成本、更高的安全性、更好的環(huán)境包容性等潛在的優(yōu)點(diǎn)，微生物降解成為了有效解決PAHs污染物危害的最佳選擇[5-7]。

研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)菌可以通過代謝或共代謝的方式以PAHs為底物來滿足自身生長需求[8]。其中的低分子量多環(huán)芳烴 (Low molecular weight PAHs, LMW PAHs，2個(gè)或3個(gè)苯環(huán)組成) 相對(duì)于高分子量多環(huán)芳烴 (High molecular weight, HMW PAHs，4個(gè)及以上苯環(huán)組成) 較易揮發(fā)，水溶性較高，因此它們更容易生物降解[9]。在LMW PAHs中，萘、蒽和菲在整個(gè)環(huán)境中廣泛分布，并且被認(rèn)為是原型PAHs。它們的核心結(jié)構(gòu)骨架存在于許多致癌PAHs中，因此常用作檢測(cè)PAHs污染的標(biāo)志性化合物。它們還被用作模式PAHs，以確定高環(huán)芳烴的生物利用效率、生物降解潛力和環(huán)境中細(xì)菌降解速率等的影響因素[10]。同樣被用作模式PAHs的還有三環(huán)芳烴——芴，它是具有致癌性的化石燃料的主要成分。與咔唑、二苯并噻吩、二苯并呋喃、二苯并二噁英等具有一定的結(jié)構(gòu)關(guān)系，且同時(shí)具有芳香族和脂環(huán)族的化學(xué)結(jié)構(gòu)[11-13]。本文基于國內(nèi)外多環(huán)芳烴研究進(jìn)展，并結(jié)合筆者實(shí)驗(yàn)室多環(huán)芳烴降解的研究近況，總結(jié)了LMW PAHs，包括萘、蒽、菲、芴的多種細(xì)菌代謝途徑。

1 萘、菲、蒽的細(xì)菌分解代謝

萘 (Naphthalene) 是廣泛存在于環(huán)境中的雙環(huán)芳烴，早在1964年，Davies和Evans就報(bào)道了第一株能降解土壤中萘的假單胞菌[14]。研究發(fā)現(xiàn)萘的主要代謝途徑如圖1A所示。首先，在萘雙加氧酶(NDO) 的催化作用下，萘的苯環(huán)的1,2位引入氧分子，生成順式-(1R, 2S)-二羥基-1,2-二氫化萘 (順式-萘二氫二醇) (圖1A) 化合物A-Ⅱ)。該雙加氧酶系統(tǒng)由3種成分組成，即鐵氧還蛋白還原酶、鐵氧還蛋白以及由兩個(gè)不同的亞基α和β組成的鐵硫蛋白 (ISP)。電子傳遞是通過在鐵氧還蛋白還原酶中從NAD(P)H到FAD的單個(gè)雙電子轉(zhuǎn)移引發(fā)的，其產(chǎn)生完全還原形式的FAD。還原的FAD為鐵氧還蛋白的鐵硫簇 (2Fe-2S) 分別提供一個(gè)電子，這些電子最終轉(zhuǎn)移到ISP并用于其活性位點(diǎn)，以促進(jìn)氧分子的加成(圖2)。NDO的底物特異性已經(jīng)有了很詳細(xì)的研究[15]，其組分的三維結(jié)構(gòu)也已被鑒定[16]，Parales等[17]發(fā)現(xiàn)NDO催化結(jié)構(gòu)域中的Asp-205對(duì)其活性至關(guān)重要，晶體結(jié)構(gòu)顯示NDO的另一種底物吲哚會(huì)在單核鐵原子的附近被結(jié)合，這表明此殘基是氧的活化位點(diǎn)[18]。后續(xù)研究通過定點(diǎn)誘變以測(cè)定幾個(gè)活性位點(diǎn)殘基對(duì)于催化活性的關(guān)鍵性，發(fā)現(xiàn)Phe-352的取代會(huì)導(dǎo)致順式萘二氫二醇的形成，同時(shí)伴隨著立體化學(xué)結(jié)構(gòu)及聯(lián)苯和菲的氧化位點(diǎn)的改變[19]，此結(jié)果為NDO在其加氧酶組分中與底物的結(jié)合提供了良好的結(jié)構(gòu)模型。

