盛怡，李慧敏，伍賢軍,2*，楊紅，朱詠莉,2*，李萍萍,2

（1. 南京林業(yè)大學生物與環(huán)境學院，江蘇 南京 210037；2. 南京林業(yè)大學江蘇省南方現(xiàn)代林業(yè)協(xié)同創(chuàng)新中心，江蘇 南京 210037）

螺旋藻（Spirulina）屬于藍細菌，被廣泛認為是一種理想的保健食品。除了含有多種礦物質(zhì)、類胡蘿卜素和其他天然色素，還是維生素B12最豐富的食物來源[1]。在它包含的色素類蛋白中，藻藍蛋白（Phycocyanin，C-PC）由于具有較強的抗氧化和清除自由基的能力而受到廣泛的重視[2-4]，在抗癌、抗病毒、調(diào)節(jié)免疫，以及對哺乳動物的無毒性[5-7]等方面作用顯著。但目前藻藍蛋白提取工藝復雜，使其應用受到了很大的限制。隨著對藻藍蛋白生物合成機制的解析，采用基因工程技術在大腸桿菌中對其進行重組合成是一種更好的選擇。已經(jīng)證實，這種重組藻藍蛋白和天然藻藍蛋白的物理化學性質(zhì)類似，且展現(xiàn)出很好的抗氧化活性[8-12]。不過，重組藻藍蛋白的生產(chǎn)一般都需要裂合酶的催化[13-14]，因此對藻藍蛋白裂合酶及其催化機理的研究在異源合成藻藍蛋白中至關重要。

研究表明，藻藍蛋白具有α和β兩個亞基[15]；藻藍蛋白裂合酶共有CpcE/CpcF型（E/F型）、CpcT型（T型）和CpcS型（S型）3個家族[16-18]。裂合酶CpcE/F催化藻藍色素（PCB）共價偶聯(lián)α亞基（CpcA）[19]，裂合酶CpcS催化PCB共價偶聯(lián)β亞基（CpcB）[20]，其中PCB是以血紅素為底物，通過血紅素氧化酶（HO1）和膽綠素還原酶（PcyA）催化而產(chǎn)生[21]。并且研究發(fā)現(xiàn)，在S型裂合酶中，有些需要和另一種裂合酶CpcU共同形成異源二聚體發(fā)揮催化功能，如Synechocystissp. PCC6803的S型裂合酶，稱為CpcS-I亞型；但是有些單獨的CpcS即可發(fā)揮催化功能，如Nostocsp. PCC7120的S型裂合酶，稱為CpcS-III亞型；而CpcS-II只存在海洋聚球藻中，和CpcU-II共同發(fā)揮催化作用[22]?？梢姴煌愋偷牧押厦?，其催化機理存在差異。在常用于培養(yǎng)的螺旋藻中，鹽澤螺旋藻蛋白總量最高，并且對鹽分和濕度的適應范圍也最廣[23]，但目前對鹽澤螺旋藻藻藍蛋白裂合酶的功能機制方面的研究卻少有涉及。在本課題組前期的研究中，利用魚腥藻中的CpcS裂合酶催化鹽澤螺旋藻藻藍蛋白β亞基的生物合成[24]，發(fā)現(xiàn)盡管不同來源的藻藍蛋白裂合酶表現(xiàn)出相似的催化功能，但其在結構上的差異可能會導致催化效率的不同。因此，對重組鹽澤螺旋藻CpcS裂合酶催化功能的研究不但有可能改善催化酶的效率、提高重組藻藍蛋白的產(chǎn)量，也將有助于明確鹽澤螺旋藻CpcS的分類屬性以及探明裂合酶CpcS的催化機理。

在前期成功構建鹽澤螺旋藻藻藍蛋白β亞基脫輔基蛋白和色素合成酶表達質(zhì)粒pETDuet-SscpcBSsho1::SspcyA的基礎上[24]，本研究通過PCR技術，克隆鹽澤螺旋藻藻藍蛋白裂合酶編碼基因SscpcS，并與表達質(zhì)粒pETDuet-SscpcB-Ssho1::SspcyA在大腸桿菌體內(nèi)進行共表達，合成藻藍蛋白CpcB-PCB。該研究可為鹽澤螺旋藻藻藍蛋白重組合成及抗氧化試劑的研制奠定基礎，也為探明鹽澤螺旋藻裂合酶CpcS的催化機理提供科學依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

