周貽兵，蘭優(yōu)，李磊，吳玉田，郭華

（貴州省疾病預(yù)防控制中心，貴州貴陽550004）

番茄是重要的蔬菜作物之一，在其種植、儲藏過程中易受多種病原真菌的危害，特別是易受鏈格孢霉屬真菌的侵害[1]，可產(chǎn)生70 多種有毒代謝產(chǎn)物，統(tǒng)稱為鏈格孢霉毒素[2-3]，其中主要有鏈格孢酚（alternariol，AOH）、交鏈格孢酚單甲醚（alternariol monomethyl ether，AME）、騰毒素（tentoxin，TEN）以及細(xì)交鏈格孢菌酮酸（tenuazonic acid，TeA）。鏈格孢霉毒素具有細(xì)胞毒性[4]、基因毒性以及急性毒性[5]，會對人體健康產(chǎn)生危害。因此，為了解番茄中鏈格孢霉毒素的污染狀況，本試驗對番茄中鏈格孢霉毒素進行檢測，這對控制番茄及其制品的質(zhì)量安全，維護人類健康具有重要的意義。

目前，我國尚未頒布食品中鏈格孢霉毒素的限量和檢測方法標(biāo)準(zhǔn)，相關(guān)文獻報道的鏈格孢霉毒素的檢測方法主要有薄層色譜法[6]、液相色譜法[7]，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用[8-10]等方法。液相色譜質(zhì)譜法因具有定性準(zhǔn)確、靈敏度高等特點已成為檢測鏈格孢霉毒素的主流方法，但番茄中含有較高的色素等組分，不同樣品前處理方法對鏈格孢霉毒素測定結(jié)果具有較大影響，本文比較了固相萃?。╯olid-phase extraction，SPE）和QuEChERS 兩種不同凈化手段對回收率的影響，對準(zhǔn)確測定番茄中鏈格孢霉毒素含量具有一定的參考意義。

1 材料與方法

1.1 主要儀器

U3000 超高效液相色譜、TSQ Quantum Ultra 三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：Thermo Fisher 公司；3-18K 臺式高速冷凍離心機：Sigma 公司；Milli-Q 超純水機：Millipore；MS3 渦旋混均儀：德國 IKA；KQ55-DE 型數(shù)控超聲波清洗機：昆山市超聲儀器有限公司。

1.2 標(biāo)準(zhǔn)品及耗材

1 mg/瓶 AOH、AME、TeA，0.5 mg/瓶 TEN 標(biāo)準(zhǔn)品：普瑞邦生物科技有限公司。將鏈格孢霉毒素標(biāo)準(zhǔn)品配制成濃度為100 μg/mL 的標(biāo)準(zhǔn)儲備液，-20 ℃冰箱保存，備用。

甲醇、乙腈（色譜純）、PEP 固相萃取柱（200 mg/6cc）：美國Thermo 公司；甲酸：純度99 %，阿拉丁試劑（上海）有限公司；碳酸氫銨、氯化鈉、無水硫酸鎂、磷酸二氫鈉：優(yōu)級純，上海國藥集團化學(xué)試劑有限公司；C18吸附劑：粒徑40 μm，上海安普實驗科技股份有限公司；實驗用水為一級水；24 份番茄樣品：貴陽市的超市或農(nóng)貿(mào)市場。

1.3 樣品前處理

SPE 凈化法[11]：稱取5.0 g 勻漿的番茄樣品于50 mL聚丙烯刻度離心管中，加入25 mL 乙腈-甲醇-0.05 mol/L磷酸二氫鈉溶液（pH=3.0）（體積比 45 ∶10 ∶45）渦旋混勻，超聲提取 30 min，10 000 r/min 離心 5 min，轉(zhuǎn)移上清液，用水定容至30 mL，混勻。準(zhǔn)確移取6.0 mL 提取液，加入 15 mL 0.05 mol/L 磷酸二氫鈉溶液（pH=3.0），混勻，PEP 柱凈化，用5 mL 甲醇和5 mL 乙腈洗脫，抽干柱子，合并洗脫液，45 ℃水浴氮吹近干，用2 mL 乙腈-1 mmol/L 碳酸氫銨水溶液（體積比 50 ∶50）溶解，渦旋混勻30 s，10 000 r/min 離心5 min，取上清液在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下進樣分析。

QuEChERS 凈化法[12]：稱取 5.0 g 勻漿的番茄樣品于50 mL 聚丙烯刻度離心管中，加入10 mL 0.4%甲酸-乙腈，渦旋混勻，超聲提取30 min，加入0.5 g 氯化鈉、5 g 無水硫酸鎂，渦旋1 min，10 000 r/min 離心5 min，取 1.5 mL 上層提取液于 QuEChERS（25 mg C18）凈化管中，渦旋1 min，取0.5 mL 凈化液于2 mL 塑料離心管中，加入0.5 mL 1 mmol/L 碳酸氫銨水溶液，搖勻，10 000 r/min 離心5 min，取上清液在優(yōu)化的色譜質(zhì)譜條件下進樣分析。