表1 美國環(huán)保局認(rèn)定的16種優(yōu)先PAHs化合物

圖1 萘 (A)、菲 (B)、蒽 (C)的上游分解代謝途徑

圖2 萘雙加氧酶將萘初步氧化成順式-1,2-二羥基-1,2-二氫化萘

第二步反應(yīng)是在順式-萘二氫二醇脫氫酶的催化作用下，順式-萘二氫二醇脫氫形成1,2-二羥基萘 (圖1A，化合物A-Ⅲ)。1,2-二羥基萘通過1,2-二羥基萘雙加氧酶進(jìn)行復(fù)合，得到的環(huán)裂解產(chǎn)物自發(fā)地形成2-羥基-2-氫-色烯-2-羧酸 (圖1A)，化合物A-Ⅳ)。通過異構(gòu)酶和水楊酸酶-醛縮酶的酶促反應(yīng)生成水楊醛 (圖1A，化合物A-Ⅵ)，然后在水楊醛脫氫酶的催化作用下轉(zhuǎn)化為水楊酸 (圖1A，化合物A-Ⅶ)。水楊酸通過鄰苯二酚 (圖3，化合物A-Ⅱ) 或2，5-二羥基苯甲酸 (圖3，化合物B-Ⅱ)進(jìn)一步代謝為TCA循環(huán)中間體。

圖3 通過鄰苯二酚 (A) 和2,5-二羥基苯甲酸 (B)的萘的下游代謝途徑

菲 (Phenanthrene) 由3個(gè)苯環(huán)組成，常用作研究致癌PAHs代謝的模式化合物。在過去的60年中，已經(jīng)報(bào)道了許多革蘭氏陰性和陽性細(xì)菌降解菲的研究[20-23]，菲的主要代謝途徑如圖1B所示。參與萘轉(zhuǎn)化為水楊酸的酶可以通過類似的分解代謝反應(yīng)將菲降解為1-羥基-2-萘甲酸 (圖1A，化合物 B-Ⅶ)，其主要通過兩個(gè)途徑進(jìn)行進(jìn)一步代謝。一種分解代謝途徑涉及1-羥基-2-萘甲酸的羥基化，形成1,2-二羥基萘 (圖4A，化合物A-Ⅱ)，然后進(jìn)入萘降解途徑。在另一種代謝途徑中，1-羥基-2-萘甲酸的苯環(huán)被1-羥基-2-萘甲酸雙加氧酶直接裂解 (圖4B)。后通過酶促反應(yīng)生成鄰苯二甲酸酯 (圖4B，化合物B-Ⅳ)，其通過原兒茶酸酯 (圖4B，化合物 B-Ⅴ)進(jìn)一步代謝為TCA循環(huán)中間體。

相似地，蒽 (Anthracene) 的主要分解代謝途徑的第一步是通過在1,2位的初始氧化作用，蒽轉(zhuǎn)化為1,2-二羥基蒽 (圖1C，化合物C-Ⅲ)。然后通過1,2-二羥基蒽的間位裂解途徑，生成2-羥基-3-萘甲酸 (圖1C，化合物C-Ⅶ)，2-羥基-3-萘甲酸酯緊接著轉(zhuǎn)化為2,3-二羥基萘，其進(jìn)一步代謝為水楊酸鹽和鄰苯二酚。

圖4 通過1,2-二羥基萘 (A) 和鄰苯二甲酸酯 (B)的菲的下游代謝途徑

截至目前，已經(jīng)研究報(bào)道的可降解萘、蒽、菲的細(xì)菌超過200種，早在60年代就有研究，之后陸續(xù)在假單胞菌屬中發(fā)現(xiàn)很多代謝萘、蒽、菲的基因，例如銅綠假單胞菌中的基因簇[28]，惡臭假單胞菌中的基因簇[24-26]，sp中的基因簇[31]等，為萘、蒽、菲及更復(fù)雜的多環(huán)芳烴的降解研究提供了重要元器件和實(shí)踐基礎(chǔ)。