鹽澤螺旋藻Spirulina subsalsaFACHB351購自中科院水生生物研究所。克隆菌株Escherichia coliDH5α、表達菌株Escherichia coliBL21（DE3）、藻藍蛋白β亞基脫輔基蛋白和色素合成酶表達質(zhì)粒pETDuet-SscpcB-Ssho1::SspcyA為本實驗室保存，其中SscpcB、Ssho1、SspcyA均來自于Spirulina subsalsaFACHB351。表達載體pCDFDuet-1購自Novagen公司；限制性內(nèi)切酶BglⅡ、XhoⅠ和T4 DNA連接酶及相應的緩沖液為賽默飛世爾科技公司產(chǎn)品；質(zhì)粒小提試劑盒、DNA純化回收試劑盒、Pfu DNA Polymerase、dNTPs和反應緩沖液為天根生物科技公司產(chǎn)品；氨芐西林、氯霉素為BIOSHARP公司產(chǎn)品，鏈霉素、卡那霉素為南京生興生物技術公司產(chǎn)品；1000 bp DNA ladder、Protein marker為SMOBIO公司產(chǎn)品；異丙基硫代半乳糖苷（Isopropyl β-DThiogalactoside，IPTG）為北京博奧拓達科技公司產(chǎn)品；Ni-NTA Agarose為GE Healthcare公司產(chǎn)品。引物合成和基因測序由南京金斯瑞生物科技公司完成。

1.2 引物設計與分子克隆

藍細菌基因組DNA的提取參照郝敏等[25]的方法。利用聚合酶鏈式反應（PCR）的方法從鹽澤螺旋藻Spirulina subsalsaFACHB351基因組DNA中擴增得到裂合酶編碼基因SscpcS。由于S. subsalsaFACHB351的CpcS序列沒有報道，故其引物設計的基因序列參照已報道的S. subsalsaPCC9445基因組序列，從NCBI GenBank數(shù)據(jù)庫中獲?。ˋccession No. WP_017305822）。擴增SscpcS上游引物為 5’-GCG AGA TCT GAT GGA CGG TTT AAC ATT TTT TGA G- 3’，下游引物為 5’-CCT CTC GAG TTA CCA ACC ACT AAC AGC ATA AAG- 3’。其中，上游引物設計酶切位點為BglⅡ、下游引物設計酶切位點為XhoⅠ。PCR反應體系為50 μL，包含有0.2 μmol/L的引物，10 ng的DNA模板，0.25 mmol/L的dNTPs，1×PCR反應緩沖液，2U快速Pfu DNA聚合酶（天根公司，北京）。PCR反應程序設置為：94 ℃預變性 3 min，94 ℃變性 30 s，58 ℃退火 30 s，72 ℃延伸1 min，退火溫度從58～52 ℃，每個溫度循環(huán)一次，然后以52 ℃循環(huán)30次，72 ℃延伸5 min。PCR擴增后的目的基因經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳檢測后，送至南京金斯瑞公司測序。擴增產(chǎn)物SscpcS片段和表達載體pCDFDuet-1經(jīng)限制性核酸內(nèi)切酶BglⅡ和XhoⅠ雙酶切，再經(jīng)TAE瓊脂糖凝膠電泳純化回收后，在T4連接酶的作用下16 ℃過夜連接，連接產(chǎn)物pCDFDuet-SscpcS轉(zhuǎn)入Escherichia coliDH5α感受態(tài)細胞，37 ℃條件下在含有鏈霉素（25 μg/mL）的LB瓊脂平板上過夜培養(yǎng)，挑選獨立的單菌落接種于含有鏈霉素（25 μg/mL）的LB液體培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)后利用質(zhì)粒小提試劑盒提取質(zhì)粒，質(zhì)粒通過限制性內(nèi)切酶BglⅡ和XhoⅠ雙酶切后，經(jīng)DNA凝膠電泳檢測。

