遲 馨 王心悅 宋來慶 姜中武 杜曉云*

（1 煙臺大學生命科學學院，煙臺264005；2 山東省煙臺市農業(yè)科學研究院，煙臺265500）

蘋果中含有豐富的礦質元素和維生素，是生活中最常見和主要的水果之一。我國是世界上最大的蘋果生產國， 目前， 蘋果栽培面積227.23 萬hm2，產量4 400 萬t，接近世界總水平的50%。 但我國蘋果產業(yè)整體質量水平不高，優(yōu)果率較低。蘋果果皮的著色和果肉中糖酸含量是影響蘋果品質的主要因素，果實大小和顏色是決定蘋果收購價格的主要因素。因此，通過育種和栽培措施提高蘋果果實著色，是目前生產上亟需的技術措施。提高果實著色技術和色澤調控機制，是目前的研究熱點。前人研究結果表明，蘋果著色受花青苷、類胡蘿卜素等自身生理指標含量，和溫度、光照等外界環(huán)境多因素影響。本文系統(tǒng)總結了花青苷、葉綠素和類胡蘿卜素等生理指標，以及花青苷代謝、調控等相關的MYB 轉錄調控因子以及甲基化等分子因素對蘋果著色的影響，以期為后續(xù)蘋果果皮著色研究提供參考。

1 影響蘋果果皮著色的生理因素

蘋果的色澤發(fā)育是一項復雜的生理過程，影響蘋果果皮色澤的主要生理因素包括花青苷、葉綠色、類黃酮和類胡蘿卜素，這些化學物質本身含量以及相互之間的作用， 影響了蘋果果皮色澤。根據(jù)色澤將蘋果分類，可以分為紅色、黃色和綠色品種?；ㄇ嘬帐固O果的果皮表現(xiàn)出紅色， 葉綠素使蘋果果皮表現(xiàn)出綠色，類胡蘿卜素使蘋果果皮表現(xiàn)出黃色。在這幾種影響因子中， 花青苷對蘋果果皮色澤的影響作用最大。

1.1 花青苷蘋果果皮呈現(xiàn)的紅色與花青苷代謝密切相關?；ㄇ嘬盏暮铣膳c花青苷合成相關的結構基因及轉錄因子有關，花青苷的積累受溫度、光照、套袋等措施的影響。目前所知花青苷主要通過類黃酮的合成途徑生成，在合成過程中主要受2 種基因調控，一種是在編碼合成的過程中相關酶的結構，一種是在結構基因的表達過程中起調控作用的轉錄因子基因。研究結果表明，蘋果中的糖分為果皮中的花青苷提供了前體物質，著色期果皮中的花青苷含量和果實中可溶性糖含量呈極顯著正相關，和蘋果PAL 酶、CHI 酶、淀粉酶活性呈極顯著正相關。蘋果中淀粉酶、蔗糖酸性轉化酶活性的改變可以促進蘋果中糖的生成，從而促進花青苷的生成；同時，蘋果PAL 酶、CHI 酶含量的增加也可以促進花青苷的進一步累積。 套袋紅富士蘋果，在解袋后花青苷的生成和果實的內源激素含量關系密切，如乙烯可以控制下游基因MdLDOX 和MdUFGT 的表達， 從而影響蘋果成熟期花青苷的含量。脫落酸與S3307 對蘋果果皮花青苷含量以及果肉可溶性糖含量有明顯的促進作用。 外界環(huán)境也能影響花青苷的生物合成，不同的光照強度對蘋果果實花青苷的影響不同，當光照強度在40%～85%時，蘋果中花青苷的含量會隨著光照強度的增加而增加，于洪華等在著色調查的同時測定蘋果的花青苷含量也發(fā)現(xiàn)，蘋果果皮花青苷含量與著色面積的增長趨勢一致；紫外光是花青苷合成最佳的光質，藍光效果次之，白光幾乎沒有效果，遠紅光效果最差，甚至會抑制花青苷的合成。在生產實踐中，人們采用延長摘袋之后果實的光照時間、摘遮光葉、適當轉果以及鋪設反光膜等措施， 使蘋果果皮中的花青苷在解袋之后迅速積累， 從而促進蘋果果皮的全面著色。

