李泓文，聶大林

（蘇州賽譜儀器有限公司，江蘇 蘇州 215200）

0 引言

本次分析的對象是由北京衛(wèi)星制造廠在科技部重大專項(xiàng)《高精度超高壓液相泵的開發(fā)與應(yīng)用》（項(xiàng)目編號(hào)：2016YFF0101000）項(xiàng)目中研制的高精度超高壓液相泵（UHPLC-BSC-01型），使用該在研液相泵替代SCG蛋白純化系統(tǒng)中的輸液系統(tǒng)與原系統(tǒng)進(jìn)行梯度性能對比測試并分析結(jié)果。

1 系統(tǒng)介紹

SCG蛋白純化儀是由輸液系統(tǒng)、進(jìn)樣系統(tǒng)、分離系統(tǒng)、檢測系統(tǒng)、收集系統(tǒng)、數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)等部分組成的分析、制備儀器。輸液系統(tǒng)由泵、混合器、壓力傳感器組件等組成，是SCG蛋白純化儀的重要組成部分。輸液系統(tǒng)根據(jù)實(shí)際需求對儀器提供精準(zhǔn)的等度和梯度液相輸入。圖1是SCG蛋白純化儀及輸液系統(tǒng)組成方框圖。

賽譜儀器的SCG蛋白純化系統(tǒng)是液相色譜儀器（LC）中的一種，基本原理和HPLC類似，但需要配置pH及電導(dǎo)率檢測器，而且用途完全不同，所以系統(tǒng)與流動(dòng)相接觸的部分完全采用生物惰性材料。系統(tǒng)在低壓運(yùn)行時(shí)，有較低的脈動(dòng)，從而避免損壞層析柱。該系統(tǒng)支持獨(dú)立的樣品泵，最多支持10個(gè)通道的樣品選擇，11個(gè)通道的流動(dòng)相的選擇，5根層析柱的自動(dòng)選擇，以及10個(gè)通道的大體積收集和組份收集器收集。SCG軟件既能完全手動(dòng)操作儀器進(jìn)行蛋白純化工作，又能支持方法編輯及運(yùn)行，運(yùn)行客戶根據(jù)樣品信息編輯的一個(gè)或多個(gè)方法，對儀器的整個(gè)工作流程進(jìn)行全自動(dòng)運(yùn)行，系統(tǒng)能自動(dòng)完成方法的運(yùn)行并生成結(jié)果報(bào)告，實(shí)現(xiàn)蛋白的全自動(dòng)純化工作。

2 梯度洗脫

圖1 SCG蛋白純化儀及輸液系統(tǒng)組成方框圖Fig.1 The SCG protein purification instrument and the composition block diagram of the infusion system

進(jìn)行高效液相色譜分析時(shí)，常采用兩種洗脫方式，一種為等度洗脫（isocratic elution），另一種為梯度洗脫（gradient elution）[1]。

用等度洗脫進(jìn)行色譜分離，由不同溶劑構(gòu)成的流動(dòng)相所組成，如流動(dòng)相的極性，離子強(qiáng)度，pH等，在分離的全過程中皆保持不變。用梯度洗脫進(jìn)行色譜分離時(shí)，在洗脫過程中含兩種或兩種以上不同極性溶劑的流動(dòng)相組成，會(huì)連續(xù)或間歇地改變，期間可調(diào)節(jié)流動(dòng)相的極性，改善樣品中各組份間的分離度。梯度洗脫一般是指流動(dòng)相組成，隨分析時(shí)間的延長呈線性變化，即線性梯度洗脫[1]。

梯度系統(tǒng)可分為低壓梯度系統(tǒng)和高壓梯度系統(tǒng)。

低壓梯度系統(tǒng)通過控制比例閥的開閉時(shí)間，而高壓梯度系統(tǒng)通過控制泵的流量實(shí)現(xiàn)梯度洗脫[3]。

本文測試均為高壓梯度系統(tǒng)。

1）測試依據(jù)：JJG 705-2014液相色譜儀檢定規(guī)程。

2）環(huán)境條件：環(huán)境溫度18℃～30℃，環(huán)境濕度≤75%。

3）流動(dòng)相：A泵流動(dòng)相為純水，B泵流動(dòng)相為0.4%丙酮。

3 梯度準(zhǔn)確度和精密度測試

3.1 操作步驟

◆ 按圖1流程連接高精度超高壓液相泵、UV檢測器、SCG工作站及管路后通電。

◆ 打開SCG工作站。

◆ A泵流動(dòng)相為純水，B泵流動(dòng)相為0.4%丙酮溶液。

◆ 將出液口連接至UV檢測器檢測池。

◆ 分別運(yùn)行A、B泵，待出液口有液體流出且管路內(nèi)無氣泡時(shí)停止運(yùn)行。

圖2 梯度方法曲線示意圖Fig.2 Schematic diagram of gradient method curve

◆ 用A泵流動(dòng)相沖洗管路并預(yù)熱檢測器，待基線平穩(wěn)后進(jìn)行梯度曲線測試。

◆ 將UV檢測器波長設(shè)置為254nm，流速為1mL/min，運(yùn)行方法得到梯度曲線，重復(fù)5次。方法曲線示意圖如圖2所示。

◆ 測量V1-V7的UV吸光度值并記錄，根據(jù)式（1）、式（2）和式（3）可計(jì)算出梯度準(zhǔn)確度Gs。

◆ 測量V1-V7的UV吸光度值并記錄，根據(jù)式（2）和式（4）可計(jì)算出梯度精度RSD。

◆ 記錄梯度方法的紫外吸收曲線圖譜。

◆ 使用賽譜儀器進(jìn)口泵SCG030進(jìn)行對比測試。

每次梯度測試完成，先計(jì)算對應(yīng)的實(shí)際值，公式如下:

表1 梯度精度測試結(jié)果的對比表Table 1 Comparison table of gradient accuracy test results

式（1）中：

Li——某一梯度每次測量的實(shí)際值（%）。

Vi——某一梯度每次測量的UV吸光度值（mAu）。

VA——A流動(dòng)相100%時(shí)，UV吸光度值（mAu）。

VB——B流動(dòng)相100%時(shí)，UV吸光度值（mAu）。

接著，計(jì)算對應(yīng)的梯度誤差，公式如下：

式（2）中：

Ls——某一梯度設(shè)定值（%）。

Ti——某一梯度每次測量的偏差值（%）。

然后，計(jì)算n次梯度測試的梯度準(zhǔn)確度，計(jì)算公式如下：

式（3）中：

Gs——某一梯度5次測量偏差值的算術(shù)平均值（%）。

最后，計(jì)算n次梯度測試的梯度精度RSD，計(jì)算公式如下：

3.2 測試結(jié)果

按照上述步驟對高精度超高壓液相泵和賽譜儀器進(jìn)口泵進(jìn)行對比測試，結(jié)果數(shù)據(jù)如表1所示。

4 梯度滯后體積測試

梯度滯后體積是指從溶劑配比完成點(diǎn)到色譜柱頭的系統(tǒng)體積，也可稱為延緩體積，相當(dāng)于在梯度運(yùn)行之前運(yùn)行一段等度條件[2]。

實(shí)際觀測到的梯度洗脫則是向后平移了一段時(shí)間，稱為梯度系統(tǒng)的滯后時(shí)間，如圖4(a)所示。在梯度洗脫開始與結(jié)束處的輪廓線理論上應(yīng)為直線，但實(shí)際上由于梯度系統(tǒng)中的滯后體積導(dǎo)致系統(tǒng)內(nèi)擴(kuò)散，直線則變成了圓滑的線，這就使梯度洗脫的線性變差如圖4(b)所示[1]。

圖3 高壓梯度系統(tǒng)中的滯后體積Fig.3 Hysteresis volume in a high pressure gradient system

圖4 線性梯度輪廓Fig.4 Linear gradient profile

傳統(tǒng)HPLC系統(tǒng)滯后體積一般在0.5mL～5mL范圍內(nèi)，通常采用4.6mm內(nèi)徑，150mm或更長的色譜柱，分析時(shí)間10min～20min之間或更長時(shí)間，滯后體積影響并不顯著。但是隨柱長變短，內(nèi)徑變細(xì)，較大的滯后體積可能會(huì)引起保留時(shí)間明顯增加，色譜分離情況發(fā)生變化。因此，應(yīng)選滯后體積小的液相色譜儀，以適應(yīng)梯度試驗(yàn)。高壓梯度系統(tǒng)中滯后體積如圖3所示[2]。

4.1 操作步驟

◆ 按圖1的流程連接進(jìn)高精度超高壓液相泵、UV檢測器、SCG工作站及管路后通電。

◆ 打開SCG工作站。

◆ A泵流動(dòng)相為純水，B泵流動(dòng)相為0.4%丙酮溶液。

◆ 將出液口連接至UV檢測器檢測池。

◆ 分別運(yùn)行A、B泵，待出液口有液體流出且管路內(nèi)無氣泡時(shí)，停止運(yùn)行。

◆ 用A泵流動(dòng)相沖洗管路并預(yù)熱檢測器，待基線平穩(wěn)后進(jìn)行梯度曲線測試。

◆ 將UV檢測器波長設(shè)置為254nm，流速為1mL/min，運(yùn)行方法得到梯度曲線，重復(fù)5次。方法曲線示意圖如圖2所示。

圖5 梯度滯后時(shí)間參考值測量方法圖Fig.5 Gradient lag time reference value measurement method diagram

◆ 確保每個(gè)梯度比例運(yùn)行至紫外吸收曲線平穩(wěn)后，通過SCG軟件測量V3-V4的UV吸光度開始變化至V4基線平穩(wěn)所需的時(shí)間，如圖5所示。V4-V5，V5-V6，V6-V7用相同方法測得，并計(jì)算其平均值作為梯度滯后時(shí)間對比的參考值，并記錄測試結(jié)果。

◆ 使用賽譜儀器進(jìn)口泵SCG030進(jìn)行對比測試。

4.2 測試結(jié)果

見表2。

表2 梯度精度測試結(jié)果的對比表Table2 Comparison table of gradient accuracy test results

5 結(jié)論

通過將國產(chǎn)高精度超高壓液相泵與賽譜儀器紫外檢測器組成的液相色譜系統(tǒng)進(jìn)行梯度性能測試，并且與賽譜儀器原有的由進(jìn)口液相泵組成的蛋白純化系統(tǒng)進(jìn)行對比，從試驗(yàn)結(jié)果可以得出：該國產(chǎn)高精度超高壓液相泵在梯度準(zhǔn)確度和梯度精密度兩項(xiàng)指標(biāo)上的表現(xiàn)均略優(yōu)于賽譜儀器有限公司使用的進(jìn)口液相泵SCG030；而從梯度的滯后時(shí)間（梯度滯后體積）參考值的測試結(jié)果表可得出：該國產(chǎn)高精度超高壓液相泵的梯度滯后表現(xiàn)明顯優(yōu)于賽譜儀器使用的進(jìn)口液相泵SCG030，其具有更好的梯度洗脫線性，且更適合用于細(xì)內(nèi)徑色譜柱的應(yīng)用。