1.3 蛋白的表達與純化

用CaCl2法將質(zhì)粒pCDFDuet-SscpcS轉(zhuǎn)入大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞，通過鏈霉素（25 μg/mL）在LB固體培養(yǎng)基上篩選轉(zhuǎn)化子。挑取陽性單克隆到含有鏈霉素（25 μg/mL）的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)至OD600為0.6左右，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，在16 ℃和搖床150 rpm條件下避光誘導表達12 h，離心棄上清液，收集細胞，并用二次蒸餾水重懸清洗兩次，-20 ℃保存細胞沉淀物備用。

為將構建的質(zhì)粒pCDFDuet-SscpcS和課題組已構建的表達質(zhì)粒pETDuet-SscpcBSp-Ssho1::SspcyA重組共表達以合成熒光藻藍蛋白，用CaCl2法將兩種質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)入到大腸桿菌BL21（DE3）感受態(tài)細胞中，進行體內(nèi)重組，用氨芐青霉素（10 μg/mL）和鏈霉素（25 μg/mL）篩選轉(zhuǎn)化子，挑取固體培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化子菌落。并用單獨包含pETDuet-SscpcBSsho1::SspcyA的大腸桿菌BL21（DE3）作為對照，挑取固體培養(yǎng)基上的轉(zhuǎn)化子菌落，分別接種于含有相應抗生素的5 mL LB液體培養(yǎng)基中，37 ℃條件下過夜培養(yǎng)后轉(zhuǎn)接到200 mL TB培養(yǎng)基中，37 ℃條件下培養(yǎng)至OD600為0.6，冰浴30 min使細菌停止生長，加入終濃度為1 mmol/L的IPTG，16 ℃避光條件下150 rpm搖床誘導表達12 h。轉(zhuǎn)速6 500 rpm離心收集細胞，二次蒸餾水重懸清洗兩次，保存離心收集的細胞用作檢測細胞熒光或超聲破碎提取重組蛋白。

為純化重組蛋白，向收集的PCB-CpcB細胞中分別加入8 mL預冷的Start buffer緩沖液（20 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，500 mmol/L NaCl, pH 7.2），使細胞產(chǎn)物重懸于緩沖液中，并在冰浴條件下進行超聲破碎細胞。破碎后的細胞液在4 ℃條件下12 000 rpm離心40 min，收集上清液。由于使用的表達載體帶有組氨酸His-tag標記，重組蛋白能與親和層介質(zhì)結合，因此采用鎳離子親和層析柱對上清液進行純化，純化后的色素蛋白于KPB緩沖液（50 mmol/L KH2PO4-K2HPO4，500 mmol/L NaCl，pH 7.2）中透析。

1.4 SDS-PAGE電泳和色素蛋白鋅電泳

利用實驗方法1.3保存的pCDFDuet-SscpcS細胞產(chǎn)物制備蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳樣品。首先取適量菌液，離心后加入45 μL 1×SDS樣品緩沖液和5 μL β-巰基乙醇，在 100 ℃沸水中水浴 5 min，再離心去沉淀，獲得的上清液作為蛋白質(zhì)樣品，進行SDS-PAGE電泳實驗。電泳完成后，進行考馬斯亮藍染色，再用脫色液脫色至電泳膠上出現(xiàn)清晰的條帶，凝膠成像儀（Geno-Sens 1850，上海勤翔）成像后拍照保存。

利用實驗方法1.3純化后的重組色素蛋白PCBCpcB制備蛋白質(zhì)SDS-PAGE電泳樣品，同時制備沒有裂合酶SsCpcS參與的重組產(chǎn)物純化后蛋白質(zhì)樣品作為對照組。50 μL純化后的蛋白樣品中加入45 μL 2×SDS 樣品緩沖液和 5 μL β-巰基乙醇，混合均勻后，100 ℃沸水中水浴5 min，離心去除沉淀的上清液即為蛋白質(zhì)樣品，進行SDS-PAGE電泳實驗。電泳完成后，先用1.5 mol/L 醋酸鋅溶液浸泡電泳膠15 min，放入凝膠成像儀中用280 nm紫外光照射電泳膠檢測。檢測完熒光條帶后，經(jīng)過考馬斯亮藍染色和脫色液脫色，用凝膠成像儀成像，再拍照保存。