1.4 儀器工作條件

1.4.1 超高效液相色譜條件

ACQUITY UPLC BEH C18色譜柱（100 mm×2.1 mm×1.7 μm），柱箱溫度：35 ℃，流動相：1 mmol/L 碳酸氫銨溶液-甲醇；流速：0.2 mL/min，進樣體積：10 μL。線性梯度洗脫條件見表1。

表1 梯度洗脫條件Table 1 Gradient elution conditions

1.4.2 質(zhì)譜條件

離子化模式：電噴霧離子源正負(fù)離子切換掃描，，ESI+噴霧電壓：3 800 V，ESI-噴霧電壓：3 200 V，離子源溫度：320 ℃，脫溶劑溫度：300 ℃，鞘氣（N2）壓力：276 kPa，輔助氣（N2）壓力：104 kPa，碰撞氣（Ar）壓力：0.2 Pa，多反應(yīng)監(jiān)測（multi-reactions monitoring ，MRM）參數(shù)見表2。

表2 質(zhì)譜參數(shù)Table 2 The parameters of mass spectrum

2 結(jié)果與討論

2.1 質(zhì)譜及色譜條件的優(yōu)化

分別采用ESI+和ESI-模式下對目標(biāo)物進行全掃描，找出響應(yīng)較大的準(zhǔn)分子離子，改變碰撞能量，進行二級質(zhì)譜掃描，找出2 個信號較強且穩(wěn)定性好的子離子構(gòu)成監(jiān)測離子對，結(jié)果見表2。

TeA、AME、AOH 在ESI-離子模式下響應(yīng)值較高，而ALT 和TEN 在ESI+響應(yīng)較高，所以本試驗采用正負(fù)切換掃描模式測定5 種鏈格孢霉毒素?？疾旒状?0.1%甲酸水溶液、甲醇-0.01%氨水水溶液、甲醇-20 mmol/L醋酸銨、甲醇-1 mmol/L 碳酸氫銨不同流動相條件下5 種鏈格孢霉毒素的分離情況。使用甲醇-0.01%氨水水溶液為流動相，TeA 形態(tài)的改變，在C18色譜柱上無保留，在死時間位置出峰，當(dāng)使用甲醇-0.1%甲酸水溶液為流動相時，TEA 以分子態(tài)形式存在，出峰推遲，峰形拖尾；使用甲醇-20 mmol/L 醋酸銨時，除了TEN 外，其余4 種鏈格孢霉毒素的響應(yīng)值下降；為了使各組分達到基線的完全分離，峰形較好，本文選擇了甲醇-1 mmol/L 碳酸氫銨為流動相，正負(fù)切換掃描模式測定4 種鏈格孢霉毒素，獲得良好的效果，MRM 圖譜見圖1。

圖1 種鏈格孢霉毒素的MRM 圖譜Fig.1 MRM chromatograms for four kinds of alternaria toxins

2.2 提取液的比較

TeA 是一種酸，用酸化提取液有利于提高其提取效率[9]，在SPE 凈化方法時，選擇磷酸二氫鈉溶液（pH=3.0）-甲醇-乙腈溶液提取，而在QuEChERS 方法中由于磷酸二氫鈉是非揮發(fā)性鹽，會結(jié)晶堵塞噴針和離子傳輸管等，因此常選擇揮發(fā)性的酸，所以本文選擇了甲酸酸化的乙腈作為提取液，本試驗將含（0.1 %、0.2 %、0.4%、0.8%、1.6%）甲酸-乙腈溶液為作為提取劑，分別對樣品進行提取，結(jié)果表明：在乙腈中加入0.1%～0.4%的甲酸時，TEA 的回收率升高顯著，回收率大于70%，其余4 種鏈格孢霉毒素的回收率變化不明顯，但甲酸含量過高，基質(zhì)中過多的酸性物質(zhì)進入乙腈層，競爭電離，產(chǎn)生抑制效應(yīng)，回收率反而下降，綜合考慮，選擇0.4%甲酸-乙腈作為提取液，獲得良好的提取效果。