1.2 葉綠素研究表明，富士蘋果套袋與不套袋兩種處理后，果皮中的葉綠素含量從6 月20日起呈上升趨勢，7 月20 日達到高峰，隨后開始下降（不同地區(qū)在時間上會有差異），套帶蘋果比不套袋蘋果下降速度快，葉綠素總含量不套袋蘋果較套袋高。套袋和不套袋蘋果葉綠素含量發(fā)生變化，原因在于蘋果袋阻擋了光照，從而使果皮中綠素分解黃化，而黃化之后的果皮組織光敏色素會比一般的組織高，果皮組織就會對光照反應更加敏感，從而促進花青苷的合成，當蘋果生長發(fā)育期花青苷的含量積累到一定水平后，葉綠素含量高時，蘋果呈現(xiàn)暗紅色，含量低時呈現(xiàn)鮮紅色，因此，生產中采用套袋技術，使其中的葉綠素含量顯著降低，從而使蘋果表現(xiàn)出鮮紅色。

1.3 類胡蘿卜素是使蘋果果皮呈現(xiàn)黃色的主要物質。實驗表明，蘋果套袋20 d 后類胡蘿卜素含量和葉綠素含量會持續(xù)下降，當花青苷開始合成時，類胡蘿卜素和葉綠素的含量達到最低，在解袋第1 d 到解袋第10 d 的總含量差異不大，未套袋的蘋果果皮中類胡蘿卜素的含量近乎恒定。同時，套袋與未套袋蘋果對比結果表明，套袋會抑制類胡蘿卜素的生成，加快果實中已有的葉綠素的分解，當蘋果解袋之后，在光照的作用下，花青苷含量增加較快，而類胡蘿卜素、葉綠素含量變化不明顯，使蘋果果皮沒有底色的干擾，從而顏色鮮艷。生產中可以根據(jù)需求采用不同的技術促進或抑制這幾類物質的產生來調節(jié)蘋果果皮的著色，套袋后的蘋果花青素含量是不套袋的1.3 倍。

2 影響蘋果果皮著色的分子因素

2.1 MYB 轉錄調控因子目前，在蘋果果皮著色研究中，發(fā)現(xiàn)的最多通過調控花青苷的合成從而影響著色的轉錄因子，主要包括MYB、bHLH(MYC)和WD40 三類，這3 類轉錄因子通過MYB-bHLH-WD40(MBW)復合體形式，來調控蘋果果皮中與花青苷合成相關的結構基因的轉錄，從而影響蘋果果皮的著色。 其中，MYB 轉錄因子是在植物體內廣泛存在的多基因家族，種類眾多，在植物中具有多種多樣的功能及作用，如植物的抗逆性、抗衰老以及生長發(fā)育等；bHLH 主要是充當橋梁的作用，同時還可以和MYB 互相作用。研究者通過全基因組分析確定了229 個與蘋果相關的MYB 基因，并將其分成45 個亞群，通過相關的基因組數(shù)據(jù)庫分析后，了解MYB 家族在蘋果中的概況。 在MYB 家族數(shù)百的種類中，目前被證明在蘋果果皮著色中產生作用的有MdMYB1、MdMYB10 和MdMYBA 等少數(shù)的幾類，在蘋果果皮花青苷的合成過程中起重要的調控作用。其中，MdMYB1 主要調控蘋果果皮中花青苷合成，MdMYB10 主要調控紅肉蘋果果肉中花青苷的合成， 且MdMYB1 啟動子的甲基化水平在套袋蘋果中有一個顯著的降低現(xiàn)象，表明對果皮著色具有一定的影響和調控。MdMYB1b與MdMYB1-1 是蘋果成熟期控制花青苷合成的主要基因，而MdMYB1a 則在蘋果幼果期花青苷的合成中發(fā)揮重要的作用。研究者還從蘋果中分離出能夠調控蘋果花青苷合成的關鍵轉錄因子MdMYB10， 發(fā)現(xiàn)MdMYB10的表達量可以誘導花青素的積累，從而與花青苷的合成密切相關， 同時Myc 家族中bHLH蛋白的研究表明，其也是調控花青素合成的重要轉錄因子，例如MdMYB10 與MdbHLH3 和MdbHLH33 的協(xié)同互在煙草中可促進花青苷的積累。其它轉錄因子，如NAC 和MADS box等也能夠調控花青苷的合成，進而影響果實著色。生產中運用套袋技術，在套袋期間降低了與蘋果果皮中花青苷合成相關的MdCHI、MdF3H、MdDFR、ANS、MdUFGT 等結構基因和MdMYB1、MdMYB10、MdbHLH3、MdbHLH33等調控基因的表達水平，來降低了花青苷合成過程中相關酶的活性，從而降低了花青苷的含量， 因而蘋果在袋內生長期花青苷的含量極少，蘋果幾乎不著色，蘋果成熟解袋之后，蘋果果皮中的花青苷迅速積累，蘋果迅速著色。