1.5 光譜分析

用Start buffer緩沖液重懸收集的細胞產(chǎn)物，檢測表達后大腸桿菌重組色素蛋白細胞產(chǎn)物的熒光發(fā)射光譜，并進一步檢測純化后重組色素蛋白的吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。吸收光譜用紫外可見光譜儀（Lambda 325，美國）測定，光譜掃描范圍200～800 nm，掃描速度960 nm/min，狹縫寬度1.0 nm；熒光發(fā)射光譜用熒光光譜儀（Perkin Elmer LS55，美國）分析，光譜掃描范圍300～800 nm，光譜掃描速度1200 nm/min，狹縫寬度10.0 nm。

2 結果與分析

2.1 裂合酶SsCpcS編碼基因的PCR擴增和質(zhì)粒構建

按照實驗方法1.2 PCR擴增裂合酶CpcS編碼基因SscpcS，然后將PCR產(chǎn)物插入表達載體pCDFDuet-1上，構建新的質(zhì)粒pCDFDuet-SscpcS。構建的質(zhì)粒經(jīng)過BglⅡ和XhoⅠ進行雙酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)DNA瓊脂糖凝膠電泳，在600 bp左右有明顯的目的基因SscpcS條帶（圖1），這與預測的588 bp基本一致，表明克隆正確。

圖1 pCDFDuet-SscpcS雙酶切電泳圖Fig. 1 Electrophoresis of double digested pCDFDuet-SscpcS

2.2 裂合酶SsCpcS序列分析

按照實驗方法1.2擴增得到裂合酶CpcS編碼基因SscpcS。其基因序列和蛋白質(zhì)的氨基酸序列結果（圖2）表明，該蛋白質(zhì)共有196個氨基酸。進一步對裂合酶SsCpcS和其他藍藻的裂合酶CpcS進行氨基酸序列聚類分析（圖3），發(fā)現(xiàn)SsCpcS與來自Nostoc sp. PCC 7120中的NCpcS相隔較遠，而與Synechocystis sp. PCC6803中的YCpcS具有較高的同源性。由于YCpcS已被證實是CpcS-I型裂合酶[26]，因此推斷SsCpcS也應該是CpcS-I型。為了進一步確認這一推斷，將SsCpcS氨基酸序列與藍藻裂合酶數(shù)據(jù)庫（http://cyanolyase.genouest.org/）中的氨基酸序列進行比對，結果證實SsCpcS確實為CpcS-I型裂合酶。

2.3 裂合酶SsCpcS的表達

為確定表達產(chǎn)物，將質(zhì)粒pCDFDuet-SscpcS轉(zhuǎn)入到表達菌株Escherichia coliBL21（DE3）。按照實驗方法1.3在大腸桿菌體內(nèi)通過IPTG誘導表達裂合酶SsCpcS。表達產(chǎn)物按照實驗方法1.4制備蛋白質(zhì)電泳樣品，進行SDS-PAGE蛋白質(zhì)凝膠電泳。結果顯示，在25 kDa左右有一明顯條帶，這與根據(jù)氨基酸序列（圖2）大概推算出的蛋白質(zhì)分子量大小基本一致；并且對照組在同一位置沒有出現(xiàn)相同大小的條帶（圖4），這表明構建的質(zhì)粒能夠正確表達裂合酶SsCpcS。

圖2 SsCpcS編碼基因及氨基酸序列Fig. 2 The nucleotide and amino acid sequences of SsCpcS

2.4 裂合酶SsCpcS的功能

為研究裂合酶SsCpcS的催化功能，按照實驗方法1.3，將SsCpcS表達質(zhì)粒pCDFDuet-SscpcS與課題組已成功構建的鹽澤螺旋藻藻藍蛋白β亞基脫輔基蛋白和色素合成氧化還原酶的表達質(zhì)粒pETDuet-SscpcB-Ssho1::SspcyA在大腸桿菌中進行重組共表達，收集重組細胞。結果顯示，含有pCDFDuet-SscpcS的重組細胞具有深藍色（圖5A插圖b），采用熒光光譜儀檢測其熒光發(fā)射光譜，在580 nm激發(fā)光下，于640 nm處展現(xiàn)出最大熒光值（圖5A）；而不含pCDFDuet-SscpcS的對照組未表現(xiàn)出明顯顏色（圖5A插圖a），同樣在580 nm的激發(fā)光下，未展現(xiàn)出任何熒光發(fā)射峰（圖5A）。這些結果初步表明，裂合酶SsCpcS能夠催化熒光藻藍蛋白β亞基（PCB-CpcB）的生物合成。