在基因簇中，是編碼萘、蒽、菲初始氧化作用的雙加氧酶的操縱子，分別編碼代謝途徑中的脫氫酶，二羥基萘、蒽、菲雙加氧酶，異構(gòu)酶，水合酶醛縮酶，以及水楊醛脫氫酶，最終代謝為水楊酸。在基因簇中，是編碼萘、蒽、菲初始氧化作用的雙加氧酶的操縱子，分別編碼途徑中剩余的酶。在基因簇中，是編碼萘、蒽、菲初始氧化作用的雙加氧酶的操縱子，分別編碼途徑中剩余的酶。具體的基因編碼情況如表2所示。

表3總結(jié)了包括以上3個(gè)降解菌株的更多降解PAHs菌株的生長底物特性以及參與其上游分解代謝途徑的酶對(duì)萘、菲和蒽的轉(zhuǎn)化能力。對(duì)于列出的大多數(shù)細(xì)菌，都可以利用萘和菲作為底物生長，然而，通過鄰苯二甲酸酯途徑的菲降解細(xì)菌 (例如，菌株AFK2和KP7) 不能以萘為唯一碳源進(jìn)行生長。

表2 假單胞菌中萘、蒽、菲上游降解基因簇

ND: indicates that the gene encoding the enzyme has not been detected.

表3 PAHs降解細(xì)菌的基因定位、生長底物特異性和酶底物特異性

a. Listed PAH-degrading bacteria; b. “n” means “not yet reported”; c. Nap, Phe and Ant represent naphthalene, phenanthrene and anthracene, respectively; “+” and “-” mean “growth” and “non-growth”, respectively; d. “+” means that a clone carrying a metabolic pathway enzyme-encoding gene can convert naphthalene to salicylic acid, convert phenanthrene to 1-hydroxy-2-naphthoic acid, or convert hydrazine to 2-hydroxy-3-naphthoic acid. “(+)” means that at least the initial double oxidative decomposition of each PAH compound was observed.

2 芴的降解

芴 (Fluorene) 是美國環(huán)保局確定的16種優(yōu)先處理的污染物之一，存在于汽車廢氣、玉米須以及煤焦油的高沸點(diǎn)組分中，有類似于萘的特征性芳香氣味。2017年10月27日世界衛(wèi)生組織國際癌癥研究機(jī)構(gòu)公布的致癌物清單中，芴被列入3類致癌物。經(jīng)過多年的研究，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了不少可以利用芴作為唯一底物的菌株[10,42-45]，芴的3種主要代謝途徑如圖6所示。其中兩種途徑分別是通過1,2位 (圖5A)和3,4-位 (圖5B) 的雙氧化作用開始的，生成相應(yīng)的順式-二氫二醇 (圖4，化合物A-Ⅱ，化合物B-Ⅱ)，緊接著發(fā)生脫氫反應(yīng)，然后進(jìn)行間位裂解。在醛縮酶反應(yīng)和環(huán)狀產(chǎn)物脫羧反應(yīng)后，得到的茚酮是Baeyer-Villiger反應(yīng)的底物，經(jīng)反應(yīng)后分別得到芳香內(nèi)酯3-異色酮和3,4-二氫香豆素 (化合物A-Ⅵ和B-Ⅵ)。3,4-二氫香豆素可通過酶促水解產(chǎn)生3-(2-羥基苯基) 丙酸 (化合物B-Ⅶ)，其可進(jìn)一步代謝為水楊酸。第三種途徑 (圖5C) 通過在C-9位置的單氧化作用引發(fā)，得到9-芴醇，然后通過脫氫反應(yīng)生成9-芴酮。9-芴酮在角二氧化作用下生成1,1a-二羥基-1-氫-9-芴酮 (化合物C-Ⅳ)，接下來發(fā)生五元環(huán)的裂解生成2,3-二羥基聯(lián)苯的2′-羧基衍生物，其通過類似于聯(lián)苯降解的反應(yīng)進(jìn)行分解代謝，導(dǎo)致鄰苯二甲酸的形成，然后通過3,4-二羥基苯甲酸的產(chǎn)生代謝鄰苯二甲酸。