2.3 凈化方法的選擇

番茄樣品提取液中含有色素、糖等共萃組分需采取一定的凈化方法去除干擾，提高鏈格孢霉毒素定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。QuEChERS 方法使用的凈化劑種類繁多，不同的凈化劑去除干擾物質(zhì)的效果各不相同，比較了常使用凈化劑有C18、N-丙基乙二胺（N-propylethane-1，2-diamine，PSA）、石墨化炭黑（graphitizable carbon，GCB）的凈化效果。GCB 主要用于去除樣品提取液中的色素，但對平面結(jié)構(gòu)的物質(zhì)有吸附作用，當(dāng)使用GCB 作為凈化劑時，AOH、AME 幾乎沒有回收；PSA 主要用于吸附樣品中的有機酸等弱酸性成分和糖類，采用 PSA 凈化，TeA 和 AOH 的回收率隨著 PSA 的用量增加而降低，ALT、TEN、AME 變化不顯著；C18對去除脂類和蛋白質(zhì)有較好的效果，TEA 未凈化前，有較強的基質(zhì)抑制效應(yīng)，采用25 mg 的C18凈化后，能有效的消除基質(zhì)效應(yīng)，5 種鏈格孢霉毒素的回收率在80 %～115 %之間，滿足回收率要求，綜合考慮，選擇25 mg C18作為凈化劑。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線、檢出限與定量限

根據(jù)番茄中鏈格孢霉毒素含量水平，將4 種鏈格孢霉毒素用乙腈-1 mmol/L 碳酸氫銨水溶液（體積比50 ∶50） 稀 釋 成 2.5、5.0、10.0、20.0、40.0、60.0、80.0、100、160 ng/mL 標(biāo)準(zhǔn)系列，在優(yōu)化的儀器工作條件下進行分析，以待測目標(biāo)物的質(zhì)量濃度（x）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，以S/N=3 計算方法的檢出限，以S/N=10 計算方法的定量，結(jié)果見表3。

4 種鏈格孢霉毒素在2.5 ng/mL～160 ng/mL 濃度范圍內(nèi)，線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)（r2）大于0.994 3，相比而言，由于使用SPE 凈化時，稀釋倍數(shù)低，檢出限和定量限相對于QuEChERS 法要靈敏。

表3 番茄醬中4 種鏈格孢霉毒素的線性方程、相關(guān)系數(shù)（r2）、檢出限及定量限Table 3 Regression equations，correlation coefficients（r2），detection limits（LOD）and quantification limits（LOQ）of the four alternaria toxins in tomato

2.5 方法的準(zhǔn)確度和精密度

在 5.0 g 番茄空白樣品中加入 10、200、360 μg/kg標(biāo)準(zhǔn)溶液，折算最終儀器的測定濃度，分別位于標(biāo)準(zhǔn)曲線的彽、中、高，每個添加濃度水平測定6 份平行樣，方法的加標(biāo)回收率及精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差結(jié)果見表4。

番茄樣品提取液中含有色素、糖等共萃組分需采取一定的凈化方法去除干擾，提高鏈格孢霉毒素定量結(jié)果的準(zhǔn)確性。將傳統(tǒng)的SPE 法與QuEChERS 方法進行了比較，從表4 可以看出，SPE 的回收率在21 %～69 %，相對標(biāo)準(zhǔn)偏差值為1.3%～7.3%，交鏈孢酚單甲醚回收率最高，約69%，交鏈孢酚回收率最低，低、中、高平均回收率22.7%，凈化過程中損失嚴(yán)重，而采用QuEChERS 方法的平均回收率在81%～115%，精密度相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在2.1 %～11.2 %，回收率遠(yuǎn)高于SPE法，且QuEChERS 方法與SPE 凈化法操作簡便快速。

表4 方法的加標(biāo)回收率及精密度（n=6）Table 4 Recoveries and precisions for the method（n=6）

2.6 樣品的檢測

應(yīng)用QuCHERS 方法對24 份不同霉變程度的番茄樣品中4 種鏈格孢霉毒素含量進行了測定，TeA、AOH、AME含量分別在 16.4 μg/kg～132.6 μg/kg、6.13 μg/kg～23.8 μg/kg、6.26 μg/kg～14.6 μg/kg 之間；有 1 份樣品檢出TEN，含量為4.21 μg/kg，且霉變部分的鏈格孢霉毒素遠(yuǎn)高于未霉變部分的含量，但未霉變部分仍受到鏈格孢霉毒素的污染，所以當(dāng)番茄霉變后，去除霉變部分食用仍有一定程度的潛在風(fēng)險，圖2 為陽性樣品的TIC 圖譜。

圖2 陽性樣品的TIC 圖譜Fig.2 TIC chromatograms of positive samples

3 結(jié)論

本文將不同凈化方法SPE 和QuEChERS 測定番茄中鏈格孢霉毒素方法進行了比較，采用SPE 法的理論檢出限、定量相對于QuEChERS 方法更靈敏，但SPE 固相萃取凈化的回收率在21 %～69 %，遠(yuǎn)低于QuEChERS 方法的平均回收率在 81 %～115 %，且QuEChERS 方法操作簡便，避免固相萃取柱活化、上樣、洗脫、氮吹等步驟，簡便快捷，避免SPE 過柱過程中堵柱，更適用于番茄中鏈格孢霉毒素含量的測定。