圖3 藻膽蛋白裂合酶CpcS聚類分析Fig. 3 Cluster analysis of amino acid sequences for the phycocyanin lyase CpcS

圖4 pCDFDuet-SscpcS表達產(chǎn)物的蛋白質(zhì)電泳圖Fig. 4 SDS-PAGE electrophoretograms of pCDFDuet-SscpcS expression products

為進一步驗證裂合酶SsCpcS的催化功能，并判斷在大腸桿菌中合成的熒光藻藍蛋白β亞基（PCB-CpcB）的光譜特征，按照實驗方法1.3對重組表達產(chǎn)物進行純化，檢測其吸收光譜和熒光發(fā)射光譜。結果表明，純化后的色素蛋白PCB-CpcB分別在620 nm和646 nm處出現(xiàn)了最大吸收值和最大熒光發(fā)射值；而沒有裂合酶參與的對照組無吸收峰和熒光峰的出現(xiàn)（圖5C、5D）。這些特征與已報道的研究相似[24]。此外，熒光量子產(chǎn)率和摩爾消光系數(shù)也是檢驗生物合成色素蛋白的重要參數(shù)[27]，以天然C-PC蛋白吸收光譜和不同吸收值對應熒光光譜的熒光積分作為參照，利用測得的吸收和熒光發(fā)射數(shù)據(jù)，可以計算出重組色素蛋白PCB-CpcB的熒光量子產(chǎn)率為0.26；通過色素蛋白酸性尿素變性實驗，根據(jù)變性前后的吸光度之比計算出色素蛋白PCBCpcB 的摩爾消光系數(shù)為 5.63×104/（mol·cm）。這些結果都說明，在大腸桿菌中裂合酶SsCpcS催化合成了熒光藻藍蛋白β亞基。

為進一步確認藻藍蛋白β亞基脫輔基蛋白CpcB和藻藍色素PCB的共價偶聯(lián)，按照實驗方法1.4制備SDS-PAGE蛋白質(zhì)樣品，進行蛋白質(zhì)電泳實驗。電泳完成后（如圖5B所示），通過考馬斯亮藍進行染色，發(fā)現(xiàn)PCB-CpcB和無SsCpcS的對照組泳道在20 kDa左右均有明顯的條帶，這與CpcB理論值大小一致[28]，而誘導表達大腸桿菌BL21的細胞樣品在相應位置沒有條帶，這表明本實驗獲得了外源產(chǎn)物CpcB；采用醋酸鋅染色后再通過紫外光照射，發(fā)現(xiàn)在PCB-CpcB泳道的對應位置有明顯的熒光條帶，這表明在裂合酶SsCpcS的催化下，CpcB共價結合了藻藍色素PCB。

3 討論

螺旋藻是被廣泛使用的保健食品，其體內(nèi)的藻藍蛋白具有顯著的抗氧化作用和自由基清除能力[29]。由于從藍藻中直接提取藻藍蛋白工藝流程較為復雜，成本較高，故通過基因工程的大腸桿菌重組生產(chǎn)藻藍蛋白具有較大的優(yōu)勢[30]。研究表明，藻藍蛋白在大腸桿菌中的合成需要裂合酶的催化，如在來源于Arthrospira plantensisFACHB314裂合酶CpcS的催化作用下，藻藍蛋白β亞基脫輔基蛋白共價結合藻藍色素，合成熒光藻藍蛋白[20]。在本課題組前期的研究中[24]，鹽澤螺旋藻藻藍蛋白β亞基的脫輔基蛋白已被成功克隆并且展現(xiàn)出一定的抗氧化潛力，盡管結合色素的熒光β亞基已在異源的藻藍蛋白裂合酶作用下成功合成，但是同源的裂合酶可能具有更強的催化能力并增強色素結合率。有不少研究表明，色素結合率和藻藍蛋白的抗氧化活性具有較強的相關性[24]，重組藻藍蛋白抗氧化能力的強弱，不僅取決于其脫輔基蛋白，也與其輔基色素有很大關系，色素含量越高，其抗氧化能力越強[28]。