圖5 芴的分解代謝途徑

盡管已經(jīng)分離和表征了許多降解芴的細(xì)菌，但是關(guān)于芴的分解代謝中涉及的特定酶，特別是編碼這些酶的基因，還需要更深入的研究。本文以地桿菌sp為例，對(duì)芴降解的基因簇加以介紹。該基因簇由、、、和組成，其中編碼芳環(huán)雙加氧酶，均編碼短鏈的還原脫氫酶，編碼二羥基雙加氧酶，編碼meta-cleavage水解酶，在以上酶系的作用下將芴分解為鄰苯二甲酸 (圖6)。

近期，筆者實(shí)驗(yàn)室同仁從上海老港垃圾填埋場分離到一株以芴為唯一碳源的SMT-1菌株[46]，經(jīng)16S rDNA基因序列分析鑒定為假單胞菌。該菌株在含0.4 mm芴的無機(jī)鹽培養(yǎng)基中，以30 ℃、pH 7.0和200 r/min條件下生長和降解活性最高。此外，菌株SMT-1在連續(xù)6 d內(nèi)降解不同多環(huán)芳烴的比較結(jié)果，芴為85%，菲為48.4%，二苯并呋喃 (DBF)為47.5%，熒蒽為29.1%。這些降解特性表明，菌株SMT-1在芴降解中具有良好的降解效果，并有一定的底物適應(yīng)范圍?；蚪M信息的初步分析揭示了該菌株中可能存在參與芳香化合物代謝的重要基因。

圖6 芴的分解代謝基因簇

二苯并呋喃的降解也是環(huán)境治理領(lǐng)域的熱點(diǎn)問題之一。本實(shí)驗(yàn)室Fawad Ali等[47]分離鑒定了一株具有高DBF降解活性的銅綠假單胞菌FA-HZ1。該菌株降解中間產(chǎn)物的鑒定表明，其通過利用橫向脫氧和間裂途徑降解DBF (圖7)。一種新型雙加氧酶——HZ6359可將DBF轉(zhuǎn)化為1,2-二羥基-1,2-二氫二苯并呋喃。銅綠假單胞菌對(duì)DBF的降解作用在以往的研究中尚未見報(bào)道，該研究首次明確了銅綠假單胞菌對(duì)DBF的降解能力。此外，菌株FA-HZ1還可以利用DBF以外的其他碳源，其針對(duì)多底物的廣泛降解活性對(duì)環(huán)境生物修復(fù)具有重要意義。

與降解途徑相比，低分子量PAHs的分解代謝途徑的調(diào)控機(jī)制的研究也至關(guān)重要。研究者就調(diào)節(jié)過程中的分子伴侶、觸發(fā)途徑表達(dá)的信號(hào)以及激活和抑制表達(dá)的確切機(jī)制等進(jìn)行了深入的研究，很快發(fā)現(xiàn)了大量多樣的調(diào)節(jié)系統(tǒng)用于介導(dǎo)分解代謝途徑的表達(dá)[48]。例如LysR型轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子家族 (LTTR)[49-50]，該家族包含不同菌屬的100多個(gè)成員。其中CatR控制惡臭假單胞菌中鄰苯二酚代謝的表達(dá)[51]，TfdR (和/或其相同的雙TfdS) 也調(diào)節(jié)編碼氯代鄰苯二酚代謝的操縱子 (即基因)。NahR蛋白是萘降解調(diào)控中的主要調(diào)節(jié)因子，通過控制萘對(duì)水楊酸和丙酮酸代謝所需的操縱子和操縱子的表達(dá)起作用，編碼水楊酸酶，兩個(gè)操縱子都存在于質(zhì)粒NAH7上[52-53]。經(jīng)過20多年的研究，我們理解了不同調(diào)控蛋白在介導(dǎo)轉(zhuǎn)錄過程中的行為，但對(duì)于調(diào)節(jié)蛋白和效應(yīng)化合物之間的相互作用、結(jié)合位點(diǎn)、信號(hào)傳導(dǎo)等方面的內(nèi)容還知之甚少，仍需要進(jìn)一步探索。