2.2 甲基化目前所知，DNA 的甲基化包括兩種，一種是從頭甲基化，即兩條鏈均被甲基化；另一種是維持甲基化，即DNA 雙鏈中的一條鏈被甲基化， 另一條未被甲基化。 研究表明，DNA 的甲基化對于維持植物的正常發(fā)育十分必要，DNA 的去甲基化容易引起植物的非正常發(fā)育， 甲基化在植物逆境脅迫中的作用也相繼被證實。 近幾年在分子研究領域興起的熱點， 表觀遺傳研究中最為熱衷的甲基化是指胞嘧啶C5 位上的甲基化修飾。蘋果基因中啟動子區(qū)域的甲基化程度能夠影響RNA聚合酶以及轉錄因子的結合， 從而促進轉錄的進行，影響基因的表達，從而影響花青苷的合成。未套袋蘋果和套袋蘋果解袋10 d 之后，果皮中MdMYB1 啟動子區(qū)段-2 026 bp～-1 870 bp都發(fā)生明顯的甲基化，且甲基化程度套袋低于未套袋， 表明MdMYB1 啟動子片段甲基化水平的降低導致了蘋果果皮的著色， 該片段在調控MdMYB1 啟動子過程中有著重要的作用。 此外， 研究發(fā)現(xiàn)對于不同色澤類型的蘋果，MdMYB1 啟動子上與果皮著色相關的關鍵甲基化修飾區(qū)段存在明顯的差異， 綠色品種蘋果解袋之后花青苷合成能力最弱，MdMYB10 的甲基化水平也顯著降低；黃色品種蘋果解袋之后花青苷合成能力較差， 實驗組的甲基化水平沒有顯著變化； 紅色蘋果解袋之后花青苷合成能力最強， 并且甲基化水平在不同的區(qū)段中表現(xiàn)出不同程度的顯著降低。錢敏杰也對不同材料上PpMYB10 基因啟動子區(qū)域的甲基化水平進行了相關數(shù)據(jù)分析，分析結果表明，紅色材料的甲基化水平明顯高于綠色材料， 這也證明甲基化水平對果實著色有一定的影響作用。目前，對于甲基化在蘋果果皮著色上的研究依然較少， 需要進一步的實驗論證。

3 討論與展望

現(xiàn)有研究結果表明，蘋果的著色主要受到花青苷的影響， 在蘋果的成熟期解袋之后蘋果果皮中的花青苷含量在短期間內迅速上升，大量積累的花青苷與葉綠素、類胡蘿卜素共同作用，使蘋果果皮呈現(xiàn)鮮紅色。而影響蘋果果皮中花青苷合成與積累的因素有很多，例如環(huán)境的影響，溫度、陽光等，生產中的套袋等技術就是利用溫度、 陽光等控制蘋果果皮中的花青苷含量， 當蘋果解袋之后， 在陽光、 溫度的影響下花青苷迅速積累， 蘋果短期內迅速上色。 葉綠素與類胡蘿卜素在使蘋果呈現(xiàn)綠色和黃色的過程中發(fā)揮同樣的作用，蘋果成熟期解袋之后，葉綠素和類胡蘿卜素的含量都持續(xù)下降， 當花青苷含量達到最高時，與花青苷共同作用，使蘋果表皮呈現(xiàn)鮮紅色。

在分子層次上，本文通過對相關文獻的分析總結發(fā)現(xiàn)，目前大部分的研究集中在已經發(fā)現(xiàn)能夠影響花青苷的合成轉錄因子MYB、bHLH(MYC) 和WD40 三類， 它們通過YBbHLH-WD40(MBW)復合體形式參與蘋果果皮中花青苷的合成，MdMYB10 與MdbHLH3 和MdbHLH33 協(xié)同表達有利于蘋果果皮中花青苷的積累，有利于蘋果果皮的著色。

對于近幾年的研究熱點分子甲基化，在其它物種上的研究已經很多。目前發(fā)現(xiàn)甲基化在相關植物抗逆性以及品質提升方面具有重要的作用，但在蘋果果皮著色中甲基化的作用及影響研究較少。目前的研究表明，花青苷的合成過程會受到相關調控基因的DNA 甲基化程度的影響，調控因子啟動子區(qū)域甲基化程度越高，相關的表達水平越低，甲基化在MYB 轉錄子中的作用機理，通過對轉錄子的影響來控制花青苷的合成?？傊?，隨著DNA 甲基化在各種植物中的作用以及在不同情況下發(fā)生的變化被相繼鑒定出來，DNA 甲基化的功能也將會被更多的利用在生產實踐中。