圖5 大腸桿菌重組產(chǎn)物的特征Fig. 5 characteristics of recombinant products extracted from Escherichia coli

因此，為了解同源的鹽澤螺旋藻藻藍蛋白裂合酶CpcS的功能，本研究從鹽澤螺旋藻中克隆其編碼基因SscpcS，利用其催化重組色素熒光蛋白展現(xiàn)其酶功能，即在大腸桿菌中成功催化鹽澤螺旋藻藻藍蛋白β亞基和藻藍色素的共價偶聯(lián)。產(chǎn)生的色素蛋白PCB-CpcB在646 nm和620 nm處展現(xiàn)出最大熒光發(fā)射值和最大吸收值，與已經(jīng)報道的來自Nostocsp. PCC 7120中NCpcS裂合酶催化產(chǎn)生的色素蛋白光譜特征結果[26]基本相似。這也表明與來自Nostocsp. PCC 7120中的NCpcS一樣，鹽澤螺旋藻中單獨的SsCpcS裂合酶即可催化藻藍蛋白β亞基脫輔基蛋白結合藻藍色素。

另一方面，通過對鹽澤螺旋藻裂合酶SsCpcS與其他藍藻裂合酶CpcS的氨基酸序列進化樹分析發(fā)現(xiàn)，SsCpcS為CpcS-I型裂合酶。一般認為，在藍藻中需要CpcU裂合酶的參與形成異源二聚體共同催化CpcB結合PCB。但是單獨的SsCpcS在體內(nèi)重組也表現(xiàn)出催化活性，這與已報道的YCpcS及SpCpcS （Spirulina platensisNIES-39）的表現(xiàn)相似[31,20]。這進一步表明單獨的裂合酶CpcS-I同樣具有催化活性，但在缺少裂合酶CpcU的情況下，其催化能力可能會亞于CpcS-III型（比如NCpcS），即可能使得藻藍蛋白的色素化程度不能進一步提高，但這有待于進一步的證實。下一步的研究可以通過克隆鹽澤螺旋藻裂合酶CpcU，在大腸桿菌中經(jīng)過與SsCpcS的協(xié)同作用，研究鹽澤螺旋藻藻藍蛋白的色素化程度，為提高藻藍蛋白抗氧化的潛力，開發(fā)高效的重組鹽澤螺旋藻藻藍蛋白抗氧化試劑奠定基礎。此外，還可以通過比較SsCpcS與NCpcS等其他裂合酶對相同藻藍蛋白生物合成的催化效率的差異，為進一步深入理解CpcS的催化機理，遴選催化能力更高的裂合酶為提高產(chǎn)量提供參考。

4 結論

從鹽澤螺旋藻S. subsalsaFACHB351基因組中通過PCR技術擴增出藻藍蛋白裂合酶編碼基因SscpcS，根據(jù)氨基酸序列聚類分析，SscpcS屬于CpcS-I型裂合酶，其通常與裂合酶CpcU組成異源二聚體進行催化作用，但單獨存在也具有催化功能，即能夠有效催化鹽澤螺旋藻藻藍蛋白β亞基和藻藍色素的共價偶聯(lián)，通過在大腸桿菌體內(nèi)重組合成藻藍蛋白PCB-CpcB，并展現(xiàn)出620 nm的最大吸收值和646 nm的最大熒光發(fā)射值，這些均表明本研究成功克隆源自鹽澤螺旋藻的藻藍蛋白裂合酶SsCpcS的編碼基因，并且其表達產(chǎn)物SsCpcS能有效催化藻藍蛋白的生物合成。因此，本研究可以為S.subsalsa藻藍蛋白重組合成及抗氧化試劑的研制奠定基礎，也為理解鹽澤螺旋藻中CpcS的催化機理提供參考。