圖7 推測(cè)出的菌株FA-HZ1代謝DBF的降解途徑

3 總結(jié)與展望

為了探求更高效的PAHs降解途徑，減輕其對(duì)環(huán)境的危害，生態(tài)友好地進(jìn)行生物修復(fù)，需要在分子水平更深入地了解細(xì)菌降解代謝PAHs的全過程。經(jīng)過幾十年的深入研究，已報(bào)道的可降解二環(huán)或三環(huán)組成的PAHs的分解代謝基因的數(shù)量已經(jīng)大大增加。然而，在LMW PAHs中，芴和氘代苊等的降解涉及的分解代謝基因還需要更積極地探索，可降解由4個(gè)及以上苯環(huán)組成的PAHs基因的獲取還很有限，由于PAHs的毒性和致癌性，更突顯了這些研究的急迫性和重要性。同時(shí)，低分子量PAHs關(guān)鍵代謝酶的研究可以為實(shí)現(xiàn)改造人工酶進(jìn)而實(shí)現(xiàn)高分子量PAHs降解提供理論基礎(chǔ)。因此，不僅要深入了解這些基因和關(guān)鍵酶的功能，還要對(duì)PAHs的代謝或共代謝途徑有全面的認(rèn)識(shí)，基于此可構(gòu)建用于監(jiān)測(cè)污染環(huán)境中降解物的基因探針，進(jìn)一步促進(jìn)生物修復(fù)的發(fā)展。此外，考慮到環(huán)境中污染物的復(fù)雜程度，我們需要進(jìn)一步研究除萘、菲、蒽、芴以外的PAHs的降解。通常認(rèn)為，高環(huán)PAHs開環(huán)降解過程會(huì)進(jìn)入低環(huán)途徑，因此，低分子量PAHs的降解途徑對(duì)最終修復(fù)環(huán)境中所有PAHs的污染至關(guān)重要。最近，基于PCR的方法，已經(jīng)報(bào)道了許多新的可部分分解代謝PAHs的基因，這些結(jié)果表明環(huán)境中PAHs降解細(xì)菌的多樣性，并且可能仍有許多未鑒定出的PAHs降解細(xì)菌，包括不可培養(yǎng)的細(xì)菌。積累這些信息對(duì)于監(jiān)測(cè)PAHs污染土壤中不同PAHs分解代謝基因型的有效性是必要的，并有助于PAHs的有效生物修復(fù)。這是我們相關(guān)研究的最終目標(biāo)，相信這一目標(biāo)將在廣大科研工作者的共同努力下實(shí)現(xiàn)。

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Progress in biodegradation of low molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons

Zikang Zhou1,2, Jie Cui1,2, Ping Xu1,2and Hongzhi Tang1,2

1 State Key Laboratory of Microbial Metabolism, and School of Life Sciences & Biotechnology, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China 2 Joint International Research Laboratory of Metabolic & Developmental Sciences, Shanghai Jiao Tong University, Shanghai 200240, China

Polycyclic aromatic hydrocarbons (PAHs) cause enormous environmental hazards that threaten human health. Bacterial degradation of PAHs has been extensively studied. Bacteria enhanced their biodegradability through multiple levels of regulatory analysis and adaptive evolution to produce diverse catabolic pathways. Based on recent developments, we address here the research progress in bioremediation technology to degrade low molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons.

PAHs, low molecular weight PAHs, bioremediation, fluorene

June17, 2019;

October11, 2019

Science and Technology Commission of Shanghai Municipality (No. 17JC1403300), The “Dawn” Program of Shanghai Education Commission (No. 17SG09), National Key Research and Development Program of China (No. 2018YFA0901200).

Hongzhi Tang. Tel: +86-21-34204066; E-mail: tangzhihong@sjtu.edu.cn

周子康, 崔潔, 許平, 等. 細(xì)菌降解低分子量多環(huán)芳烴的研究進(jìn)展. 生物工程學(xué)報(bào), 2019, 35(11): 2069–2080.

Zhou ZK, Cui J, Xu P, et al. Progress in biodegradation of low molecular weight polycyclic aromatic hydrocarbons. Chin J Biotech, 2019, 35(11): 2069–2080.

上海市2017年度“創(chuàng)新行動(dòng)計(jì)劃”基礎(chǔ)研究重點(diǎn)項(xiàng)目 (No. 17JC1403300)，上海市曙光計(jì)劃 (No. 17SG09)，國家重點(diǎn)研發(fā)計(jì)劃 (No. 2018YFA0901200) 資助。

(本文責(zé)編 郝麗芳)